Name: Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Lernen Sie die einseitige Augenentfernung bei lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums des visuellen Systems. Diese Methode ermöglicht den direkten Vergleich innervierter und denervierter Tectum-Lappen im selben Tier.

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Die Finanzierung dieser Arbeit wurde in erster Linie durch Startkapital vom Reed College an KLC, Helen Stafford Research Fellowship-Mittel an OLH und ein Reed College Science Research Fellowship an YK unterstützt. Dieses Projekt begann im Labor von Steve Wilson als Zusammenarbeit mit HR, die von einer Wellcome Trust Studentship (2009-2014) unterstützt wurde. Wir danken Máté Varga, Steve Wilson und anderen Mitgliedern des Wilson-Labors für die ersten Diskussionen über dieses Projekt, und wir danken insbesondere Florencia Cavodeassi und Kate Edwards, die als erste KLC beigebracht haben, wie man Embryonen in Agarose besteigt und Zebrafisch-Hirndissektionen durchführt. Wir danken auch Greta Glover und Jay Ewing für die Hilfe bei der Montage unseres Wolfram-Nadelschärfgeräts.

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die in diesem Artikel beschriebenen Techniken veranschaulichen einen von vielen Ansätzen zur Untersuchung der visuellen Systementwicklung von Wirbeltieren bei Zebrafischen. Andere Forscher haben Methoden veröffentlicht, um die embryonale Netzhaut zu sezieren und Genexpressionsanalysendurchzuführen 19 oder neuronale Aktivität im optischen Tectum30 zu visualisieren. Dieses Papier bietet einen Ansatz, um zu untersuchen, wie differentieller Netzhauteintrag das Zellverhalten im ...

