Name: Einzelzellfaktorlokalisierung auf Chromatin unter Verwendung von Ultra-Low Input Cleavage Under Targets und Freisetzung mit Nuclease (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Erfahren Sie die Einzelzell-CUT&RUN-Methode zur Proteinlokalisierung auf Chromatin in einem manuellen 96-Well-Format. Diese Technik ermöglicht die Analyse seltener Proben mit geringem Zellinput.

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Wir danken den Mitgliedern des Hainer Lab für die Lektüre und Kommentare zu einer früheren Version dieses Manuskripts. Dieses Projekt verwendete den NextSeq500, der am Health Sciences Sequencing Core der University of Pittsburgh am UPMC Children's Hospital of Pittsburgh für die Sequenzierung verfügbar ist, mit besonderem Dank an seinen Direktor, William MacDonald. Diese Forschung wurde zum Teil vom University of Pittsburgh Center for Research Computing durch die bereitgestellten Computerressourcen unterstützt. Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grant Nummer R35GM133732 (zu S.J.H.) unterstützt.

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<li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking%3A+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li>
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<li>Blat, Y., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesins+bind+to+preferential+sites+along+yeast+chromosome+III%2C+with+differential+regulation+along+arms+versus+the+centric+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region.</a> Cell. 98 (2), 249-259 (1999).</li>
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<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+epigenomic+profiling+using+100+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells.</a> Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).</li>
<li>Shankaranarayanan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-tube+linear+DNA+amplification+%28LinDA%29+for+robust+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq.</a> Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li>
<li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).</li>
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<li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communications. 6, 6033(2015).</li>
<li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChlC+and+ChEC%3B+genomic+mapping+of+chromatin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li>
<li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733(2015).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856(2017).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314(2019).</li>
<li>Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+pluripotency+factors+in+single+cells+and+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos.</a> Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+profiling+of+multiple+chromatin+proteins+in+the+same+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells.</a> Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).</li>
<li>Patty, B. J., Hainer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+chromatin+profiling+genome-wide+using+uliCUT%26RUN+in+single+cells+and+individual+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts.</a> Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).</li>
<li>Zheng, X. -Y., Gehring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-input+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+endosperm+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN.</a> Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen im Zusammenhang mit diesem Projekt.

CUT&RUN ist ein effektives Protokoll zur Bestimmung der Proteinlokalisation auf Chromatin. Es hat viele Vorteile im Vergleich zu anderen Protokollen, einschließlich: 1) hohes Signal-Rausch-Verhältnis, 2) schnelles Protokoll und 3) niedrige Sequenzierungsleseabdeckung erforderlich, was zu Kosteneinsparungen führt. Die Verwendung von Protein A- oder Protein A/G-MNase ermöglicht die Anwendung von CUT&RUN mit jedem verfügbaren Antikörper; Daher hat es das Potenzial, viele Proteine schnell und einfach zu profilieren. Die Anpa...

