Einzelzellfaktorlokalisierung auf Chromatin unter Verwendung von Ultra-Low Input Cleavage Under Targets und Freisetzung mit Nuclease

CUT & RUN ist eine leistungsstarke Technik zur Bestimmung der Proteinlokalisation auf Chromatin, und hier beschreiben wir eine Einzelzellversion dieser Technik in einem manuellen 96-Well-Format. Die meisten Proteinlokalisierungstechniken, wie ChIP-seq, erfordern einen hohen Zelleintrag und dauern etwa drei Tage. CUT&RUN wurde aufgrund des hohen Signals und des niedrigen Hintergrunds für Low-Cell- und Single-Cell-Anwendungen optimiert und kann an einem einzigen Tag abgeschlossen werden.

Wir stellen uns vor, dass diese Technik auf fast jede biologische Probe angewendet werden kann und besonders leistungsfähig sein kann, um die Faktorlokalisierung in seltenen und niedrig dosierten Proben, wie z. B. wertvollen Patientenproben, zu bestimmen. Bevor Sie Einzelzellexperimente durchführen, testen Sie den Antikörper und die Technik an einer hohen Anzahl von nicht wertvollen Zellen. Die Haupteinschränkung dieses Experiments ist die Abhängigkeit von einem robusten Antikörper.

Demonstriert wird das Verfahren von Santana Lardo, einem erfahrenen Forschungsspezialisten aus meinem Labor. Nachdem Sie einzelne Zellen sortiert und Kerne an Perlen gebunden haben, legen Sie die 96-Well-Platte auf ein 96-Well-Magnetrack und lassen Sie die Perlen mindestens fünf Minuten binden. Entfernen Sie dann den Überstand und verwerfen Sie ihn.

Fügen Sie 100 Mikroliter blockierenden Puffer zu den kerngebundenen Perlen hinzu, mischen Sie sie mit sanftem Pipettieren und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie die Platte auf ein 96-Well-Magnetrack und lassen Sie den Überstand für mindestens fünf Minuten aufräumen. Entfernen und entsorgen Sie dann den Überstand, ohne die Perlen zu stören.

Entfernen Sie die Platte aus dem Magnetgestell und suspendieren Sie die Perlen in 100 Mikrolitern Waschpuffer pro Reaktion mit sanftem Pipettieren. Legen Sie die Platte wieder auf das 96-Well-Magnetrack, lassen Sie den Überstand aufräumen, entfernen und verwerfen Sie dann den Überstand. Resuspendieren Sie die Perlen in 25 Mikrolitern Waschpuffer pro Reaktion mit sanftem Pipettieren.

Machen Sie eine primäre Antikörper-Mastermischung, indem Sie 25 Mikroliter Waschpuffer pro Reaktion aliquotieren und dann 0,5 Mikroliter Antikörper pro Reaktion hinzufügen. Fügen Sie 25,5 Mikroliter der Antikörper-Waschpuffermischung hinzu, gefolgt von einem sanften Pipettieren zu jeder Probe, die mit einem Antikörper behandelt wird, der auf das interessierende Protein abzielt. Eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.

Legen Sie die Proben dann wieder auf das 96-Well-Magnetrack. Sobald der Überstand klar ist, entfernen und entsorgen Sie ihn, ohne die Perlen zu stören. Nachdem Sie die Platte aus dem Magnetgestell entfernt haben, waschen Sie die Perlen mit 100 Mikrolitern Waschpuffer und suspendieren Sie sie durch Pipettieren.

Nachdem Sie die Platte wieder auf ein 96-Well-Magnetrack gelegt und Überstände entsorgt haben, wie zuvor gezeigt, suspendieren Sie jede Probe in 25 Mikroliter Waschpuffer. Machen Sie eine Protein-A-MNase-Mastermischung, indem Sie 25 Mikroliter Waschpuffer und eine optimierte Menge an Protein-A-MNase pro Reaktion hinzufügen. Geben Sie 25 Mikroliter Protein-A-MNase-Mastermischung zu jeder Probe, einschließlich der Kontrollproben.

Die Proben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie die Platte auf ein magnetisches Rack mit 96 Vertiefungen. Lassen Sie den Überstand für mindestens fünf Minuten aufräumen und entfernen und verwerfen Sie dann den Überstand, ohne die Perlen zu stören.

Nachdem Sie die Platte aus dem Magnetgestell entfernt haben, waschen Sie die Perlen mit 100 Mikrolitern Waschpuffer und suspendieren Sie sie durch sanftes Pipettieren. Legen Sie die Platte auf ein 96-Well-Magnetrack und entsorgen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt. Entfernen Sie dann die Proben aus dem Magnetgestell und suspendieren Sie die Perlen in 50 Mikrolitern Waschpuffer durch sanftes Pipettieren.

