Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus
November 4th, 2022
Dieses Manuskript beschreibt ein vereinfachtes Protokoll zur schrittweisen Isolierung von retinalen pigmentierten Epithelzellen (RPE) aus Mausaugen. Das Protokoll umfasst die Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von RPE-Zellen.
Dieses Protokoll wird einen einfachen und effizienten Weg zur erfolgreichen Isolierung primärer pigmentierter Epithelzellen der Maus skizzieren. Retinale pigmentierte Epithelzellen spielen eine sehr wichtige Rolle, um die Photorezeptorzellen zu erhalten und die normale Funktion der Netzhaut zu gewährleisten. Unser Labor isoliert primäre pigmentierte Epithelzellen der Maus als wichtiges Werkzeug zur Untersuchung der äußeren Blut-Netzhaut-Barriere und verwandter Krankheiten wie altersbedingter Makuladegeneration.
Um die Mausaugen zu extrahieren, euthanasieren Sie die Maus ethisch nach den von Ihrer Institution zugelassenen Methoden, legen Sie dann die Maus auf eine sterile Unterlage und kernisieren Sie das Auge, indem Sie eine 5/45-Pinzette auf den Orbitalbereich drücken, um Proptose zu induzieren, dann bewegen Sie die Pinzette zum hinteren Teil des Auges und ziehen Sie vorsichtig, um das Auge zu entfernen, um sicherzustellen, dass der Sehnerv noch intakt ist. Tauchen Sie die Augen mit einer Pinzette in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 5% Povidon-Jod enthält. Inkubieren Sie die Augen bei Raumtemperatur für 2 bis 3 Minuten.
Entfernen Sie die Augen vom Povidonjod und legen Sie sie in eine Petrischale. Während Sie eine sterile Transferpipette verwenden, waschen Sie die Augen mit Hanks' Balanced Saline Solution, bis die orange Farbe des Povidon-Jods verschwunden ist. Dies dauert ungefähr 2 bis 3 Wäschen.
Legen Sie die Augen in eine neue Petrischale und tauchen Sie sie in kalte, vollständige RPE-Zellwachstumsmedien. Von dort aus können Sie mit dem Sezieren unter einem Seziermikroskop beginnen. Verwenden Sie unter dem Mikroskop eine Pinzette und / oder eine Vannas-Schere, um Bindegewebe in extraokularen Muskeln zu ziehen oder wegzuschneiden.
Die Augen können dann eine Stunde lang in kalten RPE-Zellkulturmedien gehalten werden. Es wird jedoch bevorzugt, nach der Reinigung des Augapfels direkt mit dem nächsten Schritt fortzufahren. Übertragen Sie die Augen in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das das Enzym A-Lösung enthält, und inkubieren Sie die Augen dann 40 Minuten lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius.
Entfernen Sie die Augen aus der Enzym-A-Lösung und legen Sie sie in ein neues 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das die Enzym-B-Lösung enthält, legen Sie sie dann in einen Inkubator und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 50 Minuten. Entfernen Sie die Augen von Enzym B und legen Sie sie in eine 60-Millimeter-Petrischale und tauchen Sie sie und vervollständigen Sie RPE-Zellwachstumsmedien, dann inkubieren Sie die Augen bei 4 Grad Celsius für 30 Minuten. Stellen Sie die Schale unter das Seziermikroskop und beginnen Sie mit dem Sezieren.
Verwenden Sie eine M5S-Pinzette und eine Nadel einer Spritze, um einen Schnitt im Ora Seratta-Abschnitt zu machen. Fassen Sie nun mit zwei Pinzetten den inneren Teil des Einschnitts mit einer Pinzette und greifen Sie die Hornhaut mit der anderen Zange. Beginnen Sie, die Hornhaut langsam von der Netzhaut zu reißen, indem Sie die Hornhaut ziehen.
Achten Sie darauf, in kleinen Schritten zu reißen und die Träne nach unten zu bewegen, während Sie die Hornhaut entfernen. Dadurch wird sichergestellt, dass der RPE größtenteils intakt bleibt und Sie einen saubereren Riss erhalten. Sobald die Hornhaut vollständig abgelöst ist, sollten Sie die Iris und die Linse sehen können.
Entfernen Sie sowohl die Iris als auch die Linse mit einer Pinzette, um die Reinheit der Isolierung zu erhalten. Um die neuronale Netzhaut von der RPE-Schicht zu entfernen, greifen Sie die äußere Schicht der Augenmuschel mit einer Pinzette und positionieren Sie einen Arm einer zweiten Pinzette zwischen der RPE- und der Neuralschicht. Von dort ziehen oder schöpfen Sie die neuronale Netzhaut vorsichtig von der RPE-Schicht weg und werfen Sie dann die neuronale Netzhaut weg.
