Name: Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung primärer retinaler pigmentierter Epithelzellen aus Mäuseaugen mittels Enzymbehandlung und Dissektion. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der äußeren Blut-Retina-Schranke und altersbedingter Makuladegeneration.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) Fonds R01 EY029751-04

Die Tiere wurden gemäß den Richtlinien des IACUC-Tierprotokolls Nr. 21063 der Universität Oakland und den Richtlinien der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung verwendet.
1. Lösungsvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie das komplette RPE-Zellkulturmedium vor, indem Sie Dulbeccos modifizierte Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) mit 25% fetalem Rinderserum (FBS), 1,5% Penicillin / Streptomycin und 0,02% Gentamicin ergänzen.</li>
	<li>Bereiten Sie Enzym A vor, indem Sie 741 μL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) mit 127 μL Kollagenase-Stammlösung und 132 μL Hyaluronidase-Stammlösung ergänzen. Dies ergibt ein Endvolumen von 1 ml, das vier Augen behandeln kann.<ol><li>Die Kollagenase-Stammlösung wird durch Auflösen von 1 mg Kollagenase aus Clostridium histolyticum in 41 ml HBSS (19,5 Einheiten/ml) hergestellt.</li>
		<li>Die Hyaluronidase-Stammlösung wird durch Auflösen von 1 mg Hyaluronidase aus Rinderhoden in 18,4 ml HBSS (38 Einheiten/ml) hergestellt.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie Enzym B vor, indem Sie drei Teilen HBSS zwei Teile 0,25% Trypsin-EDTA hinzufügen. Beachten Sie, dass das Gesamtvolumen von der Anzahl der sezierten Augen abhängt. 1 ml Enzym B kann zur Behandlung von vier Augen verwendet werden.</li>
</ol>2. Enukleation
<ol><li>Euthanasieren Sie die Maus ethisch durch Inhalation von Kohlendioxid (CO2) gemäß IACUC-Standards21.<ol><li>Setzen Sie das/die Tier(e) kurz in die CO 2 -Kammer, um 100% CO 2 mit einer Füllrate von 30%-70% des Kammervolumens pro Minute mit CO 2 einzubringen, um innerhalb von2 bis 3 min Bewusstlosigkeit mit minimaler Belastung für die Mäuse zu erreichen.</li>
		<li>Bestätigen Sie den Tod (mangelnde Atmung und verblasste Augenfarbe), dann bewegen Sie die Maus aus dem Käfig in einen sauberen sterilisierten chirurgischen Bereich (mit Alkohol geschrubbt), der mit sterilisierten chirurgischen Geräten ausgestattet ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Legen Sie die Maus auf eine sterile Unterlage.</li>
	<li>Enukleieren Sie die Augen, indem Sie eine 5/45-Pinzette auf den Orbitalbereich drücken, um Proptose zu induzieren, gefolgt von einer Pinzette zur Hinterseite des Auges. Extrahieren Sie die Augen mit intaktem Sehnerv, indem Sie die Augen sanft aus der Augenhöhle ziehen.</li>
	<li>Tauchen Sie die Augen mit einer Pinzette in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das 1 ml 5% Povidon-Jod enthält. Inkubieren Sie die Augen bei Raumtemperatur für 2-3 min.</li>
	<li>Entfernen Sie die Augen von der Povidon-Jod-Lösung und legen Sie sie in eine Petrischale. Waschen Sie die Augen mit einer sterilen Transferpipette mit HBSS, bis die orange Farbe des Povidon-Jods verschwunden ist. Dies dauert etwa zwei oder drei Wäschen.</li>
	<li>Legen Sie die Augen in eine neue 60 mm Petrischale und tauchen Sie sie in kalte (2-8 °C) komplette RPE-Zellkulturmedien, die in Schritt 1.1 vorbereitet wurden.</li>
</ol>3. Sezieren
<ol><li>Verwenden Sie unter einem chirurgischen Mikroskop eine Pinzette im M5S-Stil und eine Vannas-Schere, um das Bindegewebe und die extraokularen Muskeln zu entfernen. HINWEIS: Die Dissektion erfolgt unter einer Gewebehaube in einer völlig sterilen Umgebung. Für Videozwecke wurde das Seziermikroskop jedoch außerhalb der Haube platziert, um eine höhere Qualität der Demonstration / des Filmens zu erreichen. Das Legen eines kleinen Stücks fusselfreies Seidenpapier unter das Auge verbessert die Stabilität während der Dissektion. Die Augen können dann vorübergehend (nicht länger als 1 Stunde) in den kalten RPE-Zellkulturmedien gehalten werden. Es ist jedoch vorzuziehen, direkt nach der Reinigung der Augen mit dem nächsten Schritt fortzufahren.</li>
