Isolierung von primären Mausmikroglia durch magnetisch aktivierte Zellsortierung in Tiermodellen der Demyelinisierung
April 5th, 2022
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung und Reinigung primärer Mikroglia in Tiermodellen demyelinisierender Krankheiten unter Verwendung der säulenförmigen magnetisch aktivierten Zellsortierung.
Dieses Protokoll hilft, Mikroglia von den mikrodissektierten Demyelinisierungsläsionen des erwachsenen Mausgehirns zu isolieren, um die Mikroglia-Eigenschaften in vivo zu untersuchen. Diese Technik spart Zeit und hat geringere Anforderungen sowohl für Experimentatoren als auch für Geräte. Diese Methode hilft, Mikroglia aus dem Gehirn des Tieres zu isolieren, insbesondere aus mikrodissektiertem Gewebe in verschiedenen Krankheitszuständen.
Beginnen Sie mit der Mikrosezierung der Läsionen, die durch neutralen Farbstoff um das Corpus callosum unter einem Stereomikroskop markiert sind. Zentrifugieren Sie das sezierte Gewebe bei 300 mal g für 30 Sekunden, um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln. Enzymmix eins und Enzymmix zwei auf 37 Grad Celsius in einem Inkubator vorheizen.
Dann fügen Sie 1.950 Mikroliter vorgewärmte Enzymmischung eine zu einer Probe hinzu und verdauen Sie sie in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Fügen Sie 30 Mikroliter vorgewärmtes Enzym hinzu, mischen Sie zwei und mischen Sie vorsichtig. Nach der Verdauung vier Milliliter kaltes PBS in die Tube geben und vorsichtig schütteln.
Zentrifugieren Sie die Gewebeproben bei 300 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und saugen Sie den Überstand langsam und vollständig ab. Schwebe das Zellpellet vorsichtig mit 1.550 Mikrolitern kaltem PBS. Fügen Sie 450 Mikroliter der kalten Lösung zur Entfernung von Ablagerungen hinzu und mischen Sie sie gut.
Verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Pipette, um die Mischung sehr langsam und vorsichtig mit zwei Millilitern kaltem PBS zu überlagern. Zentrifugieren Sie die Mischung und suchen Sie dann nach den drei Schichten. Verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Pipette, um die beiden oberen Schichten vollständig abzusaugen, und füllen Sie das Rohr bis zu fünf Milliliter mit Kaltladepuffer.
Drehen Sie die Röhre dreimal vorsichtig um. Als nächstes, nach der Zentrifugation und Aspiration des Überstandes, suspendieren Sie das Zellpellet mit 90 Mikrolitern Ladepuffer und fügen Sie 10 Mikroliter CD11b-Perlen hinzu. Gut mischen und 15 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren.
Nach der Inkubation fügen Sie einen Milliliter des Ladepuffers hinzu und waschen Sie die Zellen, indem Sie die Flüssigkeit vorsichtig mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette auf und ab pipettieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und saugen Sie den Überstand vollständig ab, um die ungebundenen Perlen zu entfernen. Suspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern des Ladepuffers und platzieren Sie die MS-Säule mit ihrem Separator zur positiven Auswahl im Magnetfeld.
Spülen Sie die Säule mit 500 Mikrolitern des Ladepuffers, um die Zellen zu schützen und die Effizienz der magnetischen Sortierung basierend auf dem Protokoll des Herstellers sicherzustellen. Wenden Sie die Zellsuspension auf die MS-Spalte an und verwerfen Sie den Durchfluss, der die nicht markierten Zellen enthält. Fügen Sie 500 Mikroliter des Ladepuffers hinzu, um die Säule zu waschen, und entfernen Sie sie aus dem Separator.
Legen Sie die Säule auf ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie einen Milliliter des Ladepuffers in die Säule ein. Drücken Sie schließlich den Kolben an den Boden der Säule, um die magnetisch markierten Zellen auszuspülen. Eine schematische Darstellung der Gating-Strategie, die in der Durchflusszytometrie-Analyse von Mikroglia verwendet wird, die aus Demyelinisierungsläsionen erwachsener Mäuse vor und nach der magnetisch aktivierten Zellsortierung isoliert wurden, ist hier dargestellt.
Die grafischen Bilder stellen die Vorwärtsstreuhöhe und die Seitenstreuhöhe für die Auswahl von Zellen, die Vorwärtsstreufläche und die Vorwärtsstreuhöhe für die Auswahl einzelner Zellen sowie CD11b-FITC und CD45-APC für die Auswahl der myeloischen Zellen und Mikroglia dar. Der Anteil an Mikroglia hat nach der magnetisch aktivierten Zellsortierung deutlich zugenommen. Das grafische Bild stellt die Gating-Strategie dar, die in der Durchflusszytometrie-Analyse für lebende und tote Einzelzellen nach der magnetisch aktivierten Zellsortierung verwendet wird.
Hier wurden 7-Aminoactinomycin D und die seitliche Streuhöhe verwendet, um die lebenden Zellen auszuwählen. Denken Sie beim Versuch dieses Verfahrens daran, die demyelinisierenden Läsionen unter einem Stereomikroskop basierend auf den neutralen roten Markierungen genau zu sezieren.
