Name: Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie zur extrazellulären Vesikelanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Erfahren Sie die Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie zur Analyse extrazellulärer Vesikel aus Blasenkrebszellen. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Untersuchung von Membranorganisation und Vesikelstruktur.

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Diese Forschung wurde von der slowenischen Forschungsagentur (Forschungskernfinanzierung Nr. P3-0108 und Projekt J7-2594) und das Infrastrukturprogramm MRIC UL IP-0510. Diese Arbeit leistet einen Beitrag zum COST Action CA17116 International Network for Translating Research on Perinatal Derivatives into Therapeutic Approaches (SPRINT), das von COST (European Cooperation in Science and Technology) unterstützt wird. Die Autoren danken Linda Štrus, Sanja Čabraja, Nada Pavlica Dubarič und Sabina Železnik für die technische Hilfe bei der Zellkultivierung und Vorbereitung der Proben und Marko Vogrinc, Ota Širca Roš und Nejc Debevec für die technische Hilfe bei der Vorbereitung des Videos.

1. Kultivierung von Krebs-Urothelzellen und Isolierung von EVs
HINWEIS: Ein Protokoll zur Gewinnung von EVs aus einer humanen invasiven Blasenkrebs-Urothelzelllinie (T24) wird vorgestellt. Die Kultivierungsbedingungen müssen jedoch optimiert werden, um andere Zelltypen zu verwenden.
<ol><li>Platte T24-Zellen mit einer Dichte von 3 × 104 Zellen/cm 2 in drei Kolben (Wachstumsfläche von 75 cm 2) und beginnen mit der Kultivierung der Zellen in einem CO 2 Inkubator für 3 Tage bei 37 °C und einem CO 2 -% (Abbildung 2A). <ol>
<li>Verwenden Sie ein Kulturmedium für T24-Zellen in einer 1:1 (v/v) Mischung aus A-DMEM und F12, ergänzt mit 5% fetalem Rinderserum (FBS), 4 mM Glutamax, 100 mg/ml Streptomycin und 100 U/ml Penicillin. HINWEIS: Die folgende Isolierung ergibt Elektrofahrzeuge, die mit MVs angereichert sind. Bevor Sie mit der Isolierung beginnen, untersuchen Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop, um die Lebensfähigkeit und den Zusammenfluss zu bestätigen (Abbildung 2B). Beginnen Sie mit dem Sammeln der EVs aus den konditionierten Kulturmedien, wenn die T24-Zellen zu 70% zusammenfließen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Das Kulturmedium wird mit MVs mit einer Pipette aus Kolben (T75) in konischen Zentrifugenröhrchen gesammelt (Abbildung 2C). Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 °C (Abbildung 2D).</li>
	<li>Sammeln Sie den Überstand vorsichtig in einem neuen Zentrifugenröhrchen mit der Pipette (Abbildung 2E).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den Überstand bei 2.000 × g für 20 min bei 4 °C.</li>
	<li>Sammeln Sie den Überstand vorsichtig mit der Pipette in ein neues Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Zentrifuge bei 10.000 × g für 40 min bei 4 °C. Achten Sie auf das Vorhandensein eines weißlichen Pellets am Boden der Röhre. HINWEIS: Wechseln Sie bei Bedarf den Zentrifugenrotor, um die erforderliche g-Kraft zu erreichen. Das EV-Pellet ist als weißes Pellet am Boden des Zentrifugenrohrs zu sehen (Abbildung 2F); Markieren Sie seine Position, um zu vermeiden, dass das Pellet während des Pipettierens verloren geht (Abbildung 2G).</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Fügen Sie dem Pellet 1,5 ml PBS hinzu und resuspendieren Sie das Pellet, das MVs enthält. Setzen Sie die Suspension in ein neues Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 10.000 × g für 40 min bei 4 °C und achten Sie auf das Vorhandensein eines weißen Pellets am Boden des Röhrchens. HINWEIS: Das EV-Pellet ist als weißer Fleck am Boden des Zentrifugenröhrchens zu sehen; Markieren Sie seine Position, um zu vermeiden, dass das Pellet während des Pipettierens verloren geht.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Fügen Sie vorsichtig das fixierende, 2,5% ige Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,2) hinzu. 20 Minuten bei 4 °C einwirken lassen (Abbildung 2H). ACHTUNG: Glutaraldehyd und Natriumcacodylat sind giftig. Arbeiten Sie in einer Dunstabzugshaube, tragen Sie Schutzhandschuhe und werfen Sie sie entsprechend ab.</li>
	<li>Entfernen Sie das Fixiermittel vorsichtig mit einer Pipette. Waschpuffer (0,1 M Natriumcacodylatpuffer) in das Pellet geben. 10 min bei 4 °C einwirken lassen, ohne das Pellet wieder auszusetzen.</li>
</ol>2. Einfrieren von Elektrofahrzeugen
HINWEIS: Vor dem Einfrieren die Proben zuerst mit Glycerin kryoschützen.
