Echtzeit-Detektion und Erfassung invasiver Zellsubpopulationen aus Co-Kulturen

Diese Technik ermöglicht die Identifizierung von Zellen mit unterschiedlichen invasiven Fähigkeiten unter dem Einfluss von sezernierten Faktoren aus kokultivierten Stromazellen. Die Technik bewertet den Einfluss von sezernierten Faktoren aus kokultivierten Stroma- oder Immunzellen auf die Zellinvasion. Es ermöglicht auch die Wiederherstellung und Analyse invasiver Zellsubpopulationen, die in heterogenen Zellmischungen vorhanden sind.

Die Technik kann bestimmen, welche Tumoren invasive Zellsubpopulationen beherbergen, die zu Metastasen führen. Die Erfassung und Analyse invasiver Krebszellen kann Therapieentscheidungen beeinflussen. Um die Zellkultur zu beginnen, waschen Sie die Adhärenzzellkulturen mit einer Konfluenz von etwa 70% mit 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Dann fügen Sie 0,05% Trypsin und EDTA-Lösung hinzu, um die Zellen abzuheben. Neutralisieren Sie die Trypsinlösung mit serumhaltigen Zellkulturmedien und zählen Sie die Zellen mit einem Aliquot der Zellsuspension. Legen Sie alle drei sterilen Kammern in die Gewebekulturhaube.

Suchen Sie den Knopf auf der kurzen Seite der unteren Kammer und richten Sie die untere Kammer so aus, dass der Knopf dem Experimentator zugewandt ist. Fügen Sie 30.000 bis 50.000 Zellen in 90 Mikrolitern Medien aus der unteren Kammer zu jeder Vertiefung hinzu, ohne Blasen zu bilden. Verwenden Sie 5% der mit fetalem Rinderserum ergänzten Medien in zwei unteren Kammern als Positivkontrolle für die Zellmotilität und verwenden Sie 0% serumergänzte Medien als Negativkontrolle.

Drehen Sie die untere Kammer um 90 Grad, nachdem Sie sie für 10 bis 15 Minuten in der Haube eingewöhnt haben. Platzieren Sie dann die mittlere Kammer oben, so dass der Knopf an der unteren Kammer in die Kerbe der mittleren Kammer gleitet. Drücken Sie die Kammer vertikal nach unten, bis von jeder der Längsseiten der Baugruppe ein Klicken zu hören ist.

Fügen Sie 160 Mikroliter serumfreie Medien zu allen Vertiefungen der mittleren Kammer hinzu. Stellen Sie sicher, dass ein kuppelförmiger Meniskus sichtbar ist, nachdem die Vertiefungen gefüllt wurden, und platzieren Sie die obere Kammer mit Elektroden nach unten auf der mittleren Kammer, um die blauen Punkte auf der mittleren und oberen Kammer auszurichten. Drücken Sie die Kammer vertikal nach unten, bis von jeder der Längsseiten der Baugruppe ein Klickgeräusch zu hören ist.

Geben Sie 20 bis 50 Mikroliter serumfreies Medium in die obere Kammer. Montieren Sie die Baugruppe auf dem Zweizweck-Zellanalysator im Gewebekultur-Inkubator und warten Sie 30 Minuten, bevor Sie den Hintergrund messen. Öffnen Sie die Zellanalysator-Software, wählen Sie dann die zu verwendende Dockingstation aus, gefolgt von einem Klick auf die Nachrichtenregisterkarte, und stellen Sie sicher, dass Verbindungen in Ordnung angezeigt werden, um sicherzustellen, dass das Array gut in der Dockingstation platziert ist und die Elektroden gut auf die Sensoren ausgerichtet sind.

Klicken Sie auf die Registerkarte Testnotizen und geben Sie alle möglichen Informationen zum Experiment ein. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Layout und geben Sie die Beschreibung des Array-Layouts ein. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Zeitplan und fügen Sie zwei Schritte aus dem Menü Schritte hinzu, einen Hintergrundschritt mit einem Sweep und einen Testschritt mit 100 Sweeps.

Sobald sich das Array 30 Minuten lang im Inkubator des Zweizweck-Zellanalysators befunden hat, klicken Sie auf die Wiedergabeschaltfläche, um die Hintergrundmessung zu starten. Nachdem die Hintergrundmessung abgeschlossen ist, entfernen Sie das Array aus der Halterung und legen Sie es wieder in die Zellkulturhaube. Dann fügen Sie 30.000 bis 50.000 Zellen in 100 Mikrolitern serumfreier Medien zu jeder Vertiefung der oberen Kammer hinzu.

