Name: Isolierung von primären Mausmikroglia durch magnetisch aktivierte Zellsortierung in Tiermodellen der Demyelinisierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Lernen Sie die Isolierung primärer Mikroglia aus Demyelinisierungsläsionen adulten Mäusehirns mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mikroglialer Charakteristika in vivo und optimiert Zeit- sowie Ressourcenaufwand.

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Die Studie wurde von der Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06) unterstützt.

Alle Tierverfahren wurden vom Institute of Animal Care Committee des Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China, genehmigt.
1. Materialien
<ol><li>Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor, bevor Sie mit dem Protokoll beginnen.<ol>
<li>Bereiten Sie den Ladepuffer vor, indem Sie fetales Rinderserum (FBS, 2%) zu phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).</li>
		<li>Neutralrot (NR) Farbstoff (letzte 1%) zu PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die folgenden Lösungen mit dem kommerziell erhältlichen Adult Brain Dissociation Kit vor (siehe Materialtabelle).<ol>
<li>Um Enzymmischung 1 herzustellen, pipettieren Sie 1,9 ml Puffer Z und 50 μL Enzym P in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Zur Herstellung von Enzymmix 2 pipettieren Sie 20 μL Puffer Y und 10 μL Enzym A in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Bereiten Sie die Lösung zur Entfernung von Ablagerungen vor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Durchblutung und Dissektion von Mäusen
<ol><li>Intraperitoneal (i.p.) injizieren Sie der Maus 500 μL 1% NR-Farbstoff in PBS 2-3 h vor der Anästhesie. HINWEIS: Die intraperitoneale Injektion von NR in demyelinisierenden Mausmodellen hilft, die Läsionen zu erkennen (Abbildung 1).</li>
	<li>Betäuben Sie die Maus mit Pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) und stellen Sie sicher, dass die Maus erfolgreich betäubt wird, indem Sie die Schmerzreaktionen untersuchen.</li>
	<li>Öffnen Sie die Brusthöhle der Maus und legen Sie das Herz frei.</li>
	<li>Schneiden Sie eine kleine Ecke des rechten Vorhofs vorsichtig ab und durchbluten Sie die Maus intrakardial mit 20-30 ml kaltem PBS aus dem linken Ventrikel.</li>
	<li>Enthaupten Sie die Maus unter Narkose.</li>
	<li>Öffnen Sie den Schädel der Maus und befreien Sie das Gehirn vorsichtig vom Schädel.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gehirn auf die Maus-Gehirnscheibenform und schneiden Sie das Gehirn in 0,1 cm große Scheiben.</li>
	<li>Entfernen Sie die Gehirnscheiben und legen Sie sie in kaltes PBS in eine Petrischale (60/15 mm). Mikrodissektieren Sie die durch NR-Farbstoff markierten Läsionen um das Corpus callosum unter einem Stereomikroskop mit einer mikrochirurgischen Pinzette. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das sezierte Gewebe so vollständig wie möglich ist, um den anschließenden Transfer zu erleichtern. Der gesamte Sezierfortschritt sollte in 2 Stunden abgeschlossen sein.</li>
	<li>Überführen Sie das sezierte Gewebe in 15-ml-Zentrifugenröhrchen, die die entsprechende Menge an Kaltladepuffer enthalten. HINWEIS: Poolen Sie das Corpus callosum-Gewebe von 2-3 Mäusen in einer Röhre als eine Probe.</li>
</ol>3. Gewebedissoziation
<ol><li>Zentrifugieren Sie das sezierte Gewebe bei 300 ×g für 30 s (nach Erreichen dieser Geschwindigkeit), um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln.</li>
	<li>Enzymmix 1 und Enzymmix 2 auf 37 °C in einem Inkubator vorheizen.</li>
	<li>1.950 μL vorgewärmte Enzymmischung 1 in eine Probe geben und in einem Inkubator bei 37 °C für 5 min aufschließen.</li>