Die Proben in einer Eiswassermischung fünf Minuten lang auf null Grad Celsius ausgleichen und dann aus dem Eiswasserbad entnehmen. Fügen Sie einen Mikroliter 100-millimoläres Calciumchlorid mit einer Mehrkanalpipette hinzu. Mischen Sie gut drei- bis fünfmal mit sanftem Pipettieren mit einer großvolumigen Mehrkanalpipette und bringen Sie die Proben dann auf null Grad Celsius zurück.

Starten Sie einen 10-Minuten-Timer, sobald die Platte wieder im Eiswasserbad ist. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 50 Mikroliter einer Lösung, die die doppelte Konzentration von RSTOP+ und Puffer enthält, in jede Vertiefung in der gleichen Reihenfolge pipettieren, in der das Calciumchlorid zugegeben wurde. Die Proben 20 Minuten bei 37 Grad Celsius ausbrüten.

Drehen Sie die Platte bei 16.000 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Legen Sie die Platte auf ein magnetisches Rack mit 96 Vertiefungen. Lassen Sie den Überstand für mindestens fünf Minuten aufräumen.

Übertragen Sie dann Überstände auf eine frische 96-Well-Platte und werfen Sie die Perlen weg. Für die DNA-Extraktion fügen Sie jeder Probe einen Mikroliter 10% SDS und 0,83 Mikroliter 20 Milligramm pro Milliliter Proteinase K hinzu und mischen Sie die Proben durch sanftes Pipettieren. Die Proben für 10 Minuten bei 70 Grad Celsius inkubieren.

Stellen Sie die Platte auf Raumtemperatur zurück. Fügen Sie 46,6 Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid und 90 Mikroliter 50% PEG4000 hinzu und mischen Sie es durch sanftes Pipettieren. Geben Sie 33 Mikroliter Polystyrol-Magnetitperlen zu jeder Probe und inkubieren Sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur.

Legen Sie die Platte auf ein magnetisches Rack und lassen Sie den Überstand etwa fünf Minuten lang aufräumen. Entsorgen Sie dann vorsichtig den Überstand, ohne die Perlen zu stören. Zweimal mit 150 Mikrolitern 80% Ethanol abspülen, ohne die Perlen zu stören.

Drehen Sie die Platte 30 Sekunden lang kurz bei 1000 mal G. Legen Sie die Platte wieder auf ein 96-Well-Magnetgestell und entfernen Sie das gesamte Restethanol, ohne die Perlen zu stören. Trocknen Sie die Proben etwa zwei bis fünf Minuten an der Luft.

Resuspendieren Sie die Perlen in 37,5 Mikrolitern 10-millimolärem TRIS-Hydrochlorid mit pH 8 und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie die Platte wieder auf ein magnetisches Gestell und lassen Sie die Perlen fünf Minuten lang binden. Übertragen Sie 36,5 Mikroliter des Überstands auf eine frische, thermocyclerkompatible 96-Well-Platte und entsorgen Sie die Perlen.

Nach der Beurteilung der Zellqualität wurden das Aussehen und der Prozentsatz der Zellen untersucht, was zeigte, dass minderwertige embryonale Stammzellen nicht verwendet werden sollten. Die Einzelzellsortierung wurde mit Hoechst 33342-Färbung durchgeführt, und die Testzellen wurden gezählt, um sicherzustellen, dass entweder Null oder eine Zelle in jedem Bohrloch gefunden wird. Die Agarosegel-Analyse ergab eine niedermolekulare Leiter und einzelne einzellige uliCUT&RUN-Bibliotheken.

Suboptimale und optimale Bibliotheksanalysen zeigen eine niedermolekulare Leiter, eine suboptimale Bibliothek aufgrund einer ineffizienten Mnase-Verdauung und eine erfolgreiche Bibliothek mit geeigneter Verdauung. Die Verteilung des Fragmentanalysators zeigt, dass die erwartete Größe von Einzelzellen zwischen 150 und 500 Basenpaaren liegt. In großen Proteinen wird die DNA jedoch etwa 270 Basenpaare haben.

Die Proteinbelegung unter Verwendung des Single-Locus-Genom-Browsers, der eine hohe Zellzahl oder Negativkontrolle darstellt, und des Einzelzell-CTCF uliCUT&RUN zeigten, dass Einzelzellen weitgehend starke Peaks darstellten, ähnlich wie hochzellige uliCUT&RUN. Heatmaps von Einzelzell-CTCF oder Negativkontrolle zeigten ein klares Muster der Leseanreicherung direkt über etablierten CTCF-Bindungsstellen in den Zellen. Eindimensionale Heatmaps zeigen eine höhere Lesedichte gegenüber etablierten CTCF-Bindungsstellen in Einzelzellbibliotheken im Vergleich zu umgebenden Regionen und No-Antibody-Kontrollen, was eine antikörperspezifische Anreicherung an etablierten Bindungsstellen zeigt.

Es ist wichtig, die perlengebundenen Kerne auf dem Eiswasserbad auszugleichen und die Probe bei der Zugabe von Calciumchlorid nicht zu überhitzen, um eine Überverdauung des Chromatins zu verhindern.