<ol><li>0,1 M Natriumcacodylatpuffer vorbereiten. Entfernen Sie den Waschpuffer und fügen Sie 50 μL 30% Glycerin in 0,1 M Cacodylatpuffer hinzu. Suspendieren Sie die EVs vorsichtig, um die Lösung homogen zu machen. 30 min bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Reinigen Sie die Kupferträger mit einer zentralen Grube im Ultraschallbad mit Chloroform für 5 min (Abbildung 3A). Trocknen Sie sie an der Luft und markieren Sie sie mit Farben, wenn Sie mehrere Proben verwenden (Abbildung 3B). Bewahren Sie die Träger bis zum Gebrauch an einem trockenen, sauberen Ort auf (z. B. auf Linsenpapier in einer Petrischale). Berühren Sie die Träger nicht mit bloßen Händen.<ol>
<li>Bereiten Sie Pipetten, Lösungen, Filterpapier, Pinzetten, ein Stereomikroskop, einen Dewar-Kolben mit Freon und flüssigem Stickstoff (LN2), einen Metallstab und Kryoviten vor. Kühlen Sie es mit LN2 ab. ACHTUNG: Tragen Sie Schutzausrüstung und arbeiten Sie entsprechend beim Umgang mit LN2 und gekühltem Freon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Setzen Sie die Elektrofahrzeuge vor dem Einfrieren erneut aus. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. HINWEIS: Führen Sie die Schritte 2.4-2.7 schnell aus.</li>
	<li>Arbeiten unter einem Stereomikroskop (Abbildung 3C). Übertragen Sie 1,5-1,7 μl der Probe in die zentrale Grube des Kupferträgers, um einen konvexen Abfall zu erzeugen, der höher als die Kupferträgerkante reicht, ohne die Probe über die Kante zu verschütten (Abbildung 3D). Verwenden Sie im Falle eines Überlaufens Filterpapier, um den äußeren Ring des Trägers zu trocknen.</li>
	<li>Erstarrtes Freon mit einem Metallstab mischen, um es wieder zu verflüssigen (Abbildung 3E).</li>
	<li>Greifen Sie den äußeren Ring des Kupferträgers mit einer Pinzette und tauchen Sie ihn in abgekühltes Freon mit einem sanften Schütteln der Pinzette für 8 s (Abbildung 3F). Nach 8 s schnell den Träger in einen anderen Dewar-Kolben umfüllen, der mit LN2 gefüllt ist.</li>
	<li>Fahren Sie sofort mit dem Brechen oder Lagern der Proben in LN2 fort. Im letzteren Fall markieren Sie ein Kryo und kühlen Sie die Fläschchen- und Pinzettenspitzen ab, indem Sie sie in LN2 eintauchen (Abbildung 3G). Sammeln Sie unter LN 2 gefrorene Kupferträger in die Durchstechflasche, schließen Sie sie und lagern Sie sie im LN2-Behälter (Abbildung 3H), bis sie eingefroren sind.</li>
</ol>3. Fracturing von EVs und Herstellung der Repliken
HINWEIS: Bereiten Sie die Freeze-Fracturing-Einheit gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers vor. (Abbildung 4A). Reinigen Sie die Kammer der Einheit. Positionieren Sie Platin- (Pt/C) und Carbon-Pistolen (C) in Winkeln von 45° bzw. 90° (Abbildung 4B).
