Subkonjunktivale Verabreichung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Kleintiermodellen

Dieses Protokoll bietet eine Methode der Gentherapie-Verabreichung an mehrere Augengewebe auf sichere, einfache und effektive Weise. Es ist auch für intrastromale und subretinale Injektionen bei Kleintieren anpassbar. Die Verwendung des subkonjunktivalen Injektionsweges ist minimalinvasiv.

Es birgt weniger Risiken und ist vielversprechend für die AV-Verabreichung zur Behandlung mehrerer Augenerkrankungen. Mit über 1 Milliarde Menschen weltweit, die an Sehbehinderungen leiden, bietet die Verwendung einer sicheren und einfachen Methode zur Medikamentenabgabe eine breite Anwendbarkeit für die Behandlung vieler verschiedener Ursachen von Erblindung. Die in diesem Protokoll beschriebenen Genabgabemethoden sind von besonderem Interesse für diejenigen, die potenzielle Interventionsstrategien entwickeln und praktizierende Augenärzte praktizieren, die diese Medikamente schließlich an Patienten abgeben werden.

Die größte Herausforderung für jemanden, der dieses Protokoll zum ersten Mal durchführt, ist wahrscheinlich das Einführen der Nadel in den Konzeptbindehautraum. Um zu beginnen, bauen Sie das Injektionssystem zusammen, indem Sie ein Stereomikroskop und eine Spritzenpumpe in eine Biosicherheitswerkbank stellen. Als nächstes schneiden Sie den Polyethylenschlauch auf eine Länge von etwa 50 Zentimetern.

Führen Sie das Ende einer 36-Gauge-Nadel in ein Ende des Schlauchs ein. Füllen Sie dann eine 3-Milliliter-Einwegspritze mit sterilem Wasser und führen Sie sie in die Seite des Röhrchens gegenüber der Nadel ein. Spülen Sie den Schlauch dreimal abwechselnd mit sterilem Wasser und 70% Alkohol, um den Schlauch zu desinfizieren und sicherzustellen, dass es keine Lecks, Verstopfungen oder Schäden im gesamten Schlauch gibt.

Füllen Sie den Schlauch mit der 3-Milliliter-Einwegspritze mit sterilem Wasser und lassen Sie den Schlauch an der Einwegspritze befestigt. Legen Sie dann ein Stück Paraschaum auf die Oberfläche der Biosicherheitswerkbank und fügen Sie einen Pool mit sterilem Wasser hinzu. Tauchen Sie den Teil des Schlauchs, der mit der Nadel verbunden ist, in den Pool mit sterilem Wasser.

Als nächstes ziehen Sie die Einwegspritze aus der Schlauchöffnung, um zu verhindern, dass beim Entfernen der Spritze Luft in das Schlauchsystem eindringt. Füllen Sie dann eine 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze mit sterilem Wasser. Als nächstes verbinden Sie die Hamilton-Spritzennadel mit dem offenen Ende des Schlauchs, indem Sie die Nadelspitze der Hamilton-Spritze in den Pool mit sterilem Wasser auf dem Para-Film tauchen.

Halten Sie die schnelle Rückwärtstaste auf dem Pumpenbildschirm gedrückt, um die Druckblöcke auf die ungefähre Länge der Spritze zu bewegen. Als nächstes schrauben Sie die Klemmknöpfe der Halterung ab, um die Halteklammern am Drücker und die Spritzenhalterblöcke zu lösen. Legen Sie anschließend die Hamilton-Spritze auf den Spritzenhalterblock und befestigen Sie die Spritze gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Um die Parameter im Pumpeneinstellungsbildschirm anzupassen, drücken Sie die Taste "Force" und stellen Sie die Kraftstufe auf 30% ein. Akzeptieren Sie dann die Änderungen, um zum Einstellbildschirm zurückzukehren. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Schnellstart", wählen Sie "Methode" und dann die Option "Nur infundieren". Für die Spritzenoption wählen Sie Hamilton 1700, klicken Sie dann auf "Glas" und wählen Sie 10 Mikroliter.

Wählen Sie später die Infusionsrate und das Injektionsvolumen aus. Werfen Sie das Wasser aus der Hamilton-Spritze aus, während Sie den Schlauch und die Injektionsnadel mit Wasser füllen, indem Sie die Infuse"-Taste drücken. Als nächstes ziehen Sie das Virus zurück, indem Sie die Injektionsnadel in ein Aliquot des Virusbestands stecken.

Ziehen Sie dann die Hamilton-Spritze leicht zurück, indem Sie die Rückwärtstaste drücken, um eine kleine Luftblase in den Schlauch einzuführen. Nachdem Sie das Tier betäubt haben, greifen Sie die Bindehaut mit einer Pinzette. Führen Sie dann die Nadel in die Bindehaut ein, bis die Abschrägung vollständig von der Bindehautmembran bedeckt ist, und legen Sie die Nadel gegen die Kugel.

Starten Sie gleichzeitig die Einspritzung, indem Sie die Starttaste mit dem Fußschalter drücken. Um die Verteilung des AAV-Vektors zu untersuchen, wurden das Augen- und umgebende Gewebe mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Die repräsentativen sagittalen Abschnitte zeigten, dass die Dispersion der indischen Tinte hauptsächlich neben den extraokularen Muskeln in der äußeren Oberfläche der Sklera im periokularen lockeren Bindegewebe auftrat.

Um die Transduktion von selbstkomplementärem AAV 8 acht Wochen nach der Injektion zu bestätigen, wurde die Häufigkeit von grün fluoreszierenden Proteinen in den Querschnitten durch Immunfluoreszenzfärbung untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass AAV 8-Vektoren die periokularen Muskeln hinter dem Auge und der Hornhaut effizient transduzierten. Um die Vektor-Bioverteilung zu analysieren, wurden Vektorgenom-Kopienzahlen und unterschiedliche Augenkompartimente in anderen Organen, einschließlich Leber und Herz, durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Primern und Sonden untersucht, die spezifisch für das Transgen sind.

Die Expression des Transgens wurde durch quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion bestätigt, was darauf hindeutet, dass die subkonjunktivale Injektion von AAV 8 zu einer Transgenexpression im Augenlid, in der Bindehaut, in der Hornhaut und im Sehnerv führt. Die Luftblase dient als Barriere zwischen dem Wasser in der Röhre und dem therapeutischen Medikament. Diese Technik ermöglicht es anderen Forschern, die Verwendung des subkonjunktivalen Verabreichungsweges sowohl für ophthalmologische Lösungen als auch für okuläre Gentherapien für mehrere Krankheiten zu untersuchen.