	<li>Die Augen werden in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das 1 ml Enzym-A-Lösung für jeweils vier Augen enthält. Dann die Augen in einem Inkubator bei 37 °C für 40 min inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Augen aus dem Inkubator und dem Mikrozentrifugenröhrchen. Dann übertragen Sie sie in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, das 1 ml Enzym-B-Lösung für jeweils vier Augen enthält. Inkubieren Sie das Röhrchen in einem Inkubator bei 37 °C für 50 min.</li>
	<li>Legen Sie die Augen in eine neue 60-mm-Suspensionskulturschale, die 10 ml komplettes RPE-Zellwachstumsmedium enthält. Anschließend die Augen bei 4 °C für 30 min inkubieren.</li>
	<li>Stellen Sie die Schale unter ein Operationsmikroskop und beginnen Sie mit dem Sezieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den vorderen Teil des Auges (Hornhaut, Iris und Linse) aus dem hinteren Teil der Augenmuschel (hintere Netzhaut).<ol><li>Fassen Sie das Auge mit einer Zange im M5S-Stil und machen Sie einen Schnitt im Ora Serrata-Abschnitt (der vorderste Teil der Netzhaut, wo das Hellblau endet) mit einer # 11-Klinge oder der Nadel einer Spritze.</li>
		<li>Fassen Sie den inneren Teil des Einschnitts mit einer Pinzette und greifen Sie die Hornhaut mit einer anderen Pinzette. Beginnen Sie, die Hornhaut langsam von der Netzhaut zu ziehen oder zu reißen. Achten Sie darauf, in kleinen Schritten zu reißen und den Riss nach unten zu bewegen, während Sie die Hornhaut entfernen, um sicherzustellen, dass die RPE weitgehend intakt bleibt und zu einem saubereren Riss führt. HINWEIS: Sobald die Hornhaut vollständig abgelöst ist, können die Iris und die Linse gesehen werden.</li>
		<li>Trennen Sie Hornhaut und Iris.</li>
	</ol></li>
	<li>Trennen Sie die Linse von der Augenmuschel mit sanfter Kompression der hinteren Augenhälfte.</li>
	<li>Um die neuronale Netzhaut von der RPE-Schicht zu entfernen, greifen Sie die äußere Schicht der Augenmuschel mit einer Pinzette und positionieren Sie den Arm einer zweiten Pinzette zwischen der RPE- und der Neuralschicht. Von dort ziehen oder schöpfen Sie die neuronale Netzhaut vorsichtig von der RPE-Schicht weg. Verwerfen Sie die neuronale Netzhaut. HINWEIS: Im Video werden die neuronale Netzhaut und die Linse zusammen entfernt. Für Anfänger ist es jedoch einfacher, sie separat zu entfernen. Was bleibt, ist die RPE, Aderhaut und Sklera.</li>
	<li>Verwerfen Sie Hornhaut, Iris, Linse und neuronale Netzhaut. Bewegen Sie die verbleibende Augenmuschel in einen neuen Bereich auf der Schale, der frei von Ablagerungen ist.</li>
	<li>Um das RPE von der Aderhaut und Sklera zu trennen, kratzen Sie die Innenseite der Augenmuschel vorsichtig mit einer Pinzette im 5/45-Stil, um die Trennung der RPE-Zellen sicherzustellen. Die RPE-Zellen erscheinen trüb, wenn sie im gesamten RPE-Zellwachstumsmedium suspendiert sind.</li>
	<li>Die Zellen werden mit einer sterilen 3,2-ml-Transferpipette abgesaugt und in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit vollständigen RPE-Zellwachstumsmedien überführt.</li>
</ol>4. Zentrifugation
<ol><li>Legen Sie das 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit den primären RPE-Zellen in eine Zentrifuge und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet mit 10 ml vollständigem RPE-Wachstumsmedium. Das komplette RPE-Wachstumsmedium ist spezifischer für das RPE-Wachstum als andere kontaminierende Zellen wie Müller-Zellen oder Aderhaut-Endothelzellen. Müller-Zellen benötigen hohe Glukosemedien, während Aderhaut-Endothelzellen spezifische Wachstumsfaktoren benötigen. Durch den Wechsel der Medien und die Weitergabe der Kultur werden nur die RPE-Zellen weiter wachsen.</li>
</ol>5. Zellkultur