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Übersicht
Diese Studie präsentiert ein Protokoll zur Isolierung und Reinigung von primären Mikroglia aus Demyelinisierungsläsionen in adulten Mausgehirnen. Durch die Verwendung von säulenmagnetischer aktivierter Zellsortierung ermöglicht die Methode die Untersuchung von Mikroglia-Eigenschaften in vivo bei gleichzeitiger Optimierung von Zeit- und Ressourcenanforderungen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Neuropathologie
Hintergrund
- Mikroglia spielen eine kritische Rolle bei Neuroinflammation und Erkrankungen des zentralen Nervensystems.
- Das Verständnis ihrer Funktion bei demyelinisierenden Erkrankungen ist wesentlich für das Verständnis von Krankheitsmechanismen.
- Effektive Isolationstechniken sind erforderlich, um Mikroglia zu untersuchen, die durch spezifische pathologische Zustände charakterisiert sind.
- Die vorgestellte Methode konzentriert sich darauf, die Effizienz bei der Isolierung dieser Zellen zu verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines zuverlässigen Protokolls zur Isolierung von Mikroglia aus den Zielgebieten des Gehirns.
- Erleichterung der Untersuchung des Verhaltens von Mikroglia und ihrer Rollen im Kontext demyelinisierender Erkrankungen.
- Optimierung der Ressourcennutzung während des Isolierungsprozesses.
Verwendete Methoden
- Mikrodissektion von Gewebe aus Demyelinisierungsläsionen unter einem Stereomikroskop.
- Nutzung von säulenmagnetischer aktivierter Zellsortierung zur Isolierung von Mikroglia.
- Schritte umfassen Gewebedigestion, Zentrifugation und sanfte Resuspendierung für eine effiziente Zellisolierung.
- Schlüsselschritte beinhalten Enzymvorbereitung, mehrere Zentrifugationssequenzen und sorgfältige Handhabung von Mikroglia-Proben.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll verbessert den Anteil isolierter Mikroglia signifikant.
- Die Durchflusszytometrieanalyse zeigte eine erfolgreiche Sortierung von myeloiden Zellen und die spezifische Identifizierung von Mikroglia.
- Live-Dead Zellfärbung wurde durchgeführt, um die Zelllebensfähigkeit zu beurteilen und eine erfolgreiche Sortierung zu bestätigen.
- Die Methode ermöglicht ein umfassenderes Verständnis der Mikroglia-Reaktionen bei demyelinisierenden Erkrankungen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert eine effektive Methode zur Isolierung von Mikroglia und erleichtert zukünftige Forschung über ihre Rolle bei neurologischen Erkrankungen.
- Die Isolationstechnik trägt zur Erweiterung des Wissens über das Verhalten von Mikroglia in vivo bei und macht sie für verschiedene Krankheitsmodelle anwendbar.
- Dieses Protokoll kann Studien verbessern, die auf therapeutische Interventionen abzielen, die die Mikroglia-Funktion bei neurodegenerativen Erkrankungen ansprechen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of primary microglia from demyelinated mouse brain tissue enables precise investigation of innate immune responses in disease-relevant CNS models. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for neuroinflammatory and demyelinating disease pipelines. High-purity microglial preparations facilitate translational continuity from discovery through preclinical research in neuroimmunology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microglial activation states and phenotypic heterogeneity in disease-relevant CNS tissue.
- Supports functional target validation by preserving molecular characteristics of microglia from pathological lesions.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuroinflammatory targets by isolating primary cells from in vivo models.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary microglia for downstream functional assays and compound screening.
- Improves assay reproducibility and standardization by delivering high-purity, viable cell populations.
- Enables quantitative flow cytometry readouts for cell identity and viability, supporting robust assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker discovery in demyelinating conditions.
- Maintains continuity from in vivo discovery to preclinical validation by preserving microglial molecular profiles.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling direct study of microglial responses in pathological CNS environments.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for neuroinflammatory and demyelinating disease research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial activation and heterogeneity in CNS lesions.
- Screening: Delivers reproducible, high-purity microglia for functional and phenotypic assays.
- Analytics: Enables quantitative flow cytometry analysis of cell identity, viability, and population shifts.
- Translational Research: Preserves disease-relevant molecular features for biomarker and mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for isolating primary CNS immune cells across models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Streamlines cell isolation with lower equipment and expertise requirements.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision quality by enabling direct study of primary microglia from disease models.
- Portfolio Impact: Reduces late-stage biological risk and supports risk-adjusted prioritization in neuroinflammation pipelines.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in microdissection and handling of CNS tissue under a stereomicroscope.
- Needs access to magnetic-activated cell sorting instrumentation and flow cytometry for validation.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and gating strategies for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different CNS regions or disease models to maintain cell purity and viability.
- Careful lesion identification and sample handling are critical to preserve molecular characteristics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Mice Dissection and Tissue Dissociation
1:35
Debris Removal and Magnetic Separation of Microglial Cells
3:26
Results: Gating Strategy Used in Flow Cytometry Analysis Before and After MACS and Gating Strategy for Living/Dead Single Cells After MACS
4:27
Conclusion