<ol><li>Starten Sie das Vakuumsystem der Einheit. Wenn ein Druck von 6,6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr) erreicht ist, kühlen Sie die Gerätekammer auf − 150 °C ab.</li>
	<li>Die Kupferträger mit gefrorenen Proben werden mit einer trockenen Pinzette in eine gefrierbrechende Einheit überführt (Abbildung 4C). Verwenden Sie Kryotransfer oder arbeiten Sie schnell, um das Auftauen der Probe und die Ablagerung der Eiskristalle zu vermeiden. Befestigen Sie die Träger auf dem Probentisch.</li>
	<li>Warten Sie, bis das Vakuum wieder 6,6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr) erreicht, und stellen Sie dann die Messertemperatur auf −100 °C ein (Abbildung 4D).</li>
	<li>Warten Sie, bis das Vakuum 1,0 × 10−3 Pa (8 × 10−6 Torr) erreicht.</li>
	<li>Beobachten Sie die Probe mit einem Fernglas und nähern Sie sich vorsichtig dem Messer (Abbildung 4E).</li>
	<li>Beginnen Sie mit dem Schneiden der Probe, indem Sie die motorisierte Bewegung des Messers (Abbildung 4F) und des Schnitts einschalten, bis die Oberfläche der Probe glatt ist (Abbildung 4G).</li>
	<li>Schalten Sie beim Fracturing die motorisierte Bewegung des Messers aus und fahren Sie mit der langsamen manuellen Steuerung des Messers fort, wodurch die Probe gebrochen wird (Abbildung 4H). Um die zerbrochene Oberfläche vor der Bildung von Eiskristallen und Ablagerungen bis zur Beschattung zu schützen, bewegen Sie das Messer über die gebrochene Probe.</li>
	<li>Fahren Sie mit der Pt-Abschattung bei 45° fort (Abbildung 4I, J).<ol>
<li>Bereiten Sie eine Stoppuhr vor und/oder schalten Sie den Quarzkristallmonitor an der Gefrierbrucheinheit ein, der die Überwachung der Dicke des Pt auf der Probe ermöglicht. Die empfohlene Dicke der Pt-Schicht, gemessen auf dem Quarzkristallmonitor, beträgt 2,5 nm, was 4 s Abschattung bei gegebener hoher Spannung und hohem Strom entspricht (d. h. die Geschwindigkeit der Pt-Abschattung beträgt 0,63 nm/s).</li>
		<li>Bevor Sie mit der Beschattung beginnen, bewegen Sie das Messer von der Probe weg. Wenden Sie eine hohe Spannung auf die Pt/C-Pistole (1.600 V) an und erhöhen Sie den Strom auf 60 mA. Funken von Pt sollten erscheinen und beginnen, die Probe zu überschatten. Starten Sie an dieser Stelle den 4 s Countdown und/oder beobachten und lokalisieren Sie die Position von Pt auf dem Quarzkristallmonitor. HINWEIS: Die empfohlene Dicke der C-Schicht beträgt 2,5 nm, was 10 s Abschattung bei gegebener hoher Spannung und Strömung entspricht.</li>
		<li>Schalten Sie den Strom und die hohe Spannung aus, wenn die gewünschte Dicke von Pt erreicht ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fahren Sie mit der C-Abschattung bei 90° fort (d. h. die Geschwindigkeit der C-Abschattung beträgt 0,25 nm/s).<ol>
<li>Wenden Sie eine hohe Spannung auf die C-Pistole (1.900 V) an, erhöhen Sie den Strom auf 90 mA, und Funken von C sollten erscheinen und beginnen, die Probe zu beschatten; Starten Sie in diesem Moment den 10 S Countdown. Schalten Sie den Strom und die hohe Spannung aus, wenn die gewünschte Dicke von C erreicht ist.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Reinigen der Replikate und Replikatanalyse
<ol><li>Verwenden Sie die Kupferträger aus dem Probentisch und übertragen Sie sie mit einer Pinzette in destilliertes Wasser bei Raumtemperatur in einer Porzellanplatte mit 12 Vertiefungen (Abbildung 4K). Die Repliken schwimmen auf der Wasseroberfläche, während die Träger sinken (Abbildung 4L).</li>