Ziel dieser Methode ist es zu untersuchen, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des optischen Tektums, des visuellen Verarbeitungszentrums im Zebrafischgehirn, beeinflusst. Durch Entfernen eines Auges und anschließenden Vergleich der beiden Seiten des optischen Tektums können tektale Veränderungen innerhalb derselben Probe beobachtet und normalisiert werden, was einen Vergleich zwischen mehreren Proben ermöglicht. Moderne molekulare Ansätze in Kombination mit dieser Technik werden Einblicke in die Mechanismen liefern, die dem Wachstum und der Entwicklung des visuellen Systems sowie der axonalen Degeneration und Regeneration zugrunde liegen.
Sensorische Systeme - visuelle, auditive und somatosensorische - sammeln Informationen von externen Organen und leiten diese Informationen an das zentrale Nervensystem weiter, wodurch "Karten" der äußeren Welt im Mittelhirn erzeugtwerden 1,2. Das Sehen ist die dominierende sensorische Modalität für fast alle Wirbeltiere, einschließlich vieler Fische. Die Netzhaut, das Nervengewebe im Auge, sammelt Informationen mit einem neuronalen Schaltkreis, der hauptsächlich aus Photorezeptoren, bipolaren Zellen und retinalen Ganglienzellen (RGCs), den Projektionsneuronen der Netzhaut, besteht. RGCs haben lange Axone, die ihren Weg über die innere Oberfläche der Netzhaut zum Sehnervenkopf finden, wo sie faszikulieren und gemeinsam durch das Gehirn wandern und schließlich im visuellen Verarbeitungszentrum im dorsalen Mittelhirn enden. Diese Struktur wird bei Fischen und anderen Nicht-Säugetierwirbeltieren als optisches Tectum bezeichnet und ist homolog zum Colliculus superior bei Säugetieren3.
Das optische Tectum ist eine bilateral symmetrische Mehrschichtstruktur im dorsalen Mittelhirn. Bei Zebrafischen und den meisten anderen Fischen erhält jeder Lappen des optischen Tektums visuelleEingaben ausschließlich vom kontralateralen Auge, so dass der linke Sehnerv im rechten Tektallappen und der rechte Sehnerv im linken Tektallappen 4 endet (Abbildung 1). Wie sein Gegenstück bei Säugetieren, der Colliculus superior, integriert das optische Tectum visuelle Informationen mit anderen sensorischen Eingaben, einschließlich Vorsprechen und Somatosensation, und steuert Verschiebungen der visuellen Aufmerksamkeit und Augenbewegungen wie Sakkaden 1,5,6. Im Gegensatz zum Colliculus superior des Säugetiers erzeugt das optische Tectum jedoch kontinuierlich neue Neuronen und Glia aus einer spezialisierten Stammzellnische in der Nähe der medialen und kaudalen Ränder der tektalen Lappen, der sogenannten tektalen Proliferationszone7. Die Aufrechterhaltung proliferativer Vorläufer im optischen Tectum und anderen Regionen des zentralen Nervensystems trägt zum Teil zu der bemerkenswerten Regenerationsfähigkeit bei, die in Zebrafisch8 dokumentiert ist.
Frühere Arbeiten, die das Gehirn von blinden oder einäugigen Fischen untersuchten, ergaben, dass die Größe des optischen Tektums direkt proportional zur Menge der retinalen Innervation ist, die sie erhält 9,10,11. Bei erwachsenen Höhlenfischen, deren Augen in der frühen Embryogenese degenerieren, ist das optische Tectum merklich kleiner als bei eng verwandten, gesichteten Oberflächenfischen9. Die Degeneration der Höhlenfischaugen kann blockiert werden, indem die endogene Linse während der Embryogenese durch eine Linse von einem Oberflächenfisch ersetzt wird. Wenn diese einäugigen Höhlenfische bis ins Erwachsenenalter aufgezogen werden, enthält der innervierte Tektallappen etwa 10% mehr Zellen als der nicht innervierte Tektallappen9. In ähnlicher Weise war bei Larvenkillifischen, die mit chemischen Behandlungen inkubiert wurden, um Augen unterschiedlicher Größe innerhalb desselben Individuums zu erzeugen, die Seite des Tektums mit mehr Innervation größer und enthielt mehr Neuronen10. Beweise aus Experimenten zur Quetschung des Sehnervs an erwachsenen Goldfischen deuten darauf hin, dass die Innervation die Proliferation fördert, wobei die Proliferation der tektalen Zellen abnimmt, wenn die Innervation gestört ist11.
Mehrere neuere Berichte, die diese klassischen Studien bestätigen und erweitern, liefern Daten, die darauf hindeuten, dass die Proliferation als Reaktion auf Innervation zumindest teilweise durch den BDNF-TrkB-Signalweg12,13 moduliert wird. Es bleiben viele offene Fragen zum Wachstum und zur Entwicklung des optischen Tektums, einschließlich der Frage, wie ein sich entwickelndes sensorisches System mit Verletzungen und Axondegeneration fertig wird, welche zellulären und molekularen Signale es ermöglichen, dass der Netzhauteintrag das Wachstum des optischen Tektums reguliert, wann diese Mechanismen aktiv werden und ob die innervationsbedingte Proliferation und Differenzierung es der Netzhaut und ihrem Zielgewebe ermöglicht, Wachstumsraten zu koordinieren und eine genaue retinotopische Kartierung zu gewährleisten. Darüber hinaus gibt es viel größere Fragen zur aktivitätsabhängigen Entwicklung, die durch die Befragung des visuellen Systems des Zebrafisches mit chirurgischen Ansätzen wie dem unten beschriebenen beantwortet werden können.