Viele Kernproteine funktionieren, indem sie mit Chromatin interagieren, um DNA-vorlagenbasierte Aktivitäten zu fördern oder zu verhindern. Um die Funktion dieser Chromatin-interagierenden Proteine zu bestimmen, ist es wichtig, die genomischen Stellen zu identifizieren, an denen diese Proteine gebunden sind. Seit seiner Entwicklung im Jahr 1985 ist die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) der Goldstandard, um zu identifizieren, wo ein Protein an Chromatin 1,2 bindet. Die traditionelle ChIP-Technik hat den folgenden grundlegenden Arbeitsablauf: Zellen werden geerntet und vernetzt (in der Regel mit Formaldehyd), Chromatin geschoren wird (normalerweise mit harten Ultraschallmethoden, die eine Vernetzung erfordern), das interessierende Protein wird mit einem Antikörper, der auf das Protein abzielt (oder das Protein markiert), gefolgt von einem sekundären Antikörper (gekoppelt an Agarose oder magnetische Perlen) immunpräzipitiert, die Vernetzung wird umgekehrt, Protein und RNA werden verdaut, um DNA zu reinigen, und diese ChIP-angereicherte DNA wird als Vorlage für die Analyse verwendet (unter Verwendung der radioaktiv markierten Sonden1,2, qPCR 3, Microarrays 5,6 oder Sequenzierung4). Mit dem Aufkommen von Microarrays und massiv paralleler Tiefensequenzierung wurden ChIP-Chip 5,6 und ChIP-seq4 in jüngerer Zeit entwickelt und ermöglichen eine genomweite Identifizierung der Proteinlokalisation auf Chromatin. Die Vernetzung von ChIP ist seit seiner Einführung eine leistungsstarke und zuverlässige Technik mit großen Fortschritten in der Auflösung durch ChIP-exo 7 und ChIP-nexus8. Parallel zur Entwicklung von ChIP-seq wurden native (nicht vernetzende) Protokolle für ChIP (N-ChIP) etabliert, die den Nukleaseaufschluss (oft unter Verwendung von Mikrokokkennuklease oder MNase) verwenden, um das Chromatin zu fragmentieren, im Gegensatz zur Beschallung, die in traditionellen Vernetzungs-ChIP-Techniken durchgeführt wird9. Ein großer Nachteil sowohl bei der Vernetzung von ChIP- als auch bei N-ChIP-Technologien war jedoch die Anforderung hoher Zellzahlen aufgrund der geringen DNA-Ausbeute nach der experimentellen Manipulation. Daher wurden in den letzten Jahren viele Anstrengungen unternommen, um die ChIP-Technologien für einen geringen Zelleintrag zu optimieren. Diese Bemühungen haben zur Entwicklung vieler leistungsstarker ChIP-basierter Technologien geführt, die sich in ihrer Anwendbarkeit und ihren Eingabeanforderungen unterscheiden 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Es fehlen jedoch einzellige ChIP-seq-basierte Technologien, insbesondere für Nicht-Histon-Proteine.
Im Jahr 2004 wurde eine alternative Technologie entwickelt, um die Proteinbelegung von Chromatin zu bestimmen, die als Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) und Chromatin Immunocleavage (ChIC)19 bezeichnet wird. Diese Single-Locus-Techniken verwenden eine Fusion von MNase entweder zum interessierenden Protein (ChEC) oder zu Protein A (ChIC) zum direkten Schneiden von DNA neben dem interessierenden Protein. In den letzten Jahren wurden sowohl ChEC als auch ChIC für die genomweite Proteinprofilierung auf Chromatin (ChEC-seq bzw. CUT&RUN) optimiert.20,21. Während ChEC-seq eine leistungsfähige Technik zur Bestimmung der Faktorlokalisierung ist, erfordert es die Entwicklung von MNase-Fusionsproteinen für jedes Ziel, während ChIC und seine genomweite Variation, CUT & RUN, auf einem Antikörper beruhen, der auf das interessierende Protein gerichtet ist (wie bei ChIP) und rekombinanter Protein-A-MNase, wobei das Protein A die IgG-konstante Region des Antikörpers erkennen kann. Als Alternative wurde eine Fusionsprotein-A/Protein-G-MNase (pA/G-MNase) entwickelt, die ein breiteres Spektrum von Antikörperkonstantenregionen erkennen kann22. CUT&RUN hat sich schnell zu einer beliebten Alternative zu ChIP-seq entwickelt, um die Proteinlokalisation auf dem gesamten Chromatin-Genom zu bestimmen.