<ol><li>Die resuspendierten primären RPE-Zellen werden auf eine sterile 100-mm-Petrischale aufgetragen und in einen Inkubator überführt (nach Überprüfung der Reinheit durch Färbung der Zellen mit spezifischen RPE/Müller-Zellmarkern, wie in Abbildung 1E-N dargestellt). Die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 inkubieren. HINWEIS: Die verwendeten Marker sind in der Materialtabelle aufgeführt. Dieser Schritt wird ausgeführt, nachdem die Kultur eingerichtet wurde.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen für etwa 5 Tage, um zu wachsen. Wechseln Sie während dieser Zeit nicht das Medium, stören Sie die Zellen nicht und bewegen Sie die Zellkulturplatte nicht (dies ist ein kritischer Schritt im Protokoll; nach der Isolierung sollten die Zellen inkubiert und 5 Tage lang nicht gestört werden). HINWEIS: Die Anzahl der Zellen hängt von der Anzahl der Augen ab, die für die Isolierung verwendet werden. Eine größere Anzahl von isolierten Augen ergibt eine größere Anzahl von Zellen. Die RPE-Isolierung von zwei Augen ergibt ~ 440.000-880.000 Zellen oder 5% -10% der 100 mm Petrischale, die 8,8 Millionen Zellen aufnehmen kann.</li>
</ol>6. Passaging
<ol><li>Die Medien absaugen und mit 2 ml PBS waschen. Dann saugen Sie die PBS ab.</li>
	<li>Fügen Sie 4 ml 0,25% Trypsin-EDTA (1x) hinzu oder genug, um den Boden der Schale zu bedecken. 5-10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 8 ml vorgewärmtes RPE-Medium oder das doppelte Volumen der in Schritt 6.2 verwendeten Menge an Trypsin hinzu. Dann sammeln Sie die Zellen und legen Sie sie in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Bei 300 x g 7 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml vollständigem RPE-Zellkulturmedium. Die gesamte Suspension in eine sterile 100 mm Petrischale geben. HINWEIS: Die Zellen können bis zu vier oder fünf mal18 durchquert werden. Die konsistentesten Experimentergebnisse finden sich jedoch nach zwei oder drei Passagen. Nach zwei bis vier Passagen änderten die Zellen ihre Form (wie in Abbildung 1D gezeigt), um länglicher zu sein, sammelten sich in der Mitte der Platte an, hörten auf zu wachsen und lösten sich ab.</li>
	<li>Verwenden Sie Immunfluoreszenzprotokolle gemäß den zuvor veröffentlichten Methoden8, 14, 15, 16, um die RPE-Spezifität zu färben und zu validieren.</li>
</ol>7. Immunfluoreszenz
HINWEIS: Die Immunfluoreszenz wurde gemäß den zuvor veröffentlichten Methoden 8,14,15,16,17,18 durchgeführt , um die RPE-Spezifität zu färben und zu validieren. Die Färbung der primären RPE-Zellen erfolgte typischerweise an den Passagen P1 und P2. Hier wird ein kurzer Überblick über das Immunfluoreszenzprotokoll gegeben.
<ol><li>Aussaat der Zellen auf einem Zellkulturkammerobjektträger (30.000 Zellen pro Vertiefung für den 8-Well-Kammerobjektträger).</li>
	<li>Kultur der Zellen in vollständigen RPE-Zellkulturmedien bei 37 °C und 5%CO2 für 24-48 h.</li>
	<li>Wenn die Zellen zu 80%-90% konfluent sind, saugen Sie die Medien aus und waschen Sie den Kammerobjektträger mit 1x PBS.</li>
	<li>Fixieren Sie den Objektträger mit 4% Paraformaldehyd für 10-15 min.</li>
	<li>Das 4%ige Paraformaldehyd absaugen und dann mit einer blockierenden Lösung blockieren (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Die Blockierlösung wird abgesaugt, der primäre Antikörper RPE65 hinzugefügt und drei Stunden bei 37 °C inkubiert (mit einer Antikörperkonzentration im Bereich von 1:200-1:250 im Blockierungspuffer bei einem Volumen von 150-200 μL/Objektträger). Dann dreimal mit PBS/TX-100 waschen (jeweils 5-10 min).</li>
	<li>Saugen Sie den primären Antikörper aus und fügen Sie den sekundären Antikörper hinzu (mit einer Antikörperkonzentration von 1:1.000 im Blockierpuffer bei einem Volumen von 150-200 μL/Objektträger). Eine Stunde bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Saugen Sie den sekundären Antikörper ab. Dreimal mit PBS/Trtion X-100 waschen (jeweils 5-10 min).</li>
	<li>Fügen Sie einen Tropfen DAPI-Montagemedium hinzu, um die Kerne zu kennzeichnen, und legen Sie ein Deckglas über den Objektträger. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen unter dem Deckglas befinden.</li>
	<li>Nehmen Sie dann Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop auf, begleitet von einer hochauflösenden Mikroskopkamera (HRM) und einer Bildverarbeitungssoftware (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären, die für den Inhalt dieses Artikels relevant sind.