Um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, durch die neuronale Aktivität, insbesondere durch visuellen Input, das Überleben und die Proliferation von Zellen verändert, vergleicht der beschriebene Ansatz direkt innervierte und denervierte tektale Lappen (Abbildung 1) innerhalb einzelner Zebrafischlarven. Diese Methode ermöglicht die Dokumentation der RGC-Axondegeneration im optischen Tectum und die Bestätigung, dass die Anzahl der mitotischen Zellen mit der Innervation korreliert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63509/63509fig01.jpg"> Abbildung 1: Skizzen von Zebrafischlarven vor und nach einseitiger Augenentfernung . (A) Zeichnung von 5 dpf-Larven unter einem Seziermikroskop. Jede Larve ist in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt eingebettet und seitlich ausgerichtet, bevor eine Wolframnadel mit einer scharfen, hakenförmigen Spitze verwendet wird, um das nach oben gerichtete Auge (in diesem Beispiel linkes Auge) herauszuholen. (B) Zeichnung der dorsalen Ansicht einer 9 dpf Larve, die aus der in A dargestellten Operation resultiert. Nur drei hochschematisierte RGC-Axone aus dem rechten Auge sind defaszikulierend und verbinden sich mit Neuronen im linken tektalen Lappen. Abkürzungen: dpf = Tage nach der Befruchtung; dps = Tage nach der Operation; RGC = retinale Ganglienzellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63509/63509fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Ausrüstung und Zubehör:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zuchtboxen</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Hochvakuumfett</td><td>Sigma oder gleichwertiger Lieferant</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben (125 mL)</td><td>Zur Herstellung von Marc's Modified Ringers (MMR)</td><td></td><td></td> mit Antibiotika für die Inkubation nach der Operation.</tr><tr><td>Feine Pinzette - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Glaspasteur-Pipetten</td><td>DWK Lifescience</td><td>63A53 & 63A53WT</td><td>Zum Pipettieren von Embryonen und Larven.</td></tr><tr><td>Objektträger für die Mikroskopie</td><td>VWR oder gleichwertiger Lieferant</td><td>48311-703</td><td>Standard-Objektträger für Glasmikroskope können bei vielen verschiedenen Laborlieferanten bestellt werden.</td></tr><tr><td>Glaswaren, einschließlich Messflaschen und Messzylinder</td><td></td><td></td><td>Für die Herstellung und Lagerung von Lösungen.</td></tr><tr><td>2-Komponenten-Epoxidharz</td><td>ACE Hardware oder anderer gleichwertiger Lieferant von Gorilla Glue oder gleichwertiger</td><td>0,85 oz Spritze</td><td></td></tr><tr><td>https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793 Mikrozentrifugenröhrchen (1,7 mL)</td><td>VWR oder gleichwertiger Lieferant</td><td>22234-046</td><td></td></tr><tr><td>Vernickelter Stifthalter (17 cm Länge)</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>26018-17</td><td>Zum Halten von Wolframdraht beim Schärfen und Durchführen von Operationen/Dissektionen.</td></tr><tr><td>Teesieb aus Nylonnetz oder gleichwertig</td><td>Ali Express oder gleichwertig</td><td></td><td>Für die Ernte von Zebrafischeiern nach dem Laichen; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html</td></tr><tr><td>Büroklammer</td><td></td><td></td><td>Für Wolframnadel-Schleifvorrichtung.</td></tr><tr><td>Petrischalen 100 mm</td><td>Fischer Scientific oder gleichwertiger Lieferant</td><td>50-190-0267</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen 35 mm</td><td>Fischer Scientific oder gleichwertiger Lieferant</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenpumpe</td><td>SP Bel-Art oder gleichwertig</td><td>F37898-0000</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid (KOH)</td><td>Sigma</td><td>909122</td><td>Für Wolfram-Nadelschärfgerät. Stellen Sie eine 10%ige w/v-Lösung von KOH in der Haube her, indem Sie Pellets zu deionisiertem Wasser hinzufügen.</td></tr><tr><td>Stromversorgung (variable Spannung)</td><td></td><td></td><td>Für Wolframnadelschärfgerät. Jedes Netzteil mit variabler Spannung funktioniert (auch eines, das für die Gelelektrophorese verwendet wird).</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>3097358</td><td></td></tr><tr><td>Wolframdraht (0,125 mm Durchmesser)</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>TGW0515</td><td>Schärfen zum Entfernen von Augen und Sezieren von Larven.</td></tr><tr><td>Heizblock mit variabler Temperatur:</td><td>Das Lab Depot oder ein gleichwertiger Lieferant</td><td>BSH1001 oder BSH1002</td><td>Auf 40-42 Grad eingestellt; C vor Experimenten.</td></tr><tr><td>Weithalsglas mit Deckel (z. B. sauberes Marmeladen- oder Salsa-Glas)</td><td></td><td></td><td>Für Wolframnadel-Schleifgerät.</td></tr><tr><td>Drähte mit Krokodilklemmleitungen</td><td></td><td></td><td>Für Wolframnadel-Schleifvorrichtung.