	<li>30 μL vorgewärmter Enzymmix 2 hinzufügen und vorsichtig mischen.</li>
	<li>In einem Inkubator bei 37 °C für 15 min verdauen und alle 5 min vorsichtig vermischen.</li>
	<li>Nach der Verdauung 4 ml kaltes PBS in die Tube geben und vorsichtig schütteln.</li>
	<li>Platzieren Sie 70-μm-Filter auf 50-ml-Zentrifugenröhrchen und benetzen Sie die Filter mit 500 μL kaltem PBS. Filtern Sie das dissoziierte Gewebe, indem Sie die verdauten Gewebeproben durch die Filter leiten, und übertragen Sie die gefilterte Suspension im 50-ml-Zentrifugenröhrchen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. HINWEIS: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn die Gewebemenge zu klein ist.</li>
	<li>Die gefilterten Gewebeproben bei 300 ×g zentrifugieren Sie 10 min bei 4 °C und saugen Sie den Überstand langsam und vollständig ab. HINWEIS: Alle Schritte sollten auf Eis durchgeführt werden, mit Ausnahme der enzymatischen Verdauung.</li>
</ol>4. Entfernung von Ablagerungen
<ol><li>Resuspendiert das Zellpellet sanft mit 1.550 μL kaltem PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 450 μL kalte Lösung zur Entfernung von Ablagerungen hinzu und mischen Sie gut.</li>
	<li>Überlagern Sie die obige Mischung sehr langsam und vorsichtig mit 2 x 1 ml kaltem PBS unter Verwendung einer 1.000 μL Pipette. HINWEIS: Kippen Sie das Zentrifugenröhrchen um 45 ° und fügen Sie langsam PBS entlang der Rohrwand mit der Pipette hinzu.</li>
	<li>Das Röhrchen langsam und schonend in eine Zentrifuge geben und bei 4 °C und 3.000 × g für 10 min drehen.</li>
	<li>Suchen Sie nach der Zentrifugation nach drei Schichten. Die beiden oberen Schichten werden mit einer 1.000-μL-Pipette vollständig abgesaugt (Abbildung 2).</li>
	<li>Füllen Sie das Rohr bis zu 5 ml mit kaltem Ladepuffer und drehen Sie das Rohr dreimal vorsichtig um.</li>
	<li>Zentrifuge bei 4 °C und 1.000 × g für 10 min. Saugen Sie den Überstand vollständig ab und vermeiden Sie es, das Zellpellet zu stören.</li>
</ol>5. Magnetische Trennung von Mikrogliazellen
<ol><li>Resuspendiert das Zellpellet mit 90 μL Ladepuffer und fügt 10 μL CD11b (Microglia) -Perlen hinzu.</li>
	<li>Gut mischen und 15 min bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml Ladepuffer hinzu und pipettieren Sie die Flüssigkeit vorsichtig mit einer 1.000 μL Pipette auf und ab, um die Zellen nach der Inkubation zu waschen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 4 °C und 300 × g für 10 min und saugen Sie den Überstand vollständig ab, um die ungebundenen Perlen zu entfernen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μL Ladepuffer.</li>
	<li>Platzieren Sie die MS-Säule mit ihrem Separator zur positiven Selektion im Magnetfeld.</li>
	<li>Spülen Sie die Säule mit 500 μL Ladepuffer, um die Zellen zu schützen und die Effizienz der magnetischen Sortierung basierend auf dem Protokoll des Herstellers sicherzustellen.</li>
	<li>Tragen Sie die Zellsuspension auf die MS-Säule auf und verwerfen Sie den Durchfluss, der nicht markierte Zellen enthält.</li>
	<li>Fügen Sie der Säule dreimal 500 μL Ladepuffer hinzu, um Zellen wegzuspülen, die an der Säulenwand haften, und verwerfen Sie den Durchfluss. HINWEIS: Fügen Sie nur dann einen neuen Ladepuffer zum Waschen hinzu, wenn der Säulenbehälter vollständig leer ist.</li>
	<li>Entfernen Sie die Säule nach dem Waschen der Säule aus dem Separator und legen Sie sie auf ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml Ladepuffer in die Säule hinzu und drücken Sie den Kolben an den Boden der Säule, um die magnetisch markierten Zellen auszuspülen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal, um die magnetisch markierten Zellen vollständig zu sammeln.</li>
</ol>