	<li>Übertragen Sie die Repliken mit einer Drahtschleife aus destilliertem Wasser in einen Brunnen mit Natriumhypochlorit. Abdecken und über Nacht bei Raumtemperatur in einem Abzug stehen lassen. ACHTUNG: Natriumhypochlorit ist giftig. Arbeiten Sie in einer Dunstabzugshaube, tragen Sie Schutzhandschuhe und werfen Sie sie entsprechend ab.</li>
	<li>Übertragen Sie die Repliken auf ddH2O und waschen Sie sie für 30 min. Wiederholen Sie dies 3 Mal.</li>
	<li>Übertragen Sie die Repliken mit einer Drahtschlaufe auf ein Kupfer-TEM-Gitter (z. B. quadratisches oder wabenförmiges 100+ Mesh). Trocknen Sie die Gitter 2 h an der Luft und lagern Sie sie dann bis zur Mikroskopie in einer Gitteraufbewahrungsbox. HINWEIS: Im Allgemeinen können Gitter monatelang unter dunklen, trockenen Raumtemperaturbedingungen gelagert werden.</li>
	<li>Verwenden Sie ein TEM-Mikroskop, um die Repliken abzubilden und Mikroaufnahmen zu erhalten.<ol>
<li>Setzen Sie dazu ein TEM-Raster mit einem Nachbau ein und starten Sie die TEM-Bildgebung gemäß den Bedienungsanleitungen des Herstellers. Arbeiten bei 80 kV oder 100 kV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Untersuchen Sie die Probe und erfassen Sie Mikroaufnahmen bei immer niedrigeren Vergrößerungen mit einer Kamera auf TEM.</li>
	<li>Analysieren Sie die Mikroaufnahmen der MVs. Für Messungen der MV-Durchmesser verwenden Sie die Fiji/ImageJ-Software16. Der Durchmesser von MVs beträgt das 4/π-fache der Messung auf den Mikroaufnahmen nach Hallett et al.17.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Die Charakterisierung von MVs oder einer anderen Population isolierter EVs ist von größter Bedeutung, bevor nachgelagerte Analysen wie "Omics" -Studien oder Funktionsstudienbeginnen 11,18. Hierin wurden EVs aus humanen invasiven Blasenkrebs-Urothel-T24-Zellen durch Zentrifugation isoliert, und gemäß dem bereitgestellten Protokoll für die Analyse durch Gefrierbruchelektronenmikroskopie zeigten wir, dass die isolierte Fraktion in MVs11,13 angereichert war. Das Isolat von MVs war frei von Zelltrümmern oder Organellen, was ein erfolgreiches Isolations- und Reinigungsprotokoll bestätigt.
Die Kombination aus chemischer Fixierung und Einfrieren, die kritische Schritte des Protokolls sind, behielt die kugelförmige Form der EVs12 bei. Bei der Beurteilung des EV-Durchmessers durch Gefrierbruch17 sind jedoch Vorsichtsmaßnahmen erforderlich. Da die Fraktur die Probe zufällig durchläuft, werden MV-Membranen in ihre äquatoriale und nicht-äquatoriale Ebene aufgeteilt. Um eine rigorose Methode zur Analyse der Bilder von gefriergebrochenen und beschatteten Proben bereitzustellen, zeigten Hallett et al., dass der mittlere Vesikeldurchmesser das 4/π-fache der tatsächlichen Größe des vesikulären Durchmessers auf dem Bild17 beträgt. Unter Berücksichtigung dessen wurden EVs aus T24-Zellen mit einem Durchmesser von 304 nm berechnet, was in den theoretischen Größenverteilungsbereich des MV von 100-1000 nm19 passt.
Freeze-Fracturing kann die negative Färbung ergänzen, die am häufigsten verwendete TEM-Technik zur Visualisierung von Elektrofahrzeugen. Durch negative Färbung wird die Probe üblicherweise chemisch fixiert, getrocknet und an ein TEM-Gitter gebunden und mit Uranyllösung kontrastiert. Ohne unterstützende Medien neigen Elektrofahrzeuge dazu, zusammenzubrechen, was ihnen ein becherförmiges Aussehen verleiht. Durch Gefrierbruch zeigen wir, dass MVs Kugeln sind, die ihre Form in extrazellulären Räumen und Körperflüssigkeitenwiderspiegeln 12. Damit stimmen unsere Ergebnisse auch mit Beobachtungen von EVs in kryoultradünnen Abschnittenüberein 20.