</td></tr><tr><td>Mikroskope: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td></td><td></td><td>Jeder Typ funktioniert, aber ein einstellbares Durchlicht auf einer verspiegelten Basis wird bevorzugt.</td></tr><tr>Es wird empfohlen, ein <td>konfokales Laserscanning-Mikroskop</td><td></td><td></td><td>mit hoher NA und einer 20-25-fachen Wassertauchobjektive zu verwenden. Hier wird eine Mikroskopsteuerungs- und Bilderfassungssoftware (NIS-Elements von Nikon) verwendet, aber jedes konfokale Mikroskop funktioniert.</td></tr><tr><td>Reagenzien für Operationen und Dissektionen: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>für Marc's Modified Ringers (MMR) und Embryomedium (E3).</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td>für Marc's Modified Ringer (MMR).</td></tr><tr><td>Niedriger Schmelzpunkt</td><td>Agarose Invitrogen</td><td>16520-050</td><td>Ergibt 1% in Embryomedium (E3) oder Marc's Modified Ringers (MMR).</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma</td><td>1374248</td><td>Für Embryomedium (E3).</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>für Marc's Modified Ringer (MMR).</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td>Verdünnen Sie 8 % (w/v) Stamm mit 2x konzentriertem PBS (verdünnt aus 10x PBS Stoff).</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333-20ML</td><td>verdünnt 1:100 in Marc's modifizierten Ringern.</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Tabletten</td><td>Diagnostisch BioSystems</td><td>DMR E404-01</td><td>10x brühig in entionisiertem Wasser herstellen, autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern. Auf die 1-fache Arbeitskonzentration verdünnen.</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td>für Marc's Modified Ringers (MMR) und Embryomedium (E3).</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>für Marc's Modified Ringers (MMR) und Embryomedium (E3).</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>Machen Sie 10 M und verwenden Sie es, um den pH-Wert der MMR auf 7,4 einzustellen.</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tricain-S</td><td>Pentair</td><td>100G #TRS1</td><td>Rezept: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE</td></tr><tr><td>Reagenzien für die Immunhistochemie:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 568 getaggt Sekundärer Antikörper zum Nachweis von Kaninchen-IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td><td>Verwendung bei 1:500 Verdünnung für Wholemount Immunhistochemie.</td></tr><tr><td>DAPI oder ToPro3</td><td>Invitrogen</td><td>1306 oder T3605</td><td>Stellen Sie 1 mg/ml-Lösungen in DMSO auf, Verdünnung im Verhältnis 1:5.000 für die Gegenfärbung.</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Ein Bestandteil des Immunblockpuffers.</td></tr><tr><td>Methanol (MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>Das Mischen von MeOH mit wässrigen Lösungen wie PBST ist exotherm. Stellen Sie die MeOH/PBST-Lösungen mindestens einige Stunden im Voraus her oder kühlen Sie sie vor der Verwendung auf Eis ab.</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-062Z</td><td>Ein Bestandteil des Immunblock-Puffers. Kann in Volumina von 1-10 ml aliquotiert und bei -20 °C gelagert werden.</td></tr><tr><td>Primärer Antikörper zum Nachweis von Phosphohiston: H3</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Verwendung in einer Verdünnung von 1:300 für die Immunhistochemie des gesamten Virus.</td></tr><tr><td>Primärer Antikörper zum Nachweis des rot fluoreszierenden Proteins (RFP; zum Nachweis von dsRed-Derivaten)</td><td>MBL International</td><td>PM005</td><td>Verwendung in einer Verdünnung von 1:500 für die Immunhistochemie des gesamten Antigens.</td></tr><tr><td>Proteinase K (PK)</td><td>Sigma</td><td>P2308-10MG</td><td>10 mg/ml Stammlösungen in PBS herstellen und bei 10 & Mikro verwenden; g/ml.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Nützlich, um eine 20% (v/v) Stammlösung in PBS herzustellen.</td></tr><tr><td>Software für die Datenanalyse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (Fiji)</td><td></td><td></td><td>Freeware für die Bildanalyse; https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>Freeware für statistische Analysen und Datenvisualisierung; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr> <tr><td>Adobe Photoshop oder GIMP</td><td></td><td></td><td>Proprietäre Bildbearbeitungssoftware (Adobe Photoshop und Illustrator) werden häufig verwendet, um Figuren zu komponieren. Eine Freeware-Alternative ist Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)</td></tr><tr><td>Zebrafish strains. In dieser Studie wurden die Stämme AB, TU, Tg[atoh7:RFP] verwendet.</td><td></td><td></td><td>Erhältlich bei der&nbsp; Zebrafish International Resource Centers in den USA (https://zebrafish.org/home/guide.php) oder in Europa (https://www.ezrc.kit.edu/). Spezialisierte transgene Stämme, die noch nicht in einem der beiden Ressourcenzentren hinterlegt wurden, können nach der Veröffentlichung bei den einzelnen Laboren angefordert werden.</td></tr></tbody></table>