Das aktuelle Protokoll ist ein berichtetes, modifiziertes und vereinfachtes detailliertes Verfahren zur RPE-Isolierung von Mausaugen. Das Protokoll umfasst Enukleation, Dissektion, Sammlung, Seeding, Kultur und Charakterisierung von RPE-Zellen, die aus Mausaugen isoliert wurden.
Es gibt einige Einschränkungen und kritische Schritte, die für eine erfolgreiche RPE-Isolierung erfüllt werden müssen, z. B. das Alter der Mäuse, die Anzahl der sezierten Augen, die Größe der Gewebekulturplatte oder -s...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.
The third paragraph of the Discussion&#160;section was updated from:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
to:
This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of M&#252;ller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for M&#252;ller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn&#39;t require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.
In the References section, a 24th reference was added:
<ol start="24">
	<li>Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces &#947;-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).</li>
</ol>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63543">Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells</a>. The Discussion and References sections were updated.

Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Retinale pigmentierte Epithelzellen (RPE) befinden sich zwischen der Aderhaut und der neuronalen Netzhaut und bilden eine einfache Monoschicht von quaderförmigen Zellen, die hinter den Photorezeptorzellen (PR) liegen1. Das RPE spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung einer gesunden Umgebung für PR-Zellen, hauptsächlich durch die Verringerung der übermäßigen Anhäufung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und der daraus resultierenden oxidativen Schäden1. RPE-Zellen überwachen viele Funktionen, wie die Umwandlung und Speicherung von Retinoide, die Absorption von Streulicht, den Flüssigkeits- und Ionentransport und die Phagozytose der abgestoßenen PR-Außensegmentmembran 2,3. Veränderungen in der RPE (Morphologie/Funktion) können ihre Funktion beeinträchtigen und zu einer Retinopathie führen, und dies ist ein gemeinsames Merkmal vieler Augenerkrankungen4. Viele Augenerkrankungen sind mit Veränderungen in der Morphologie und Funktion von RPE-Zellen verbunden, darunter einige genetische Erkrankungen wie Retinitis pigmentosa, Lebersche kongenitale Amaurose und Albinismus 4,5,6 sowie altersbedingte Augenerkrankungen wie diabetische Retinopathie (DR) und altersbedingte Makuladegeneration (AMD)7,8 . Menschliche Zellen sind am wünschenswertesten, daher wäre es ideal, RPE-Störungen in primären menschlichen RPE-Zellen zur Bildung von RPE-Monoschichten zu untersuchen. Ethische Fragen und die begrenzte Verfügbarkeit menschlicher Spender aufgrund der Tatsache, dass die meisten dieser Störungen zu Morbiditätführen 9, aber nicht unbedingt zur Mortalität10, verhindern dadurch die Isolierung primärer humaner RPE-Zellen. Dies macht die Kultivierung von RPE-Zellen von nichtmenschlichen Tierspendern zu einer bevorzugten Alternative. Nagetiere, insbesondere Mäuse, gelten als hervorragendes Modell für die Untersuchung verschiedener Augenerkrankungen, da die transgene Technologie bei diesen Arten weiter verbreitet ist11. Obwohl die Verwendung von kultivierten primären RPE-Zellen viele Vorteile bietet, war es schwierig, wachsende Zellen für viele Passagen aufrechtzuerhalten oder die Zellen zu speichern und wiederzuverwenden. Die Haupteinschränkung dieses Protokolls ist das Alter der Mäuse; Mäuse, die für die RPE-Isolierung verwendet werden, sollten ein sehr junges Alter haben (18-21 Tage alt ist optimal), da es schwierig war, RPE-Zellen von erwachsenen Mäusen zu kultivieren11,12,13. RPE-Zellen können in jedem Alter aus Mausaugen isoliert werden, jedoch waren bis zu vier Zellpassagen nur bei jungen Mäusen (18-21 Tage alt) erfolgreich. Die RPE-Isolierung aus Mausnetzhäuten unter Verwendung von C57BL6-Mäusen und transgenen Mäusen mit Deletion der N-Methyl-D-Aspartatrezeptoren (NMDARs) an den RPE-Zellen wurde durchgeführt, um die Wirkung von erhöhtem Aminosäure-Homocystein auf die Entwicklung und das Fortschreiten von AMD14 zu untersuchen. Darüber hinaus halfen isolierte primäre RPE-Zellen dabei, ein therapeutisches Ziel für AMD vorzuschlagen, indem sie die NMDARs an RPE-Zellen hemmten14. Es gibt einige NMDAR-Blocker, die von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassen sind und derzeit zur Behandlung von mittelschwerer bis schwerer Verwirrung (Demenz) im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit (AD) eingesetzt werden, wie Memantin16, das ein potenzielles therapeutisches Ziel für AMD14 sein könnte. Darüber hinaus wurden isolierte primäre Maus-RPE-Zellen für den Nachweis von Entzündungsmarkern und die vorgeschlagene Induktion von Entzündungen als zugrunde liegenden Mechanismus für Homocystein-induzierte Merkmale von AMD und AD unter Verwendung einer genetisch veränderten Maus (CBS) verwendet, die einen hohen Homocysteinspiegel aufweist16,17.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um RPE-Zellen sowohl von Wildtyp-C57BL/6-Mäusen als auch von transgenen Mäusen zu isolieren, die in unserem Labor als vereinfachte Anpassung anderer veröffentlichter Isolationsprotokolle13,18,19 entwickelt wurden, um ein leicht anwendbares und zuverlässiges Protokoll zu erreichen. Es gibt keine Geschlechtspräferenz in diesem Protokoll. Während das Alter der Mäuse für den Isolationsprozess entscheidend ist, wurden junge, ältere Mäuse (18-21 Tage alt) und ältere Mäuse in jedem Alter (bis zu 12 Monate) für die RPE-Isolierung verwendet. Wir stellten jedoch fest, dass die RPE-Zellen, die aus den jungen Mäusen isoliert wurden, länger lebten und bis zu vier Passagen durchgeführt werden konnten. Die RPE-Zellen, die aus älteren Mäusen isoliert wurden, könnten ein- oder zweimal durchquert werden, dann würden sie aufhören zu wachsen und ihre Form ändern, um länglicher zu sein (Fibroblasten-ähnliche Zellen). Ein Verlust der Pigmentierung und eine verminderte Adhäsion an der Gewebekulturplatte, gefolgt von einer Ablösung, wurden ebenfalls beobachtet.