Verschieben Sie die RPE-Ebene an eine andere Stelle auf der Schale, frei von Ablagerungen. Um die RPE von Aderhaut und Sklera zu trennen, kratzen Sie die Innenseite der Augenmuschel vorsichtig mit einer 5/45-Pinzette ab, um die Trennung der RPE-Zellen sicherzustellen. Die RPE-Zellen erscheinen trüb, wenn sie suspendiert und vollständig RPE-Zellwachstumsmedien sind.
Die Zellen werden mit einer sterilen 3,2-Milliliter-Transferpipette abgesaugt und in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit kompletten RPE-Zellwachstumsmedien überführt. Die Zellen können bei 300g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert werden. Sie können dann den Überstand aussaugen und das Pellet in erwärmten RPE-Zellwachstumsmedien resuspendieren.
Die Zellen auf eine 100-Millimeter-Petrischale legen und bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 inkubieren. Diese Bilder zeigen eine erfolgreiche Isolierung bei Passage 0 und Passage 1, was sich in der Pigmentierung der RPE-Zellen zeigt. Bei Passage 4 werden die Zellen weniger charakteristisch und weisen weniger Pigment auf, zeigen ein spindelartiges Aussehen oder werden mit einer größeren Oberfläche robuster.
Wir validierten die RPE-Zellen mit einem RPE-spezifischen Marker, RPE65 und einem Zytoskelettprotein F-Aktin. Wir überprüften auch auf eine mögliche Kontamination mit Muller-Zellen durch Färbung mit einem Muller-Zell-spezifischen Marker, Vimentin. Dieses Protokoll ist eine vereinfachte Anpassung bestehender Protokolle.
Das Protokoll verwendet Materialien und zugehörige Geräte, die in den meisten Forschungslabors verfügbar sind, was dazu beiträgt, primäre RPE-Zellen der Maus effektiv zu isolieren.
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Überblick
Diese Studie präsentiert ein vereinfachtes Protokoll zur Isolierung von retinalen pigmentierten Epithel (RPE) Zellen aus Mäuseaugen, die für die Aufrechterhaltung der Photorezeptorfunktion in der Retina entscheidend sind. Die schrittweise Methode umfasst die Augenenucleation, Dissektion und die anschließende Isolierung und Kultivierung von RPE Zellen, um die Forschung zu retinalen Erkrankungen zu erleichtern.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Zellbiologie
- Retinale Gesundheit und Krankheiten
- Isolationstechniken
Hintergrund
- RPE Zellen unterstützen die Erhaltung und Funktion der Photorezeptoren.
- Die primäre RPE Isolierung ist ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung der äußeren Blut-Retina-Schranke.
- Relevanz für Erkrankungen wie altersbedingte Makuladegeneration.
Verwendete Methoden
- Dissektion und enzymatische Behandlung von Mäuseaugen.
- Mausmodellsystem.
- Zellkultur- und Validierungstechniken (RPE65 Marker).
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von RPE Zellen mit erhaltener Pigmentierung und Lebensfähigkeit.
- Nachgewiesene Integrität der RPE Zellen, validiert durch spezifische Marker.
- Übertragung einer vereinfachten Anpassung bestehender Isolierungsprotokolle.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie skizziert eine effektive Methode zur RPE Zellisolierung.
- Das Protokoll kann die Forschung zu retinalen Erkrankungen und zellulären Funktionen in der Biologie verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Isolation of primary mouse retinal pigmented epithelium (RPE) cells enables direct investigation of disease mechanisms and therapeutic responses in ocular research. This protocol supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for retinal disease models, providing a foundation for translational studies and preclinical evaluation. Reliable RPE isolation underpins portfolio decisions in ophthalmic drug discovery by enabling comparative studies across genetic backgrounds and treatment conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of molecular mechanisms underlying RPE pathology in disease-relevant mouse models.
- Supports functional target validation by allowing direct comparison of wild-type and genetically modified RPE cells.
- Facilitates mechanistic de-risking for candidate targets implicated in retinal disorders.
Screening & Assay Development
- Provides a validated primary cell system for downstream drug screening and efficacy testing.
- Ensures reproducibility and standardization through marker-based cell characterization (e.g., RPE65, F-actin).
- Enables quantitative assessment of drug effects on RPE morphology and pigmentation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker studies in retinal degeneration.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling in vitro and ex vivo analyses.
- Reduces biological risk by providing a physiologically relevant system for early efficacy and toxicity assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This RPE isolation protocol fits at the interface of early discovery and preclinical research, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification in ocular drug development.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven studies of RPE function and disease mechanisms.
- Screening: Delivers assay-ready primary cells for reproducible compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative readouts of cell morphology, pigmentation, and marker expression.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo disease models for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol adaptable to various mouse models and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in retinal research.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability across research teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in ophthalmic portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of retinal disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse dissection and primary cell culture techniques.
- Needs access to standard cell culture and imaging instrumentation for validation.
- Demands cross-team standardization of isolation and characterization protocols.
- Adaptable to different mouse genotypes and ocular disease models.
- Limited passage number (up to 3-4) may constrain long-term studies.