Ein entscheidender Vorteil der Gefrierbruchtechnik ist ihre Fähigkeit, die innere Organisation der begrenzenden Membran aufzulösen, was ein Schlüsselfaktor für das Verständnis ist, wie EVs auf Empfängermembranen abzielen und mit ihnen interagieren. Hier analysierten wir die Membranen von MVs, aber Freeze-Fracturing könnte die Membranorganisation jeder anderen Population von EVs aufdecken. MVs werden durch Plasmamembranknospen gebildet; Daher wird erwartet, dass Plasmamembranproteine und Proteincluster in der MV-Membran gefunden werden. Unsere Ergebnisse bestätigten, dass die MVs aus T24-Zellen Intramembranpartikel enthielten, die integrale Membranproteine präsentierten. Basierend auf der Partikelverteilung zwischen der E-Fläche und der P-Fläche ist es vernünftig zu erwarten, dass die in MVs beobachteten Partikel Transmembranprotein-Uroplakine sind, die urothelzellspezifischsind 21,24. Die beobachteten Partikel waren spärlich, was im Einklang mit früheren Studien steht, die eine Reduktion der Uroplakins während der Urothelkarzinogenese berichteten21,22,23. Um die Proteinzusammensetzung von MV-Membranen weiter zu untersuchen, wird jedoch die Verwendung der FRIL-Technik (Freeze-Fracture Replica Immune-Labeling) empfohlen. FRIL ist eine Weiterentwicklung der vorgestellten Gefrier-Fraktur-Technik und widmet sich der Aufdeckung der Identität von Proteinen in Replikaten durch Antikörpererkennung24,25. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Gefrierbruchtechnik eine elektronenmikroskopische Technik ist, die für die Charakterisierung der EV-begrenzenden Membran sowie der Form, Größe und Reinheit der isolierten EV-Fraktionen geeignet ist. Das vorgestellte Protokoll kann auch für die Bewertung anderer Populationen isolierter Elektrofahrzeuge verwendet werden; Daher verdient die Gefrier-Frakturing-Technik die Aufnahme in die Richtlinien der International Society for Extracellular Vesicles für Studien, die die Organisation von EV-begrenzenden Membranen untersuchen.

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membranbegrenzte Vesikel, die von Zellen in den extrazellulären Raum freigesetzt werden. Die drei Hauptpopulationen von EVs sind Exosomen, Mikrovesikel (MVs) und apoptotische Körper, die sich in ihrem Ursprung, ihrer Größe und ihrer molekularen Zusammensetzung unterscheiden 1,2,3. Die Zusammensetzung der EVs spiegelt das molekulare Profil der Spenderzelle und ihren physiologischen Status (d. h. gesund oder krank) wider4,5. Dies gibt EVs ein immenses Potenzial in der Diagnose, Prognose und Therapie menschlicher Krankheiten, und sie haben vielversprechende medizinische Anwendungen für den Einsatz in der personalisierten Medizin 6,7,8.
EVs sind Mediatoren der interzellulären Kommunikation. Sie enthalten biologisch aktive Proteine, Lipide und RNAs, die in biologische Prozesse in der Empfängerzelle eingreifen und ihr Verhalten verändernkönnen 9,10. Die Zusammensetzung der EV-begrenzenden Membran ist jedoch entscheidend für die Interaktion mit der Empfängerzellmembran.
Die Quellen von Elektrofahrzeugen sind Körperflüssigkeiten und konditionierte Kulturmedien. Um eine EV-Population zu isolieren, muss eine geeignete Isolationstechnik verwendet werden. Zum Beispiel ergibt die Zentrifugation bei 10.000 × g einen in MVs angereicherten Bruchteil, während Zentrifugalkräfte von ≥100.000 × g einen in Exosomen11,12 angereicherten Bruchteil ergeben. Der isolierte Anteil von Elektrofahrzeugen muss in Bezug auf Reinheit, Größe und Form validiert werden. Zu diesem Zweck empfahl die International Society for Extracellular Vesicles2018 drei Klassen hochauflösender bildgebender Verfahren: Elektronenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie und lichtmikroskopische hochauflösende Mikroskopie 13. Keine dieser Techniken kann Informationen über das Innere der EV-Membran liefern.