<ol><li>Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGinhoux%2C+F+%22Science%22">Science</a>. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).</li>
<li>Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchulz%2C+C+%22Science%22">Science</a>. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaolicelli%2C+RC+%22Science%22">Science</a>. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).</li>
<li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Ueno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+V+cortical+neurons+require+microglial+support+for+survival+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).</li>
<li>Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+regulate+the+number+of+neural+precursor+cells+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).</li>
<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+microglial+subset+in+development%2C+aging%2C+and+disease%3A+Lessons+from+transcriptomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 430(2020).</li>
<li>Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+its+role+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Neuroscience+and+Oxidative+Stress%22%5BJournal%5D)">Microglia and its role in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).</li>
<li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fbrain+macrophages+as+central+drivers+of+brain+tumor+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li>
<li>Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+the+brain%3A+Complementary+partners+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).</li>
<li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+dynamics+during+human+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglial dynamics during human brain development.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1014(2018).</li>
<li>Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+primary+microglia%3A+isolation%2C+culturing%2C+and+selected+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).</li>
<li>Yildizhan, K., Naziroglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+depletion+and+parkinsonian+neurotoxin+MPP%28%2B%29-induced+TRPM2+channel+activation+play+central+roles+in+oxidative+cytotoxicity+and+inflammation+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia.</a> Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2019).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li>
<li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> Journal of Immunological Methods. 486, 112834(2020).</li>
<li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li>
<li>Sahel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+synaptic+connectivity+of+oligodendrocyte+precursor+cells+following+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination.</a> Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77(2015).</li>
<li>Schroeter, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+brain-all+cells%3A+A+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+CNS-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 651(2021).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+glial+specific+responses+to+tissue+processing+%26+enzymatic+dissociation+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Holt, L. M., Olsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+applications+of+magnetic+cell+sorting+to+analyze+cell-type+specific+gene+and+protein+expression+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system.</a> PLoS One. 11 (2), 0150290(2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+analysis+reveals+quiescent+microglia+isolation+methods+from+postnatal+mouse+brains+and+limitations+of+BV2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153(2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Das Protokoll schlägt eine Methode zur Isolierung von Mikroglia um die demyelinisierenden Läsionen vor, die helfen kann, die funktionellen Eigenschaften von Mikroglia bei entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen zu untersuchen. Mikroglia, die mit CD11b-Perlen gewonnen wurden, weisen eine hohe Reinheit und Lebensfähigkeit auf. Kritische Schritte im Protokoll sind die genaue Lokalisierung von Herden und die optimale Reinigung von Mikroglia. Im Protokollschritt 2.1 ist es notwendig, die NR-Lösung 2 h zu injizieren, bev...