<table><tbody><tr><td>Becher : 100 ml</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase aus Clostridium histolyticum&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657-25MG</td><td>Für arbeitende Enzyme, A</td></tr><tr><td>Einweg-Messpipetten: 3,2 ml steril</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td> <td>& nbsp; gibco&nbsp;</td><td>11330</td><td>Medien zur Züchtung von RPE-Zellen&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>Für vollständige RPE-Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>Gentamicin-Reagenzlösung</td><td>gibco</td><td>15750-060</td><td>Für vollständige RPE-Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>88284</td><td>Für funktionierende Enzyme (A& B)&nbsp;</td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i CO2-Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase aus Rinderhoden</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506-500MG</td><td>Für das Arbeitsenzym A</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok Spritze mit aufgesetzter Nadel 21 G x 1 1/2 Zoll, steril, Einmalgebrauch, 3 mL</td><td>B-D</td><td>309577</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen: 2 mL</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaler Maus-Anti-RPE65-Antikörper</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab78036</td><td>Für IF-Färbungen&nbsp;</td></tr><tr><td>Pen Strup</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>Für komplette RPE-Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>Positive Action Pinzette, Style 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Schere Iris Standard Gerade 11,5cm</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall St8 Zentrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Klinge, #11,</td> Edelstahl <td>Bard-Parker</td><td>371211 Suspensionskulturschale</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturschale: 100x20 mm Corning</td><td></td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tornado-Röhrchen: 15 mL</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Tornado-Röhrchen: 50 mL</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (1x) 0,25% </td><td>gibco</td><td>2186962</td><td>Für die Arbeit mit Enzym B</td></tr><tr><td>Pinzette 5MS, 8,2 cm, gerade, 0,09 x 0,05 mm Spitzen</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Positive Action Style 5, biologisch, Dumostar, poliertes Finish, 110 mm OAL</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>Unterlagepolster, mittel : 23" x 36"</td> <td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Federschere - 2,5 mm Cutting Edge</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von primären retinalen pigmentierten epithelzellen der maus