augenentfernung in lebenden zebrafischlarven zur untersuchung des innervationsabhängigen wachstums und der entwicklung des visuellen systems

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafische weisen ein bemerkenswertes lebenslanges Wachstum und regenerative Fähigkeiten auf. Zum Beispiel unterstützen spezialisierte Stammzellnischen, die während der Embryogenese etabliert wurden, das kontinuierliche Wachstum des gesamten visuellen Systems, sowohl im Auge als auch im Gehirn. Koordiniertes Wachstum zwischen der Netzhaut und dem optischen Tectum gewährleistet eine genaue retinotopische Kartierung, wenn neue Neuronen in den Augen und im Gehirn hinzugefügt werden. Um zu untersuchen, ob retinale Axone entscheidende Informationen für die Regulierung des Verhaltens von tektalen Stamm- und Vorläuferzellen wie Überleben, Proliferation und / oder Differenzierung liefern, ist es notwendig, innervierte und denervierte tektale Lappen innerhalb desselben Tieres und zwischen Tieren vergleichen zu können. 
Die chirurgische Entfernung eines Auges aus lebenden Larvenzebrafischen mit anschließender Beobachtung des optischen Tectums erreicht dieses Ziel. Das begleitende Video zeigt, wie man Larven betäubt, Wolframnadeln elektrolytisch schärft und damit ein Auge entfernt. Als nächstes wird gezeigt, wie man Gehirne aus festsitzenden Zebrafischlarven seziert. Schließlich bietet das Video einen Überblick über das Protokoll für die Immunhistochemie und eine Demonstration, wie gefärbte Embryonen in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt für die Mikroskopie gemountet werden können.