Ultra-Low-Input CUT&RUN (uliCUT&RUN), eine Variante von CUT&RUN, die die Verwendung von Low- und Single-Cell-Inputs ermöglicht, wurde2019 23 beschrieben. Hier wird die Methodik für eine manuelle Einzelzellenanwendung im 96-Well-Format beschrieben. Es ist wichtig zu beachten, dass seit der Entwicklung von uliCUT&RUN zwei Alternativen für die Histonprofilierung, CUT&Tag und iACT-seq, entwickelt wurden, die eine robuste und hochparallele Profilierung von Histonproteinenermöglichen 24,25. Darüber hinaus wurde scCUT&Tag für die Profilierung mehrerer Faktoren in einer einzelnen Zelle (multiCUT&Tag) und für die Anwendung auf Nicht-Histon-Proteineoptimiert 26. Zusammen bietet CUT&RUN eine attraktive Alternative zu Low-Input-ChIP-seq, bei der uliCUT&RUN in jedem molekularbiologischen Labor durchgeführt werden kann, das Zugang zu einem Zellsortierer und Standardausrüstung hat.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL durchsichtige Mikrofuge-Röhrchen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>90410</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Röhrchen Magnetgestell</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Röhrchen-kompatible Kaltzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5404000537</td><td></td></tr><tr><td>10 cm sterile Gewebekulturplatten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>10X T4 DNA-Ligase-Puffer</td><td>Neu England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische Röhrchen</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>1X TE Puffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>200 & Mikro; L PCR-Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td></td></tr><tr><td>2X Quick Ligase Puffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td>Ligase Buffer</td></tr><tr><td>5X KAPA HiFi Puffer</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td>5X High Fidelity PCR Puffer</td></tr><tr><td>7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB559925</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Magnetgestell</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12027 oder 12331D</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>VWR</td><td>82006-636</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP-Kügelchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Polystyrol-Magnetit-Kügelchen; Aufgrund der möglichen Variabilität zwischen den AMPure XP-Bead-Chargen wird empfohlen, Ihre AMPure-Bead-Lösung zu kalibrieren. Siehe Hersteller" s Anweisungen</td></tr><tr><td>Antikörper gegen Protein von Interesse</td><td>variiert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>BioMag Plus Concanavalin A-Kügelchen</td><td>Polysciences</td><td>86057-10</td><td>ConA-konjugierte paramagnetische Mikrosphären</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ62905AP</td><td></td></tr><tr><td>Zellsortierer</td><td>BD FACSAria II Zellsortierer</td><td></td><td>Erfordert eine Schulung</td></tr><tr><td>Zellspezifische Medien für die Zellkultur</td><td>Variiert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C298-500</td><td>Chloroform ist hautreizend und schädlich beim Verschlucken; Handhabung in einem chemischen Abzug mit Handschuhen, Laborkittel und Schutzbrille</td></tr><tr><td>Computer mit 64-Bit-Prozessor und Zugang zu einem Super-Computing-Cluster</td><td></td><td></td><td>Für computergestützte Analysen von resultierenden Sequenzierungsdatensätzen</td></tr><tr><td>DNA-Spin-Säulen</td><td>Epoch Life Sciences</td><td>1920-250</td><td></td></tr><tr><td>dNTP-Set</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophorese-Geräte</td><td>variieren</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22032601</td><td>100% vol/vol Ethanol ist leicht entflammbar; Handhabung in einem chemischen Abzug mit Handschuhen, Laborkittel, und Schutzbrille</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure&nbsp; (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482100</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>VWR</td><td>97063-256</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Heterologe S. cerevisiae DNA Spike-in</td><td>hausgemacht</td><td></td><td>Hergestellt aus vernetzter, MNase-verdauter und Agarosegel-extrahierter genomischer DNA, die von Protein/RNA gereinigt und auf 10 ng/ml verdünnt wurde. Wir empfehlen genomische Hefe-DNA, aber bei Bedarf können auch andere Organismen verwendet werden.