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

Die retinale pigmentierte Epithelschicht (RPE) liegt unmittelbar hinter den Photorezeptoren und beherbergt ein komplexes Stoffwechselsystem, das mehrere entscheidende Rollen bei der Aufrechterhaltung der Funktion der Photorezeptoren spielt. Daher sind die RPE-Struktur und -Funktion unerlässlich, um ein normales Sehvermögen aufrechtzuerhalten. Dieses Manuskript stellt ein etabliertes Protokoll für die primäre RPE-Zellisolierung von Mäusen vor. Die RPE-Isolierung ist ein großartiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der RPE-Pathologie in den verschiedenen Mausmodellen für Augenerkrankungen zugrunde liegen. Darüber hinaus kann die RPE-Isolierung helfen, primäre Maus-RPE-Zellen zu vergleichen, die aus Wildtyp- und genetisch veränderten Mäusen isoliert wurden, sowie Medikamente zu testen, die die Entwicklung von Therapien für Sehstörungen beschleunigen können. Das Manuskript stellt ein schrittweises RPE-Isolationsprotokoll vor; Der gesamte Vorgang von der Enukleation bis zur Aussaat dauert ca. 4 Stunden. Das Medium sollte 5-7 Tage nach der Aussaat nicht gewechselt werden, damit die isolierten Zellen ungestört wachsen können. Diesem Prozess folgt die Charakterisierung von Morphologie, Pigmentierung und spezifischen Markern in den Zellen mittels Immunfluoreszenz. Zellen können maximal drei- oder viermal durchlaufen werden.

Validierung der Spezifität, Reinheit und Barrierefunktion/-bildung isolierter RPE-Zellen Die isolierten Zellen wurden unter einem Lichtmikroskop untersucht, um ihre Lebensfähigkeit, Morphologie und Pigmentierung zu überprüfen. Bilder von P0 und P1 (Abbildung 1A,B) und Bilder von P0 und P4 wurden aufgenommen (Abbildung 1C,D), um die Veränderungen in den Zellen zu zeigen; Form, Größe und Pigmentierung, als die Passagen zur viert...

Dieses Manuskript beschreibt ein vereinfachtes Protokoll zur schrittweisen Isolierung von retinalen pigmentierten Epithelzellen (RPE) aus Mausaugen. Das Protokoll umfasst die Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von RPE-Zellen.

Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Dieses Protokoll wird einen einfachen und effizienten Weg zur erfolgreichen Isolierung primärer pigmentierter Epithelzellen der Maus skizzieren. Retinale pigmentierte Epithelzellen spielen eine sehr wichtige Rolle, um die Photorezeptorzellen zu erhalten und die normale Funktion der Netzhaut zu gewährleisten. Unser Labor isoliert primäre pigmentierte Epithelzellen der Maus als wichtiges Werkzeug zur Untersuchung der äußeren Blut-Netzhaut-Barriere und verwandter Krankheiten wie altersbedingter Makuladegeneration.Um die Mausaugen zu extrahieren, euthanasieren Sie die Maus ethisch nach den von Ihrer Institution zugelassenen Methoden, legen Sie dann die Maus auf eine sterile Unterlage und kernisieren Sie das Auge, indem Sie eine 5/45-Pinzette auf den Orbitalbereich drücken, um Proptose zu induzieren, dann bewegen Sie die Pinzette zum hinteren Teil des Auges und ziehen Sie vorsichtig, um das Auge zu entfernen, um sicherzustellen, dass der Sehnerv noch intakt ist. Tauchen Sie die Augen mit einer Pinzette in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 5% Povidon-Jod enthält. Inkubieren Sie die Augen bei Raumtemperatur für 2 bis 3 Minuten.Entfernen Sie die Augen vom Povidonjod und legen Sie sie in eine Petrischale. Während Sie eine sterile Transferpipette verwenden, waschen Sie die Augen mit Hanks' Balanced Saline Solution, bis die orange Farbe des Povidon-Jods verschwunden ist. Dies dauert ungefähr 2 bis 3 Wäschen.Legen Sie die Augen in eine neue Petrischale und tauchen Sie sie in kalte, vollständige RPE-Zellwachstumsmedien. Von dort aus können Sie mit dem Sezieren unter einem Seziermikroskop beginnen. Verwenden Sie unter dem Mikroskop eine Pinzette und / oder eine Vannas-Schere, um Bindegewebe in extraokularen Muskeln zu ziehen oder wegzuschneiden.Die Augen können dann eine Stunde lang in kalten RPE-Zellkulturmedien gehalten werden. Es wird jedoch bevorzugt, nach der Reinigung des Augapfels direkt mit dem nächsten Schritt fortzufahren. Übertragen Sie die Augen in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das das Enzym A-Lösung enthält, und inkubieren Sie die Augen dann 40 Minuten lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius.Entfernen Sie die Augen aus der Enzym-A-Lösung und legen Sie sie in ein neues 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das die Enzym-B-Lösung enthält, legen Sie sie dann in einen Inkubator und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 50 Minuten. Entfernen Sie die Augen von Enzym B und legen Sie sie in eine 60-Millimeter-Petrischale und tauchen Sie sie und vervollständigen Sie RPE-Zellwachstumsmedien, dann inkubieren Sie die Augen bei 4 Grad Celsius für 30 Minuten. Stellen Sie die Schale unter das Seziermikroskop und beginnen Sie mit dem Sezieren.Verwenden Sie eine M5S-Pinzette und eine Nadel einer Spritze, um einen Schnitt im Ora Seratta-Abschnitt zu machen. Fassen Sie nun mit zwei Pinzetten den inneren Teil des Einschnitts mit einer Pinzette und greifen Sie die Hornhaut mit der anderen Zange. Beginnen Sie, die Hornhaut langsam von der Netzhaut zu reißen, indem Sie die Hornhaut ziehen.Achten Sie darauf, in kleinen Schritten zu reißen und die Träne nach unten zu bewegen, während Sie die Hornhaut entfernen. Dadurch wird sichergestellt, dass der RPE größtenteils intakt bleibt und Sie einen saubereren Riss erhalten. Sobald die Hornhaut vollständig abgelöst ist, sollten Sie die Iris und die Linse sehen können.Entfernen Sie sowohl die Iris als auch die Linse mit einer Pinzette, um die Reinheit der Isolierung zu erhalten. Um die neuronale Netzhaut von der RPE-Schicht zu entfernen, greifen Sie die äußere Schicht der Augenmuschel mit einer Pinzette und positionieren Sie einen Arm einer zweiten Pinzette zwischen der RPE- und der Neuralschicht. Von dort ziehen oder schöpfen Sie die neuronale Netzhaut vorsichtig von der RPE-Schicht weg und werfen Sie dann die neuronale Netzhaut weg.Verschieben Sie die RPE-Ebene an eine andere Stelle auf der Schale, frei von Ablagerungen. Um die RPE von Aderhaut und Sklera zu trennen, kratzen Sie die Innenseite der Augenmuschel vorsichtig mit einer 5/45-Pinzette ab, um die Trennung der RPE-Zellen sicherzustellen. Die RPE-Zellen erscheinen trüb, wenn sie suspendiert und vollständig RPE-Zellwachstumsmedien sind.Die Zellen werden mit einer sterilen 3,2-Milliliter-Transferpipette abgesaugt und in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit kompletten RPE-Zellwachstumsmedien überführt. Die Zellen können bei 300g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert werden. Sie können dann den Überstand aussaugen und das Pellet in erwärmten RPE-Zellwachstumsmedien resuspendieren.Die Zellen auf eine 100-Millimeter-Petrischale legen und bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 inkubieren. Diese Bilder zeigen eine erfolgreiche Isolierung bei Passage 0 und Passage 1, was sich in der Pigmentierung der RPE-Zellen zeigt. Bei Passage 4 werden die Zellen weniger charakteristisch und weisen weniger Pigment auf, zeigen ein spindelartiges Aussehen oder werden mit einer größeren Oberfläche robuster.Wir validierten die RPE-Zellen mit einem RPE-spezifischen Marker, RPE65 und einem Zytoskelettprotein F-Aktin. Wir überprüften auch auf eine mögliche Kontamination mit Muller-Zellen durch Färbung mit einem Muller-Zell-spezifischen Marker, Vimentin. Dieses Protokoll ist eine vereinfachte Anpassung bestehender Protokolle.Das Protokoll verwendet Materialien und zugehörige Geräte, die in den meisten Forschungslabors verfügbar sind, was dazu beiträgt, primäre RPE-Zellen der Maus effektiv zu isolieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir ein Verfahren zur Gewinnung von okulären Pigmentepithelzellen aus einem Kaninchenmodell. Die Zellen sind hilfreich bei der Entwicklung von Therapiestrategien für degenerative Erkrankungen der Netzhaut.