Mikroglia stammen von Dotter-Sack-Vorläufern, die sehr früh das embryonale Gehirn erreichen und an der Entwicklung des ZNS 1,2 beteiligt sind. Zum Beispiel sind sie am synaptischen Beschneiden3 und der Regulierung des axonalen Wachstumsbeteiligt 4. Sie sezernieren Faktoren, die das neuronale Überleben fördern und die neuronale Lokalisation unterstützen5. Gleichzeitig sind sie an der Entfernung abnormaler Zellen und apoptotischer Zellen beteiligt, um eine normale Gehirnentwicklung zu gewährleisten6. Darüber hinaus überwachen Mikroglia als immunkompetente Zellen des Gehirns kontinuierlich das Gehirnparenchym, um tote Zellen, dysfunktionale Synapsen und Zelltrümmer zu beseitigen7. Es wurde gezeigt, dass die Mikrogliaaktivierung eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von Krankheiten spielt, einschließlich entzündlicher demyelinisierender Erkrankungen, neurodegenerativer Erkrankungen und Hirntumoren. Aktivierte Mikroglia bei Multipler Sklerose (MS) tragen zur Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) und zur Regeneration von Myelin bei, indem sie Myelintrümmer8 verschlingen.
Bei der Alzheimer-Krankheit (AD) aktiviert die Ansammlung von Amyloid-Beta (Aβ) Mikroglia, die die phagozytären und entzündlichen Funktionen der Mikroglia9 beeinflusst. Aktivierte Mikroglia im Gliomgewebe, sogenannte Gliom-assoziierte Mikroglia (GAM), können das Fortschreiten des Glioms regulieren und letztendlich die Prognose der Patientenbeeinflussen 10. Die Aktivierung verändert das Mikroglia-Transkriptom tiefgreifend, was zu morphologischen Veränderungen, der Expression von Immunrezeptoren, erhöhter phagozytischer Aktivität und einer verbesserten Zytokinsekretionführt 11. Es gibt verschiedene Untergruppen von aktivierten Mikroglia bei neurodegenerativen Erkrankungen wie krankheitsassoziierte Mikroglia (DAM), aktivierte Reaktionsmikroglia (ARM) und mikroglialer neurodegenerativer Phänotyp (MGnD)8.
In ähnlicher Weise koexistieren mehrere dynamische funktionelle Untergruppen von Mikroglia auch im Gehirn bei entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen12. Das Verständnis der Heterogenität zwischen verschiedenen Untergruppen von Mikroglia ist unerlässlich, um die Pathogenese entzündlicher demyelinisierender Erkrankungen zu untersuchen und ihre potenziellen therapeutischen Strategien zu finden. Die Heterogenität von Mikroglia hängt hauptsächlich von der molekularen Spezifitätab 8. Es ist wichtig, die molekularen Veränderungen von Mikroglia für die Untersuchung der Heterogenität genau zu beschreiben. Fortschritte in der Einzelzell-RNA-Sequenzierungstechnologie (RNA-seq) haben die Identifizierung der molekularen Eigenschaften aktivierter Mikroglia unter pathologischen Zuständenermöglicht 13. Daher ist die Fähigkeit, Zellpopulationen zu isolieren, entscheidend für die weitere Untersuchung dieser Zielzellen unter bestimmten Bedingungen.
Studien, die durchgeführt wurden, um die Eigenschaften und Funktionen von Mikroglia zu verstehen, sind in der Regel In-vitro-Studien, da festgestellt wurde, dass eine große Anzahl von primären Mikroglia aus Mauswelpengehirnen (1-3 Tage alt) hergestellt und kultiviert werden kann, die an den Kulturkolben haften und auf der Kunststoffoberfläche mit anderen gemischten Gliazellen wachsen. Anschließend können reine Mikroglia basierend auf der unterschiedlichen Haftfähigkeit von gemischten Gliazellenisoliert werden 14,15. Diese Methode kann jedoch nur Mikroglia aus dem perinatalen Gehirn isolieren und dauert mehrere Wochen. Potentielle Variablen in der Zellkultur können Mikroglia-Eigenschaften wie die molekulare Expressionbeeinflussen 16. Darüber hinaus können Mikroglia, die mit diesen Methoden isoliert werden, nur an In-vitro-Experimenten teilnehmen, indem sie die Bedingungen von ZNS-Erkrankungen simulieren, und können die Eigenschaften und Funktionen von Mikroglia in In-vivo-Krankheitszuständen nicht darstellen. Daher ist es notwendig, Methoden zur Isolierung von Mikroglia aus dem erwachsenen Mäusegehirn zu entwickeln.
Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und magnetische Trennung sind zwei weit verbreitete Methoden, obwohl sie ihre eigenen unterschiedlichen Einschränkungen haben16,17,18,19. Ihre jeweiligen Vor- und Nachteile werden im Diskussionsteil gegenübergestellt. Die Reifung der MACS-Technologie bietet die Möglichkeit, Zellen schnell zu reinigen. Huang et al. haben eine bequeme Methode entwickelt, um demyelinisierende Läsionen im Gehirnzu markieren 20. Durch die Kombination dieser beiden technischen Ansätze schlagen wir ein schnelles und effizientes säulenförmiges magnetisches CD11b-Trennprotokoll vor, das eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung zur Isolierung von Mikroglia um demyelinisierende Läsionen in erwachsenen Mäusegehirnen und die Erhaltung der molekularen Eigenschaften von Mikroglia liefert. Die fokalen demyelinisierenden Läsionen wurden durch die stereotaktische Injektion von 2 μL Lysolecithinlösung (1% LPC in 0,9% NaCl) in das Corpus callosum 3 Tage vor Beginn des Protokolls21 verursacht. Dieses Protokoll legt den Grundstein für die Durchführung des nächsten Schritts in In-vitro-Experimenten. Darüber hinaus spart dieses Protokoll Zeit und bleibt für den breiten Einsatz in verschiedenen Experimenten machbar.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>BIOFIL</td><td>CFT001015</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td></td></tr><tr><td>70 & micro; m Filter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Dissoziationsset für das Gehirn bei Erwachsenen, Maus und Ratte</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-107-677</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Mäuse</td><td>SJA Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Mikroglia) Kügelchen, Mensch und Maus</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>BOSTER</td><td>PYG0001</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD Biosciences</td><td>V10</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MS Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1013690025</td><td></td></tr><tr><td>NovoCyte Durchflusszytometer</td><td>Agilent</td><td></td><td>A System bestehend aus aus verschiedenen Teilen</td></tr><tr><td>NovoExpress</td><td>Agilent</td><td>1.4.1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>BOSTER</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-010</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>MshOt</td><td>MZ62</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von primären mausmikroglia durch magnetisch aktivierte zellsortierung in tiermodellen der demyelinisierung