Die Gefrierbruchelektronenmikroskopie ist eine Technik, bei der gefrorene Proben gebrochen werden, um ihre inneren Strukturen aufzudecken, insbesondere einen Blick auf das Innere der Membran zu werfen. Die Schritte der Probenvorbereitung sind (1) schnelles Einfrieren, (2) Frakturieren, (3) Herstellung der Replik und (4) Reinigen der Replik14. In Schritt 1 wird die Probe (optional) chemisch fixiert, mit Glycerin kryogeschützt und in flüssigem Freon eingefroren. In Schritt 2 wird die gefrorene Probe in einer Gefrierbrucheinheit gebrochen, die das Innere der Membrandoppelschicht freilegt. In Schritt 3 werden die freiliegenden gebrochenen Flächen mit Platin (Pt) und Kohlenstoff (C) beschattet, um Repliken herzustellen. In Schritt 4 wird das organische Material entfernt. Der Nachbau wird im Transmissionselektronenmikroskop (TEM) analysiert. Für eine genaue Interpretation der Mikroaufnahmen muss man die Richtlinien für ihre richtige Orientierung befolgen14,15. Kurz gesagt, die Richtung der Schatten in der Mikroaufnahme ist eine Referenz, um die Mikroaufnahme zu orientieren (d.h. die Richtung der Pt-Schattierung zu bestimmen) und folglich konvexe und konkave Formen zu bestimmen (Abbildung 1). Zwei Innenansichten, die als gebrochene Flächen der Membrandoppelschicht bezeichnet werden, können als Ergebnis der Spaltung der Membran durch Gefrierbruch gesehen werden: die protoplasmatische Fläche (P-Fläche) und die exoplasmatische Fläche (E-Fläche). Die P-Fläche stellt das Membranblättchen neben dem Zellprotoplasma dar, während die E-Fläche das Membranblättchen neben dem extrazellulären Raum darstellt. Integrale Membranproteine und ihre Assoziationen werden als hervorstehende Intramembranpartikelgesehen 14,15.
Hier besteht das Ziel darin, die Gefrierbruchtechnik anzuwenden, um MVs in Bezug auf Größe, Form und die Struktur ihrer begrenzenden Membran zu charakterisieren. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Gefrierfrakturierung von MVs vor, die aus humanen invasiven Blasenkrebs-Urothelzellen stammen.

<table><tbody><tr><td>A-DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific, USA</td><td>12491015</td><td></td></tr><tr><td>Balzers Gefrierfrakturgerät</td><td>Balzers AG, Liechtenstein</td><td>Balzers BAF 200</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf, Deutschland</td><td>Modell 5810R</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Inkubator HeraCell&nbsp;</td><td>Heraues, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kupferträger</td><td>Balzers</td><td>BB 113 142-2</td><td>100+ Mesh</td></tr><tr><td>Kupfergitter</td><td>SPI, USA</td><td>2010C</td><td></td></tr><tr><td>Kulturkolben T75</td><td>TPP, Schweiz</td><td></td><td>Wachstumsfläche 75 cm2</td></tr><tr><td>F12 (HAM)</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>21765029</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, Life Technologies, USA</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Glasierte Porzellanplatte 6 Well</td><td>Fischer Sientific, Vereinigte Staaten</td><td>50-949-072</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Kemika, Kroatien</td><td>711901</td><td>Endkonzentration 30 % (v/v)</td></tr><tr><td>Glutaradehyd&nbsp;</td><td>Serva, Deutschland</td><td>23114.01</td><td>Endkonzentration 2,5 % (v/v)</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>35050-079</td><td>Endkonzentration 4 mM</td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15140163</td><td>Endkonzentration 100 U/ml</td></tr><tr><td>Phasenkontaminiertes inverses Mikroskop</td><td>Nikon, Japan</td><td>Modell Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Eppendorf, Deutschland</td><td>A 4-44</td><td></td></tr><tr><td>Rotor&nbsp;</td><td>Eppendorf, Deutschland</td><td>F-34-6-38</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten</td><td>TPP, Schweiz</td><td></td><td>50 ml Volumen</td></tr><tr><td>Natriumhypochloridlösung in Wasser</td><td>Carlo Erba, Italien</td><td>481181</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>35050038</td><td>Endkonzentration 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop</td><td>Philips, Niederlande</td><td>Modell CM100</td><td>mit 80 kV</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>SPI, USA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gefrierbruch-elektronenmikroskopie zur extrazellulären vesikelanalyse