Um zu bestätigen, ob die Augenentfernung abgeschlossen war und um zu beurteilen, wie sich das optische Tectum verändert, wurden Operationen im Tg[atoh7:RFP]-Stamm durchgeführt, der alle RGCs mit einem membrangerichteten RFP und damit alle Axone markiert, die aus der Netzhaut ragen und den Sehnerv24 bilden. Obwohl die Verwendung dieser Belastung nicht unbedingt erforderlich ist, ermöglicht sie eine einfache Beobachtung und Visualisierung der Sehnerventermini im optischen Tectum neuropil. A...

Der Artikel erklärt, wie man Augen von lebenden Zebrafischlarven chirurgisch entfernt, als ersten Schritt zur Untersuchung, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des optischen Tektums beeinflusst. Darüber hinaus enthält der Artikel Informationen über Larvenanästhesie, Fixierung und Hirndissektion, gefolgt von Immunhistochemie und konfokaler Bildgebung.

Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Mein Labor ist also daran interessiert zu verstehen, wie Auge und Gehirn zusammenwachsen. Diese Technik ermöglicht es uns zu untersuchen, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des Gehirns beeinflusst. Die chirurgische Entfernung eines Auges aus dem lebenden Larvenzebrafisch, gefolgt von der Beobachtung des optischen Tektums, ermöglicht es uns, innervierte und denervierte tektale Lappen innerhalb desselben Tieres und zwischen Tieren zu vergleichen.Die Kombination dieser Technik mit modernen molekularen Ansätzen kann neue Einblicke in die Mechanismen geben, die der neuronalen Entwicklung, Regeneration und Degeneration zugrunde liegen. Schließen Sie zunächst die Kathoden- und Anodendrähte an die Stromversorgung an. Befestigen Sie die Krokodilklemme am Ende des Kathodendrahtes an einer teilweise begradigten Büroklammer und setzen Sie die Büroklammer in die Kaliumhydroxidlösung ein und befestigen Sie sie an der Seite des Glases.Befestigen Sie den Krokodilklemme des Anodendrahtes am Hals des Nadelhalters. Drehen Sie die Leistung auf ungefähr 20 Volt und tauchen Sie den Wolframdraht in die Kaliumhydroxidlösung, wobei Sie den Draht in einem Winkel aus der Lösung ziehen, um den Draht elektrolytisch zu einer feinen Spitze zu schärfen. Überprüfen Sie die Nadelspitze unter dem Seziermikroskop, um sicherzustellen, dass sie scharf genug ist.Die gekrümmte Nadelspitze entsteht, wenn die scharfe Nadel durch sanftes Berühren der Petrischale gebogen wird. Verwenden Sie am Tag der Operation eine Weidepipette mit breiter Bohrung, um 10 bis 15 Larven auf eine 35-Millimeter-Petrischale zu übertragen, die mit frischem E3 gefüllt ist. Fügen Sie der Larve drei bis fünf Tropfen Anästhetikum hinzu. Um festzustellen, ob die Larven ausreichend betäubt sind, achten Sie auf mangelnde Berührungsreaktion.Fügen Sie zwei bis drei weitere Tropfen des Anästhetikums hinzu, wenn die Larven nach drei Minuten immer noch auf Berührungen reagieren, und bewerten Sie sie neu. Um die Larve für die Operation zu immobilisieren, nehmen Sie eine Larve mit nur einer geringen Menge E3 in eine schmale Glasweidepipette. Als nächstes nehmen Sie etwa 200 Mikroliter geschmolzenen 1% niedrigen Schmelzpunkt oder LMP-Agarose in die Pipette auf, die die Larve enthält, und mischen Sie, um sicherzustellen, dass die Larve in der LMP-Agarose suspendiert ist. Legen Sie den Deckel einer 35 Millimeter großen Petrischale mit dem Gesicht nach oben unter das Seziermikroskop, dann spritzen Sie die Larve und die Agarose auf den umgedrehten Petrischalendeckel.Verteilen Sie die Agarose so, dass sich die Larve in der Mitte des Tropfens befindet. Manövrieren Sie die Larve mit einer stumpfen Wolframnadel schnell, aber vorsichtig so, dass sie seitlich ist und ein Auge nach oben zeigt. Warten Sie einige Minuten, bis die Agarose fest geworden ist.Folgen Sie dem Rand der Augenhöhle, verwenden Sie die Spitze einer feinen elektrolytisch geschärften Wolframnadel, um die Haut um das Auge zu stechen. Schieben Sie dann den Rand der Nadel unter dem Auge von der zeitlich-ventralen Seite des Auges. Verwenden Sie kontrollierten Druck, um das Auge aus der Augenhöhle zu lösen.Drücken Sie das Auge dorsal und anterior mit der Seite der Nadel, schneiden Sie schließlich durch den Sehnerv und lassen Sie das Auge los. Alternativ können Sie sehr feine chirurgische Pinzetten verwenden, um das Auge zu entfernen, indem Sie den Sehnerv kneifen und das Auge von medial nach lateral drücken. Nach erfolgreicher Augenentfernung die Agarose mit MMR-Lösung bedecken, jede Larve von der Agarose befreien, indem Sie vorsichtig eine Wolframnadel um ihren Kopf und dann um ihren Körper bürsten, während Sie das Petrischalendeckel mit einer Pinzette stabilisieren.Nach den Operationen legen Sie die Larve bis zum nächsten Tag in MMR-Lösung, die mit Antibiotika ergänzt wird, bringen Sie die Larve dann zu E3 zurück und ziehen Sie sie bis zum Endpunkt des Experiments auf. Nachdem die Larven unheilbar betäubt wurden, fixieren Sie sie mit 4% Paraformaldehyd. Hängen Sie die fixierten Larven in PBS-Tröpfchen auf einer Sealguard-Platte