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Mikroglia, die ansässigen angeborenen Immunzellen im Gehirn, sind die primären Reaktionspersonen auf Entzündungen oder Verletzungen im zentralen Nervensystem (ZNS). Mikroglia können in Ruhezustand und aktivierten Zustand unterteilt werden und können ihren Zustand als Reaktion auf die Mikroumgebung des Gehirns schnell ändern. Mikroglia werden unter verschiedenen pathologischen Bedingungen aktiviert und weisen unterschiedliche Phänotypen auf. Darüber hinaus gibt es viele verschiedene Untergruppen aktivierter Mikroglia und eine große Heterogenität zwischen verschiedenen Untergruppen. Die Heterogenität hängt hauptsächlich von der molekularen Spezifität von Mikroglia ab. Studien haben gezeigt, dass Mikroglia aktiviert werden und eine wichtige Rolle im pathologischen Prozess der entzündlichen Demyelinisierung spielen. Um die Eigenschaften von Mikroglia bei entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen wie Multipler Sklerose und Neuromyelitis optica spectrum disorder besser zu verstehen, schlagen wir ein periläsionales primäres Mikroglia-Sortierprotokoll vor. Dieses Protokoll verwendet säulenförmige magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS), um hochgereinigte primäre Mikroglia zu erhalten und die molekularen Eigenschaften von Mikroglia zu erhalten, um die möglichen Auswirkungen von Mikroglia bei entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen zu untersuchen.

Mikroglia, die mit CD11b-Perlen isoliert wurden, haben eine hohe Reinheit Mikrogliazellen um die Läsionen in Demyelinisierungs-Mausmodellen wurden mit dem oben genannten Protokoll isoliert und mittels Durchflusszytometrie getestet. Die Zellen werden fluoreszierend mit CD11b-Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und CD45-Allophycocyanin (APC) markiert, um Mikroglia in der Durchflusszytometrie gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen. Es gibt mehrere Literaturen, die zeigen, dass CD11b- und CD45-Ant...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung und Reinigung primärer Mikroglia in Tiermodellen demyelinisierender Krankheiten unter Verwendung der säulenförmigen magnetisch aktivierten Zellsortierung.

Isolierung von primären Mausmikroglia durch magnetisch aktivierte Zellsortierung in Tiermodellen der Demyelinisierung