Isolierung von IPE- und RPE-Zellen: Eine Technik zur Gewinnung von okulären Pigmentepithelzellen aus Kaninchenauge

In diesem Video beschreiben wir eine Technik zur Isolierung von Iris- und retinalen Pigmentepithelzellen aus Schweineaugen, um ihre Primärkulturen für in vivo und ex vivo Studien zu erhalten. Diese Pigmentzellen könnten genetisch verändert werden, um regenerative Ansätze zur Behandlung von Augenerkrankungen zu untersuchen.

Isolierung von IPE- und RPE-Zellen: Eine Technik zur Gewinnung pigmentierter Epithelzellen aus isoliertem Schweineauge

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine multifunktionale Epithel des Auges. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären Zellkulturen, abgeleitet von der murinen RPE zu etablieren.

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

Dieses Protokoll, das ursprünglich von Fernandez-Godino et al. im Jahr 20161berichtet wurde, beschreibt eine Methode zur effizienten Isolierung und Kultur von Maus-RPE-Zellen, die innerhalb einer Woche auf Transwell-Platten eine funktionelle und polarisierte RPE-Monoschicht bilden. Das Verfahren dauert ca. 3 Stunden.

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Wir beschreiben eine einfache und effiziente Methode zur Isolierung von Zellen der retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) aus den Augen junger pigmentierter Meerschweinchen. Dieses Verfahren ermöglicht molekularbiologische Folgeuntersuchungen am isolierten RPE, einschließlich Genexpressionsanalysen.

Isolierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus Meerschweinchenaugen

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) aus lokal gewonnenen Schweineaugen. Diese Zellen dienen als hochwertige Alternative zu Stammzellen und eignen sich für die In-vitro-Netzhautforschung .

Isolierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen von Schweinen für die In-vitro-Modellierung

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung retinaler glialer Müller-Zellen aus Mausaugen. Das Protokoll beginnt mit der Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von Müller-Zellen.

Isolierung von primären retinalen glialen Müller-Zellen der Maus

Das retinale Pigmentepithel (RPE) fungiert als entscheidende Barriere zwischen Aderhaut und Netzhaut und fördert die Gesundheit und Funktion von retinalen Zelltypen, wie z. B. Photorezeptoren. Darin beschreiben wir ein einfaches und effektives Protokoll zur Isolierung und Kultivierung adulter muriner RPE.

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie Sie retinalen Stammzellen aus dem Ciliarepithels der Maus Auge zu isolieren und zu wachsen sie in Kultur zu klonalen Netzhaut Kugeln zu bilden. Die Kugeln, die isoliert besitzen den Kardinal Eigenschaften von Stammzellen: Selbsterneuerung und multipotentiality.

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

In diesem Protokoll beschreiben wir die Zerlegung der Plazenten von der Maus auf die Schwangerschaft d10.5, durch Isolation von Trophoblastzellen mit einem Percoll-Gradienten folgen. Wir demonstrieren dann Verwendung der isolierten Zellen in einem Matrigel Invasionsassay.

Isolation of Primary Maus Trophoblastzellen und Trophoblastinvasion Assay

Erfahren Sie die Isolierung primärer retinaler pigmentierter Epithelzellen aus Mäuseaugen mittels Enzymbehandlung und Dissektion. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der äußeren Blut-Retina-Schranke und altersbedingter Makuladegeneration.

Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus

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