unter einem Seziermikroskop.Sichern Sie sie seitlich, indem Sie zwei Wolframstifte durch das Notochord legen, wobei ein Stift posterior zu dem pigmentierten Bereich passt, der den AGM-Bereich bedeckt, und ein weiterer in Linie mit dem Ende der Dotterverlängerung. Entfernen Sie das Auge mit einer scharfen Wolframnadel und einer feinen Pinzette. Manchmal ist es möglich, die Nadel durch den Kiefer auf die gegenüberliegende Seite zu stechen und das andere Auge zu entfernen.Verwenden Sie die Wolframnadel, um von der Schläfen- zur Bauchseite des Ohres zu kratzen. In der gleichen Aktion in Bewegung, bringen Sie die Nadel posterior zum Kiefer und ziehen Sie vorsichtig vorne, bis das Ohr und der Kiefer entfernt sind. Entfernen Sie das andere Auge und Ohr, indem Sie die Nadel durch den Kiefer stechen.Verwenden Sie eine Pinzette, um die ventralen Organe und das verbleibende Eigelb herauszuziehen. Machen Sie schließlich einen flachen Schnitt in der dorsalen Schädelhaut in der Nähe der Verbindung zwischen dem Hinterhirn und dem Rückenmark. Heben Sie die Haut mit der Pinzette an und ziehen Sie sie anterior und um das Telencephalon herum.Entfernen Sie das restliche Gewebe mit einer Pinzette. Lösen Sie die Larve und übertragen Sie sie auf PBS in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Sichern Sie einen Kammerschlitten in den Deckel einer 100 Millimeter Petrischale mit Vakuumfett.Übertragen Sie die immungefärbte und verarbeitete Larve auf eine Brunnenplatte oder einen Vertiefungsobjektträger, um sie mit einem Seziermikroskop zu betrachten. Montieren Sie die Larve auf der Kammerrutsche in 1%LMP Agarosesäulen. Legen Sie mit einem Glas an Ihrer Pipette vorbei eine Larve auf die Kammerfolie und deponieren Sie so wenig PBS wie möglich.Bedecken Sie die Larve mit geschmolzener und warmer 1% LMP-Agarose mit derselben Pipette. Pipette die LMP Agarose in eine Säule und positioniert die Larve dann möglichst symmetrisch mit sichtbarer Rückenoberfläche. Nach der Entfernung der Augen wurde eine fortschreitende Degeneration der retinalen Axone im optischen Tectum neuropil beobachtet.Zwei Tage nach der Operation zeigten RFP-markierte Axone Merkmale einer schnellen Wallerschen Degeneration, wie Blabbing und Fragmentierung. RFP-positive Puncta wurden sowohl innerhalb als auch außerhalb des Neuropils auf der rechten Seite des Tektums festgestellt, wie durch die Pfeile angezeigt. Vier Tage nach der Operation waren fragmentierte Axone und RFP-markierte axonale Ablagerungen im rechten tektalen Lappen erheblich reduziert, was auf eine relativ schnelle Clearance der sterbenden und degenerierenden Axone hinweist.Das Gehirn wurde durch Sezieren der Augen, des Kiefers, der Ohren und der Schädeldecke der Haut und des Bindegewebes freigelegt. Im Idealfall bleibt das Gehirn während dieses Eingriffs intakt. Teile des Vorderhirns, insbesondere der Riechkolben, wurden jedoch wahrscheinlich beschädigt oder vollständig entfernt, wenn die Schädeldecke der Haut oder des Kiefers entfernt wurde.Darüber hinaus wird manchmal der seitliche Vorsprung des Tektums geschnitten, wenn die Haut durchbohrt oder eingeklemmt wird, um sie vom Gehirn zu ziehen. Keine zwei Proben sind identisch. Sie müssen also in der Lage sein, subtile Anpassungen durch die Entfernung von Augen und die Dissektion des Gehirns nach Bedarf vorzunehmen.Patienten und scharfe Werkzeuge sind für den Erfolg unerlässlich. Diese Technik kann mit zellulären und molekularen Ansätzen wie in vivo Lebendzellbildgebung oder RNA-Sequenzierung fortgesetzt werden, um neue Einblicke in die molekularen und zellulären Mechanismen des optischen Tektumwachstums und der optischen Entwicklung zu gewinnen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

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In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.

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Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ist ein hervorragendes Werkzeug für die Abbildung der Embryonalentwicklung. Es ermöglicht die Aufnahme von langen Zeitrafferfilmen von lebenden Embryonen unter nahezu physiologischen Bedingungen. Wir demonstrieren seine Anwendung für die Bildgebung der Entwicklung von Zebrafischaugen über weite räumliche und zeitliche Skalen und stellen eine Pipeline für die Fusion und Dekonvolution von Multiview-Datensätzen vor.

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Hier präsentieren wir eine Protokoll, die die Messung von Licht evozierten Elektroretinogramm Antworten von Larven Zebrafisch vereinfacht. Eine neuartige kegelförmige Schwamm-Tip Elektrode kann dazu beitragen, das Studium der visuellen Entwicklung im Larvenstadium Zebrafisch mit Elektroretinogramm ERG mit einfacher zuverlässige Ergebnisse und geringere Kosten.

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Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems (Video) | JoVE Journal

Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems

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