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Dieses Protokoll hilft, Mikroglia von den mikrodissektierten Demyelinisierungsläsionen des erwachsenen Mausgehirns zu isolieren, um die Mikroglia-Eigenschaften in vivo zu untersuchen. Diese Technik spart Zeit und hat geringere Anforderungen sowohl für Experimentatoren als auch für Geräte. Diese Methode hilft, Mikroglia aus dem Gehirn des Tieres zu isolieren, insbesondere aus mikrodissektiertem Gewebe in verschiedenen Krankheitszuständen.Beginnen Sie mit der Mikrosezierung der Läsionen, die durch neutralen Farbstoff um das Corpus callosum unter einem Stereomikroskop markiert sind. Zentrifugieren Sie das sezierte Gewebe bei 300 mal g für 30 Sekunden, um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln. Enzymmix eins und Enzymmix zwei auf 37 Grad Celsius in einem Inkubator vorheizen.Dann fügen Sie 1.950 Mikroliter vorgewärmte Enzymmischung eine zu einer Probe hinzu und verdauen Sie sie in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Fügen Sie 30 Mikroliter vorgewärmtes Enzym hinzu, mischen Sie zwei und mischen Sie vorsichtig. Nach der Verdauung vier Milliliter kaltes PBS in die Tube geben und vorsichtig schütteln.Zentrifugieren Sie die Gewebeproben bei 300 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und saugen Sie den Überstand langsam und vollständig ab. Schwebe das Zellpellet vorsichtig mit 1.550 Mikrolitern kaltem PBS. Fügen Sie 450 Mikroliter der kalten Lösung zur Entfernung von Ablagerungen hinzu und mischen Sie sie gut.Verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Pipette, um die Mischung sehr langsam und vorsichtig mit zwei Millilitern kaltem PBS zu überlagern. Zentrifugieren Sie die Mischung und suchen Sie dann nach den drei Schichten. Verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Pipette, um die beiden oberen Schichten vollständig abzusaugen, und füllen Sie das Rohr bis zu fünf Milliliter mit Kaltladepuffer.Drehen Sie die Röhre dreimal vorsichtig um. Als nächstes, nach der Zentrifugation und Aspiration des Überstandes, suspendieren Sie das Zellpellet mit 90 Mikrolitern Ladepuffer und fügen Sie 10 Mikroliter CD11b-Perlen hinzu. Gut mischen und 15 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren.Nach der Inkubation fügen Sie einen Milliliter des Ladepuffers hinzu und waschen Sie die Zellen, indem Sie die Flüssigkeit vorsichtig mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette auf und ab pipettieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und saugen Sie den Überstand vollständig ab, um die ungebundenen Perlen zu entfernen. Suspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern des Ladepuffers und platzieren Sie die MS-Säule mit ihrem Separator zur positiven Auswahl im Magnetfeld.Spülen Sie die Säule mit 500 Mikrolitern des Ladepuffers, um die Zellen zu schützen und die Effizienz der magnetischen Sortierung basierend auf dem Protokoll des Herstellers sicherzustellen. Wenden Sie die Zellsuspension auf die MS-Spalte an und verwerfen Sie den Durchfluss, der die nicht markierten Zellen enthält. Fügen Sie 500 Mikroliter des Ladepuffers hinzu, um die Säule zu waschen, und entfernen Sie sie aus dem Separator.Legen Sie die Säule auf ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie einen Milliliter des Ladepuffers in die Säule ein. Drücken Sie schließlich den Kolben an den Boden der Säule, um die magnetisch markierten Zellen auszuspülen. Eine schematische Darstellung der Gating-Strategie, die in der Durchflusszytometrie-Analyse von Mikroglia verwendet wird, die aus Demyelinisierungsläsionen erwachsener Mäuse vor und nach der magnetisch aktivierten Zellsortierung isoliert wurden, ist hier dargestellt.Die grafischen Bilder stellen die Vorwärtsstreuhöhe und die Seitenstreuhöhe für die Auswahl von Zellen, die Vorwärtsstreufläche und die Vorwärtsstreuhöhe für die Auswahl einzelner Zellen sowie CD11b-FITC und CD45-APC für die Auswahl der myeloischen Zellen und Mikroglia dar. Der Anteil an Mikroglia hat nach der magnetisch aktivierten Zellsortierung deutlich zugenommen. Das grafische Bild stellt die Gating-Strategie dar, die in der Durchflusszytometrie-Analyse für lebende und tote Einzelzellen nach der magnetisch aktivierten Zellsortierung verwendet wird.Hier wurden 7-Aminoactinomycin D und die seitliche Streuhöhe verwendet, um die lebenden Zellen auszuwählen. Denken Sie beim Versuch dieses Verfahrens daran, die demyelinisierenden Läsionen unter einem Stereomikroskop basierend auf den neutralen roten Markierungen genau zu sezieren.

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Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

In diesem Video beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von CD11b-Zellen, einschließlich Mikroglia, aus Mäuse-Welpengehirnen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung. Das Hirngewebe wird homogenisiert, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten, die mit Anti-CD11b-Antikörpern beschichteten Mikrokügelchen inkubiert werden, gefolgt von einer magnetischen Säulentrennung, um die CD11b+-Zellpopulation zu reinigen.