Freeze-Fracture Electron Microscopy for Extracellular Vesicle Analysis

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membranbegrenzte Strukturen, die von den Zellen in den extrazellulären Raum freigesetzt werden und an der interzellulären Kommunikation beteiligt sind. EVs bestehen aus drei Populationen von Vesikeln, nämlich Mikrovesikeln (MVs), Exosomen und apoptotischen Körpern. Die begrenzende Membran von EVs ist entscheidend an den Interaktionen mit den Empfängerzellen beteiligt, was zur Übertragung von biologisch aktiven Molekülen auf die Empfängerzellen führen und folglich deren Verhalten beeinflussen könnte. Die Gefrier-Bruch-Elektronenmikroskopie-Technik wird verwendet, um die innere Organisation biologischer Membranen zu untersuchen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die MV-Isolierung aus kultivierten Krebs-Urothelzellen und die Gefrierfraktur von MVs in den Schritten des schnellen Einfrierens, Frakturierens, Herstellens und Reinigens der Repliken und deren Analyse mit Transmissionselektronenmikroskopie. Die Ergebnisse zeigen, dass das Protokoll zur Isolierung eine homogene Population von EVs ergibt, die der Form und Größe von MVs entsprechen. Intramembranpartikel befinden sich hauptsächlich in der protoplasmatischen Fläche der begrenzenden Membran. Daher ist die Gefrierfraktur die Technik der Wahl, um den Durchmesser, die Form und die Verteilung der Membranproteine der MVs zu charakterisieren. Das vorgestellte Protokoll gilt für andere Populationen von Elektrofahrzeugen.

MVs wurden nach differentiellen Zentrifugationen aus dem konditionierten Medium der Krebsurothel-T24-Zellen isoliert. Nach dem Protokoll wurde die EV-Fraktion erstmals nach der Zentrifugation bei 10.000 × g nachgewiesen, wenn sie als weißes Pellet gesehen wurde (Abbildung 2G).
Als nächstes wurden die EVs nach dem obigen Protokoll verarbeitet und unter TEM untersucht. Pt/C-Shadowing erzeugte (Abbildung 4L) relativ große Repliken, die während des Reinigungsschritts häufig in kleinere Fragmente zerfielen. Große Repliken und ihre kleineren Fragmente wurden auf dem TEM-Gitter aufgenommen und unter dem Mikroskop verglichen. Die Ergebnisse zeigten keine Unterschiede in der Qualität der Replikatoberflächen, unabhängig von ihrer Größe, und sie können daher alle verwendet werden. Untersuchungen mit geringer Vergrößerung zeigten Regionen der Replik mit i) einer homogenen Oberfläche (Hintergrund), ii) konkaven und konvexen sphärischen Profilen (Vesikel) und iii) Regionen beschädigter Oberfläche (Artefakte; Abbildung 5A). Typische Artefakte wurden als Brüche, Falten und unregelmäßige dunklere Schatten angesehen (dh Nachbildungen von Eiskristallablagerungen auf dem Exemplar). Es ist auch wichtig zu beachten, dass keine Zelltrümmer oder Zellorganellen gesehen wurden, was die Reinheit der Probe bestätigt (Abbildung 5B).
Die isolierten Vesikel wurden üblicherweise entweder in Dreier- oder Mehrergruppen gesammelt oder einzeln verteilt (Abbildung 5B). Die Vesikel waren kugelförmig, was auf eine gute Erhaltung der Ultrastruktur während der Isolierung, Fixierung und des Einfrierens hinweist (Abbildung 5C). "Flachkugelförmige" und längliche Vesikel (Abbildung 5C), die gelegentlich gesehen wurden, waren vermutlich Artefakte der Vorbereitung und wurden bei den nachfolgenden Messungen des Vesikeldurchmessers nicht berücksichtigt. Der Durchmesser der sichtbaren Profile betrug 238,5 nm (±8,0 nm, n = 190), was unter Berücksichtigung des von Hallett et al.17 vorgeschlagenen Korrekturfaktors dem mittleren Vesikeldurchmesser von 304 nm (±10 nm; Abbildung 5D). Die Größe korreliert mit einem Durchmesserbereich von MVs zwischen 100 nm und 1000 nm und belegt die Wirksamkeit des verwendeten Isolationsprotokolls. Die Bilder der Vesikel zusammen mit der Durchmesserbestimmung bestätigten eindeutig, dass die EVs im Isolat mit MVs angereichert waren.