Dies sind die Zellen, die die Elektrode erkennt, sobald sie erfolgreich durch die Membran wandern. Lassen Sie die Baugruppe 30 Minuten in der Haube stehen, bevor Sie sie zur Impedanzmessung auf dem Zweizweck-Zellanalysator montieren. Platzieren Sie das Array wieder im Zweizweckzellenanalysator und überprüfen Sie die Nachrichtenregisterkarte auf die Meldung "Verbindungen in Ordnung".

Klicken Sie auf die Wiedergabeschaltfläche, um die Impedanzmessung zu starten, und klicken Sie dann auf die Registerkarte Plot, um den Fortschritt des Signals zu überwachen. Wenn der Endpunkt vor 25 Stunden erreicht wird, klicken Sie im Dropdown-Menü Ausführen auf den Abbruchschritt. Um Daten zu exportieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm, wählen Sie Im Listenformat kopieren aus, und fügen Sie die Daten dann in eine Kalkulationstabelle ein.

Überwachen Sie die Migrationsrate in Echtzeit auf dem Zweizweck-Zellanalysator, um den interessierenden Haltepunkt zu bestimmen. Sobald dies erreicht ist, demontieren Sie die Baugruppe aus dem Zweizweck-Zellanalysator und legen Sie sie in die Gewebekulturhaube. Bereiten Sie eine angemessene Anzahl von 1,5 Millilitern Mikrozentrifugenröhrchen vor, um die Zellen aus den interessierenden Vertiefungen zu sammeln.

Legen Sie die Baugruppe in eine 10 Zentimeter große Schale, um Flüssigkeiten aufzunehmen, wenn sich die Kammern lösen. Drücken Sie die flexiblen Schnappenden auf der Längsseite der mittleren Kammer nach innen, bis ein Klickgeräusch zu hören ist, anschließend demontieren Sie die obere Kammer und kehren Sie sie in eine neue 10-Zentimeter-Schüssel um. Verwenden Sie einen Zellheber mit einem 13-Millimeter-Blatt, um die Zellen aus allen Vertiefungen zu sammeln, die den gleichen experimentellen Zustand aufweisen.

Spülen oder tauchen Sie die Klinge in 1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung, um die Zellen in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu sammeln. Dann drehen Sie die Zellen bei 500 mal G für fünf Minuten herunter und vermehren Sie diese gesammelten Zellen oder führen Sie Endpunktanalysen wie Einzelzell-RNA-Sequenzierung durch. Die Beurteilung der Invasion der Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Stromazellen zeigte, dass die MDA-MB-231-Zellinvasion verstärkt wurde, wenn bestrahlte Swiss-3T3-Fibroblasten J2-Stamm in der unteren Kammer für den Austausch von Faktoren zwischen den beiden Zelllinien saßen.

Interessanterweise nahm die MDA-MB-231-Invasion zu, als die Anzahl der 3T3 J2-Zellen verdoppelt wurde. Auf der anderen Seite scheint die Invasionsrate eines invasiven Klons von MCFDCIS-Zellen, DCIS-Delta Four, durch das Übersprechen mit 3T3 J2-Zellen gehemmt zu werden, was auf die wertvolle Anwendung des Dreikammer-Arrays zur Messung unterschiedlicher Effekte des Stromas hindeutet. In diesem Fall Fibroblasten auf Zellinvasion.

Menschliche Nabelvenen-Endothelzellen waren invasiver als Reaktion auf Faktoren, die von MDA-MB-231-Zellen abgesondert wurden, im Gegensatz zu denen, die von DCIS-Zellen sezerniert wurden, was mit der Fähigkeit invasiver Tumore übereinstimmt, Endothelzellen für die Blutgefäßbildung und spätere Verbreitung in den Kreislauf zu rekrutieren. Die Invasion von Patienten-abgeleiteten Xenotransplantatzellen aus der obersten Kammer nahm als Reaktion auf kokultivierte menschliche Knochenmark-Immunzellen zu. Interessanterweise war das Vorhandensein von 2% Serum in der unteren Kammer mit den Immunzellen des menschlichen Knochenmarks für die Invasion von Xenotransplantaten aus dem Patienten unerlässlich.

Wells können mit einer extrazellulären Matrix beschichtet werden, um die Basalmembranbarriere nachzuahmen. Therapeutika können den Medien in den Brunnen hinzugefügt werden, um ihre Wirkung auf die Invasion zu überwachen.