</td></tr><tr><td>Salzsäure&nbsp; (HCl)</td><td>Fisher</td><td>Scientific A144-212</td><td>Salzsäure ist sehr korrosiv; Handhabung in einem chemischen Abzug mit Handschuhen, Laborkittel und Schutzbrille</td></tr><tr><td>Iskübel</td><td>variiert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina Sequenzierplattform (z. B. NextSeq500)</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator mit Temperatur- und Atmosphärenregelung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51030284</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase mit 5X KAPA HiFi Puffer</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td>Hotstart High Fidelity Polymerase</td></tr><tr><td>Laminar Flow Hood</td><td>Bakery Company</td><td>SG404</td><td></td></tr><tr><td>Manganchlorid (MnCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenset</td><td>Rainin</td><td>30386597</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>NEB Adapter</td><td>New England Biolabs</td><td>E6612AVIAL</td><td>Adapter NEB</td></tr><tr><td>Universal Primer</td><td>New England Biolabs</td><td>E6611AVIAL</td><td>Universal Primer</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos für Illumina Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L</td><td>Indexierte Primer</td></tr><tr><td>Antikörper mit Negativkontrolle</td><td>Antikörper-Online-ABIN101961</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>New England Biolabs</td><td>B1500S</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>2231000666</td> Phase-Lock-Röhrchen <td></td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>129046</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (PCI)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>15593049 Phenol ist schädlich beim Verschlucken oder bei Hautkontakt; Handhabung in einem chemischen Abzug mit Handschuhen, Laborkittel und Schutzbrille</td></tr><tr><td>Phsophat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10814010</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenhilfe</td><td>Drummond Scientific</td><td># 4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol (PEG) 4000</td><td>VWR</td><td>A16151</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid (KOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-1</td><td>VORSICHT KOH ist ein Augen-/Hautreizmittel als fester und ätzender Stoff in Lösung. Handhabung in einem chemischen Abzug mit Handschuhen, einem Laborkittel und einer Schutzbrille</td></tr><tr><td>Protease-Inhibitoren</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>ProteinA/G-MNase</td><td>Epicypher</td><td>15-1016</td><td>pA/G-MNase</td></tr><tr><td>ProteinA-MNase, gereinigt aus pK19pA-MN</td><td>Addgene</td><td>86973</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay-Röhrchen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Quick Ligase mit 2X Quick Ligase Puffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>New England Biolabs</td><td>T3010</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat&nbsp; (NaOAc)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5150-1L</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td>SDS ist giftig, wenn es eingeatmet wird; in gut belüfteten Räumen vorsichtig mit Handschuhen, Augenschutz und einer Atemschutzmaske der Güteklasse N95 behandeln, wenn</td></tr> mit <tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td> <td>umgehenNaOH ist ein Augen-/Hautreizmittel als Feststoff und ätzend in Lösung. Handhabung in einem chemischen Abzug mit Handschuhen, Laborkittel und Schutzbrille</td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Standard Inverses Lichtmikroskop</td><td>Leica</td><td>11526213</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Labor-Agarose-Gelmaterialien</td><td>Variiert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard-Labormaterialien wie serologische Pipetten und Pipettenspitzen</td><td>Variiert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase</td><td>Neu England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop Vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215414</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td>Alternativ, kann ein Wasserbad verwenden</td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Triton X-100 ist gefährlich; verwenden Sie einen Laborkittel, Handschuhe und eine Schutzbrille, wenn Sie</td></tr><tr><td>mit Trypsin</td> umgehen <td>Fisher Scientific</td><td>MT25052</td><td></td></tr><tr><td>Röhrenrotator</td><td>VWR</td><td>10136084</td><td></td></tr><tr><td>USER Enzym</td><td>New England Biolabs</td><td>M5505S</td><td></td></tr></tbody></table>