Magnetische Isolierung von Mikroglia aus dem Gehirn von Maus-Welpen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung primärer Oligodendrozytenzellen aus einer neuralen Zellsuspension, die von einem Maus-Welpen durch magnetische Trennung gewonnen wurde. Bei der Technik werden magnetische Beads verwendet, die mit Antikörpern beschichtet sind, die spezifisch für Oligodendrozyten-Antigene sind, und ermöglicht so die selektive Isolierung dieser Zellen.

Isolierung von primären Oligodendrozyten der Maus mit immunmagnetischen Beads

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Extraktion von Mikrogliazellen aus demyelinisierenden Läsionen in Mäusegehirnen mittels magnetischer Zellsortierung. Das Protokoll umfasst das Präparieren des läsionierten Hirngewebes, das Mikrogliazellen enthält, die Behandlung des Gewebes mit spezifischen Enzymen, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, und die Verwendung von Mikrogliarezeptor-spezifischen magnetischen Kügelchen zur Isolierung der Mikrogliazellen.

Isolierung von Mikroglia aus demyelinisierenden Läsionen des Mausgehirns mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung

Hier präsentieren wir ein Protokoll Mikroglia aus postnataler Maus Welpen (Tag 1) für in - vitro - Experimente zu isolieren. Diese improvisierte Isolierungsmethode erzeugt sowohl hohe Ausbeute und Reinheit, einen bedeutenden Vorteil gegenüber alternativen Methoden, die für die Zwecke der Erläuterung Mikroglia biology breites Spektrum Experimente ermöglicht.

Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit

Ein Protokoll für die Isolierung von primären Mikroglia aus murine Gehirn wird vorgestellt. Diese Technik hilft bei der Förderung des gegenwärtigen Verständnis von neurologischen Erkrankungen. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung und magnetische Trennung werden kombiniert, um genügend Ertrag einer hochreinen Probe zu produzieren. Darüber hinaus erläutern wir die Schritte zur Charakterisierung der Mikroglia.

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Wir beschreiben die Immunomagnetic Isolierung der primäre Maustaste Oligodendrozyten, ermöglicht die schnelle und spezielle Isolierung der Zellen für in-vitro- Kultur.

Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

Wir bieten ein Protokoll zur Isolierung von Mikroglia aus verschiedenen sezierten Regionen einer erwachsenen Maushirnhälfte, gefolgt von halbautomatischer Bibliotheksvorbereitung für die tiefe einzelzellige RNA-Sequenzierung von Transkriptomen in voller Länge. Diese Methode wird dazu beitragen, die funktionelle Heterogenität von Mikroglia bei Gesundheit und Krankheit aufzuklären.

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

Primäre Mikrogliakulturen werden häufig verwendet, um neue entzündungshemmende Moleküle zu bewerten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und relevante Methode zur magnetischen Isolierung von Mikroglia aus neugeborenen Welpen.

Magnetische Isolierung von Mikrogliazellen aus neugeborener Maus für primäre Zellkulturen

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung von Mikrogliazellen aus dem Hypothalamus der Maus (oder gleichwertigen kleinen Gehirnstrukturen) mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS) in relativ kurzer Zeit. Die MACS-sortierten hypothalamischen Mikroglia können für die ex vivo-Analyse verwendet werden und können für die Durchführung von In-vitro-Assays plattiert werden.

Isolierung von hypothalamischen Mikroglia aus frisch perfundiertem adulten Mausgehirn durch magnetisch aktivierte Zellsortierung  

Wir haben festgestellt, Mausmodellen periventrikuläre Leukomalazie (PVL), die vorherrschende Hirn-Trauma bei Frühgeborenen durch periventrikulären Läsionen der weißen Substanz gekennzeichnet. Hypoxie / Ischämie mit / ohne systemische Infektion sind die primären Ursachen der PVL. Einseitige carotis Ligation und Hypoxie Exposition mit / ohne Lipopolysaccharid Injektion schafft PVL-Läsionen in P6 Mäusen.

Mausmodellen periventrikuläre Leukomalazie

Lernen Sie die Isolierung primärer Mikroglia aus Demyelinisierungsläsionen adulten Mäusehirns mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mikroglialer Charakteristika in vivo und optimiert Zeit- sowie Ressourcenaufwand.

Isolierung von primären Mausmikroglia durch magnetisch aktivierte Zellsortierung in Tiermodellen der Demyelinisierung

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