einzelzellfaktorlokalisierung auf chromatin unter verwendung von ultra-low input cleavage under targets und freisetzung mit nuclease

Single-Cell Factor Localization on Chromatin using Ultra-Low Input Cleavage Under Targets and Release using Nuclease

Die Bestimmung der Bindungsorte eines Proteins an Chromatin ist für das Verständnis seiner Funktion und potenzieller regulatorischer Ziele unerlässlich. Die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist seit über 30 Jahren der Goldstandard für die Bestimmung der Proteinlokalisation und wird durch die Verwendung eines Antikörpers definiert, um das interessierende Protein aus beschalltem oder enzymatisch verdautem Chromatin herauszuziehen. In jüngster Zeit sind Antikörper-Tethering-Techniken aufgrund ihrer erhöhten Empfindlichkeit zur Beurteilung der Proteinlokalisation auf Chromatin populär geworden. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) ist das genomweite Derivat der Chromatin-Immunspaltung (ChIC) und verwendet rekombinantes Protein A, das an Mikrokokken-Nuklease (pA-MNase) gebunden ist, um die IgG-konstante Region des Antikörpers zu identifizieren, die auf ein Protein von Interesse abzielt, wodurch eine ortsspezifische Spaltung der DNA ermöglicht wird, die das interessierende Protein flankiert. CUT & RUN kann verwendet werden, um Histonmodifikationen, Transkriptionsfaktoren und andere Chromatin-bindende Proteine wie Nukleosomen-Umbaufaktoren zu profilieren. Wichtig ist, dass CUT&RUN verwendet werden kann, um die Lokalisation von entweder neuromatischen oder heterochromatisch assoziierten Proteinen und Histonmodifikationen zu beurteilen. Aus diesen Gründen ist CUT&RUN eine leistungsfähige Methode, um die Bindungsprofile einer Vielzahl von Proteinen zu bestimmen. Vor kurzem wurde CUT&RUN für die Profilierung von Transkriptionsfaktoren in niedrigen Zellpopulationen und Einzelzellen optimiert und das optimierte Protokoll wurde als Ultra-Low Input CUT&RUN (uliCUT&RUN) bezeichnet. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Einzelzellfaktorprofilierung mit uliCUT&RUN in einem manuellen 96-Well-Format vorgestellt.

Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Einzelzellproteinprofilierung auf Chromatin unter Verwendung eines manuellen 96-Well-Formats uliCUT &amp; RUN vorgestellt. Während die Ergebnisse basierend auf dem Profiling des Proteins (aufgrund der Proteinhäufigkeit und der Antikörperqualität), dem Zelltyp und anderen beitragenden Faktoren variieren, werden die erwarteten Ergebnisse für diese Technik hier diskutiert. Die Zellqualität (Zellaussehen und Prozentsatz der lebensfähigen Zellen) und die Einzelzellsortierung sollt...

CUT&RUN und seine Varianten können verwendet werden, um die Proteinbelegung auf Chromatin zu bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Proteinlokalisation auf Chromatin mit Hilfe von einzelligem uliCUT&RUN bestimmt werden kann.

Einzelzellfaktorlokalisierung auf Chromatin unter Verwendung von Ultra-Low Input Cleavage Under Targets und Freisetzung mit Nuclease

Determining the binding locations of a protein on chromatin is essential for understanding its function and potential regulatory targets. Chromatin ...

CUT & RUN ist eine leistungsstarke Technik zur Bestimmung der Proteinlokalisation auf Chromatin, und hier beschreiben wir eine Einzelzellversion dieser Technik in einem manuellen 96-Well-Format. Die meisten Proteinlokalisierungstechniken, wie ChIP-seq, erfordern einen hohen Zelleintrag und dauern etwa drei Tage. CUT&RUN wurde aufgrund des hohen Signals und des niedrigen Hintergrunds für Low-Cell- und Single-Cell-Anwendungen optimiert und kann an einem einzigen Tag abgeschlossen werden.Wir stellen uns vor, dass diese Technik auf fast jede biologische Probe angewendet werden kann und besonders leistungsfähig sein kann, um die Faktorlokalisierung in seltenen und niedrig dosierten Proben, wie z. B. wertvollen Patientenproben, zu bestimmen. Bevor Sie Einzelzellexperimente durchführen, testen Sie den Antikörper und die Technik an einer hohen Anzahl von nicht wertvollen Zellen. Die Haupteinschränkung dieses Experiments ist die Abhängigkeit von einem robusten Antikörper.Demonstriert wird das Verfahren von Santana Lardo, einem erfahrenen Forschungsspezialisten aus meinem Labor. Nachdem Sie einzelne Zellen sortiert und Kerne an Perlen gebunden haben, legen Sie die 96-Well-Platte auf ein 96-Well-Magnetrack und lassen Sie die Perlen mindestens fünf Minuten binden. Entfernen Sie dann den Überstand und verwerfen Sie ihn.Fügen Sie 100 Mikroliter blockierenden Puffer zu den kerngebundenen Perlen hinzu, mischen Sie sie mit sanftem Pipettieren und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie die Platte auf ein 96-Well-Magnetrack und lassen Sie den Überstand für mindestens fünf Minuten aufräumen. Entfernen und entsorgen Sie dann den Überstand, ohne die Perlen zu stören.Entfernen Sie die Platte aus dem Magnetgestell und suspendieren Sie die Perlen in 100 Mikrolitern Waschpuffer pro Reaktion mit sanftem Pipettieren. Legen Sie die Platte wieder auf das 96-Well-Magnetrack, lassen Sie den Überstand aufräumen, entfernen und verwerfen Sie dann den Überstand. Resuspendieren Sie die Perlen in 25 Mikrolitern Waschpuffer pro Reaktion mit sanftem Pipettieren.Machen Sie eine primäre Antikörper-Mastermischung, indem Sie 25 Mikroliter Waschpuffer pro Reaktion aliquotieren und dann 0,5 Mikroliter Antikörper pro Reaktion hinzufügen. Fügen Sie 25,5 Mikroliter der Antikörper-Waschpuffermischung hinzu, gefolgt von einem sanften Pipettieren zu jeder Probe, die mit einem Antikörper behandelt wird, der auf das interessierende Protein abzielt. Eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.Legen Sie die Proben dann wieder auf das 96-Well-Magnetrack. Sobald der Überstand klar ist, entfernen und entsorgen Sie ihn, ohne die Perlen zu stören. Nachdem Sie die Platte aus dem Magnetgestell entfernt haben, waschen Sie die Perlen mit 100 Mikrolitern Waschpuffer und suspendieren Sie sie durch Pipettieren.Nachdem Sie die Platte wieder auf ein 96-Well-Magnetrack gelegt und Überstände entsorgt haben, wie zuvor gezeigt, suspendieren Sie jede Probe in 25 Mikroliter Waschpuffer. Machen Sie eine Protein-A-MNase-Mastermischung, indem Sie 25 Mikroliter Waschpuffer und eine optimierte Menge an Protein-A-MNase pro Reaktion hinzufügen. Geben Sie 25 Mikroliter Protein-A-MNase-Mastermischung zu jeder Probe, einschließlich der Kontrollproben.Die Proben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie die Platte auf ein magnetisches Rack mit 96 Vertiefungen. Lassen Sie den Überstand für mindestens fünf Minuten aufräumen und entfernen und verwerfen Sie dann den Überstand, ohne die Perlen zu stören.Nachdem Sie die Platte aus dem Magnetgestell entfernt haben, waschen Sie die Perlen mit 100 Mikrolitern Waschpuffer und suspendieren Sie sie durch sanftes Pipettieren. Legen Sie die Platte auf ein 96-Well-Magnetrack und entsorgen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt. Entfernen Sie dann die Proben aus dem Magnetgestell und suspendieren Sie die Perlen in 50 Mikrolitern Waschpuffer durch sanftes Pipettieren.Die Proben in einer Eiswassermischung fünf Minuten lang auf null Grad Celsius ausgleichen und dann aus dem Eiswasserbad entnehmen. Fügen Sie einen Mikroliter 100-millimoläres Calciumchlorid mit einer Mehrkanalpipette hinzu. Mischen Sie gut drei- bis fünfmal mit sanftem Pipettieren mit einer großvolumigen Mehrkanalpipette und bringen Sie die Proben dann auf null Grad Celsius zurück.Starten Sie einen 10-Minuten-Timer, sobald die Platte wieder im Eiswasserbad ist. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 50 Mikroliter einer Lösung, die die doppelte Konzentration von RSTOP+ und Puffer enthält, in jede Vertiefung in der gleichen Reihenfolge pipettieren, in der das Calciumchlorid zugegeben wurde. Die Proben 20 Minuten bei 37 Grad Celsius ausbrüten.Drehen Sie die Platte bei 16.000 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Legen Sie die Platte auf ein magnetisches Rack mit 96 Vertiefungen. Lassen Sie den Überstand für mindestens fünf Minuten aufräumen.Übertragen Sie dann Überstände auf eine frische 96-Well-Platte und werfen Sie die Perlen weg. Für die DNA-Extraktion fügen Sie jeder Probe einen Mikroliter 10% SDS und 0,83 Mikroliter 20 Milligramm pro Milliliter Proteinase K hinzu und mischen Sie die Proben durch sanftes Pipettieren. Die Proben für 10 Minuten bei 70 Grad Celsius inkubieren.Stellen Sie die Platte auf Raumtemperatur zurück. Fügen Sie 46,6 Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid und 90 Mikroliter 50% PEG4000 hinzu und mischen Sie es durch sanftes Pipettieren. Geben Sie 33 Mikroliter Polystyrol-Magnetitperlen zu jeder Probe und inkubieren Sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Legen Sie die Platte auf ein magnetisches Rack und lassen Sie den Überstand etwa fünf Minuten lang aufräumen. Entsorgen Sie dann vorsichtig den Überstand, ohne die Perlen zu stören. Zweimal mit 150 Mikrolitern 80% Ethanol abspülen, ohne die Perlen zu stören.Drehen Sie die Platte 30 Sekunden lang kurz bei 1000 mal G. Legen Sie die Platte wieder auf ein 96-Well-Magnetgestell und entfernen Sie das gesamte Restethanol, ohne die Perlen zu stören. Trocknen Sie die Proben etwa zwei bis fünf Minuten an der Luft.Resuspendieren Sie die Perlen in 37,5 Mikrolitern 10-millimolärem TRIS-Hydrochlorid mit pH 8 und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie die Platte wieder auf ein magnetisches Gestell und lassen Sie die Perlen fünf Minuten lang binden. Übertragen Sie 36,5 Mikroliter des Überstands auf eine frische, thermocyclerkompatible 96-Well-Platte und entsorgen Sie die Perlen.Nach der Beurteilung der Zellqualität wurden das Aussehen und der Prozentsatz der Zellen untersucht, was zeigte, dass minderwertige embryonale Stammzellen nicht verwendet werden sollten. Die Einzelzellsortierung wurde mit Hoechst 33342-Färbung durchgeführt, und die Testzellen wurden gezählt, um sicherzustellen, dass entweder Null oder eine Zelle in jedem Bohrloch gefunden wird. Die Agarosegel-Analyse ergab eine niedermolekulare Leiter und einzelne einzellige uliCUT&RUN-Bibliotheken.Suboptimale und optimale Bibliotheksanalysen zeigen eine niedermolekulare Leiter, eine suboptimale Bibliothek aufgrund einer ineffizienten Mnase-Verdauung und eine erfolgreiche Bibliothek mit geeigneter Verdauung. Die Verteilung des Fragmentanalysators zeigt, dass die erwartete Größe von Einzelzellen zwischen 150 und 500 Basenpaaren liegt. In großen Proteinen wird die DNA jedoch etwa 270 Basenpaare haben.Die Proteinbelegung unter Verwendung des Single-Locus-Genom-Browsers, der eine hohe Zellzahl oder Negativkontrolle darstellt, und des Einzelzell-CTCF uliCUT&RUN zeigten, dass Einzelzellen weitgehend starke Peaks darstellten, ähnlich wie hochzellige uliCUT&RUN. Heatmaps von Einzelzell-CTCF oder Negativkontrolle zeigten ein klares Muster der Leseanreicherung direkt über etablierten CTCF-Bindungsstellen in den Zellen. Eindimensionale Heatmaps zeigen eine höhere Lesedichte gegenüber etablierten CTCF-Bindungsstellen in Einzelzellbibliotheken im Vergleich zu umgebenden Regionen und No-Antibody-Kontrollen, was eine antikörperspezifische Anreicherung an etablierten Bindungsstellen zeigt.Es ist wichtig, die perlengebundenen Kerne auf dem Eiswasserbad auszugleichen und die Probe bei der Zugabe von Calciumchlorid nicht zu überhitzen, um eine Überverdauung des Chromatins zu verhindern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben die Chromatin-endogene Spaltung, gekoppelt mit der Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChEC-seq), einer Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -orthogonalen Methode zur Kartierung von Proteinbindungsstellen genomweit mit Mikrokokken-Nuklease (MNase) -Fusionsproteinen.

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dieses Protokoll beschreibt die kombinatorische Verwendung von ChIP-Seq, 4sU-Seq, total RNA-Seq und Ribosom profiling für Zelllinien und Primärzellen. Nachverfolgen von Änderungen im Transkriptionsfaktor verbindlich, de Novo Transkription, RNS-Verarbeitung, Umsatz und Übersetzung im Laufe der Zeit und zeigt den gesamten Verlauf der Ereignisse in aktivierten und/oder sich rasch verändernden Zellen ermöglicht.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Die Kennung der physikalischen Wechselwirkungen zwischen Genen und regulatorische Elemente ist anspruchsvoll aber erfassen Bezahlungsmethode Chromosom Konformation erleichtert worden. Diese Modifikation des 4C-Seq-Protokolls mildert PCR Bias durch Minimierung der Überverstärkung PCR-Vorlagen und maximiert die Mappability von Lesevorgängen durch den Einbau eines Zusatz Restriktionsenzym verdauen Schritt.

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

Beschrieben wird eine hochparallele Methode zur Messung der standortspezifischen DNA-Spaltung auf einzelmolekülebene. Dieses Protokoll demonstriert die Technik mithilfe der Einschränkung endonuklease NdeI. Die Methode kann leicht modifiziert werden, um jeden Prozess zu untersuchen, der zu einer standortspezifischen DNA-Spaltung führt.

Paralleler Hochdurchsatz-Single Molecule Kinetic Assay für standortspezifische DNA-Spaltung

Cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag) ist eine effiziente Chromatin-Epigenom-Profiling-Strategie. Dieses Protokoll stellt eine verfeinerte CUT&amp;Tag-Strategie für die Profilierung von Histonmodifikationen in Pflanzen dar.

Profilierung der H3K4me3-Modifikation in Pflanzen mittels Spaltung unter Targets und Tagmentation

Hi-C 3.0 ist ein verbessertes Hi-C-Protokoll, das Formaldehyd- und Disuccinimidylglutarat-Vernetzer mit einem Cocktail aus DpnII- und DdeI-Restriktionsenzymen kombiniert, um das Signal-Rausch-Verhältnis und die Auflösung der Chromatin-Interaktionsdetektion zu erhöhen.

Erfassung der Chromosomenkonformation über Längenskalen hinweg

Ein Protokoll zur Kartierung der dreidimensionalen Genomorganisation mit Nukleosomenauflösung unter Verwendung der genomweiten Chromosomenkonformationserfassungsmethode Micro-C-XL wird hier vorgestellt.

Kartierung von 3D-Genominteraktionen von Säugetieren mit Micro-C-XL

Hier wird ein effizientes Protokoll für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) von Muskelsatellitenzellen der Mausgliedmaße vorgestellt, das für die Untersuchung der Transkriptionsregulation in Muskelfasern durch Spaltung unter Targets und Freisetzung unter Verwendung von Nuklease (CUT&amp;RUN) geeignet ist.

Ein effizientes Protokoll für die CUT&amp;RUN-Analyse von FACS-isolierten Maus-Satellitenzellen

Die Genexpression wird durch Wechselwirkungen von Genpromotoren mit distalen regulatorischen Elementen reguliert. In dieser Arbeit beschreiben wir, wie Low Input Capture Hi-C (liCHi-C) die Identifizierung dieser Interaktionen in seltenen Zelltypen ermöglicht, die bisher nicht messbar waren.

Ein integrierter Workflow zur Untersuchung der Promotor-zentrierten raum-zeitlichen Genomarchitektur in seltenen Zellpopulationen

Dieses Protokoll führt Bioinformatik-Einsteiger durch eine einführende CUT&amp;RUN-Analysepipeline, die es den Benutzern ermöglicht, eine erste Analyse und Validierung von CUT&amp;RUN-Sequenzierungsdaten durchzuführen. Das Abschließen der hier beschriebenen Analyseschritte in Kombination mit der nachgeschalteten Peak-Annotation ermöglicht es den Benutzern, mechanistische Einblicke in die Chromatinregulation zu gewinnen.

Einführende Analyse und Validierung von CUT&#38;RUN-Sequenzierungsdaten

Ein optimiertes Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease gefolgt von Next-Generation-Sequenzierungsprotokoll (CUT&amp;RUN-seq) wird für neuroendokrine kleinzellige Lungenkrebszelllinien beschrieben. Es ermöglicht eine genomweite Kartierung verschiedener Histonmodifikationen und Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren (z. B. E2F7), um epigenetische und transkriptionelle Deregulation in der SCLC-Pathobiologie zu untersuchen.

Genomweite Kartierung von Histonmodifikationen und Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren in neuroendokrinen kleinzelligen Lungenkrebszelllinien mittels CUT&amp;RUN

Erfahren Sie die Einzelzell-CUT&RUN-Methode zur Proteinlokalisierung auf Chromatin in einem manuellen 96-Well-Format. Diese Technik ermöglicht die Analyse seltener Proben mit geringem Zellinput.

Einzelzellfaktorlokalisierung auf Chromatin unter Verwendung von Ultra-Low Input Cleavage Under Targets und Freisetzung mit Nuclease (Video) | JoVE Journal

Einzelzellfaktorlokalisierung auf Chromatin unter Verwendung von Ultra-Low Input Cleavage Under Targets und Freisetzung mit Nuclease

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