Die Analyse der Repliken ergab die Organisation von P-Face und E-Face der MV-Grenzmembranen. MVs wurden als konkave und konvexe runde Formen beobachtet (Abbildung 5C, E, F), die die Bruchebene widerspiegeln. Die konvexen Formen stellen E-Flächen dar (d. h. gebrochenes exoplasmatisches Blatt der Membranen; Abbildung 5E). Die exoplasmatischen Gesichter der EVs hatten ein glattes, einheitliches Aussehen. Die konkaven Formen entsprechen P-Flächen (Abbildung 5F). In den P-Flächen wurden einige hervorstehende Intramembranpartikel innerhalb glatter Membranen gesehen (Abbildung 5C,F). Dies bedeutet, dass MVs, die aus Krebs-Urothel-T24-Zellen isoliert wurden, nur eine geringe Menge an Membranproteinen enthalten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Membranbestimmung nach dem Gefrierbrechen . (A) Mikrovesikel knospen von der Plasmamembran in den extrazellulären Raum. (B) Mikrovesikel wird mit P- und E-Membran-Blättchen bis zur Gefrierfraktionierung begrenzt, wodurch die Blättchen gespalten werden und die Innenansichten von Blättchen, die als gebrochene Flächen bezeichnet werden, freigelegt werden. (C) Nach der Pt/C-Beschattung sind zwei gebrochene Flächen erkennbar: die protoplasmatische Fläche (P-Fläche) mit einer konvexen Form, die dem Zytoplasma zugewandt ist (Protoplasma) und eine exoplasmatische Fläche (E-Fläche) mit einer konkaven Form, die dem extrazellulären Raum zugewandt ist. Abbildung 1 wurde mit Biorender.com erstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig02.jpg"> Abbildung 2: Isolierung von EVs. (A) T24-Zellen, die in einem CO 2-Inkubator gezüchtet wurden, werden mit (B) einem Lichtmikroskop untersucht, um ihre Lebensfähigkeit und ihren Zusammenfluss vor der MV-Isolierung zu bestätigen. (C) Das Zellkulturmedium wird gesammelt und (D) bei jeder Sammlung des Überstands bei 300 × g und bei 2.000 × g (E) nacheinander zentrifugiert. (F,G) Nach der Zentrifugation bei 10.000 × g ist ein weißer Fleck, der auf ein Pellet hinweist, sichtbar und markiert. Der Überstand wird entfernt und (H) Fixiermittel wird vorsichtig in das Pellet gegeben, ohne es wieder zu suspendieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig03.jpg"> Abbildung 3: Einfrieren von Elektrofahrzeugen. (A) Luftgetrocknete, saubere Kupferträger mit einer zentralen Grube werden vor der Verarbeitung (B) markiert. Mikrovesikel werden in Glycerin resuspendiert, um eine homogene Probe zu erhalten, und (C) zu einer zentralen Grube eines Küferträgers unter einem Stereomikroskop gegeben. (D) Man muß ein Volumen der Probe hinzufügen, so daß es in der zentralen Grube einen konvexen Tropfen bildet. (E) Unmittelbar vor dem Einfrieren LN2-gekühltes Freon mit einem Metallstab mischen, um das Freon zu verflüssigen. (F) Die Probe wird eingefroren, indem sie in Freon eingetaucht wird, und dann (G) in LN2 übertragen. (H) Träger mit der gefrorenen Probe können in Kryovials gesammelt und in einem LN2 Dewar-Behälter gelagert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig04.jpg"> Abbildung 4: Gefrierfrakturieren und Erstellen einer Replik . (A) Gefrier-Fracturing-Einheit. In der Einheitskammer (B) befindet sich eine Platin- (Pt) und Kohlenstoff- (C) Elektronenkanone, ein Messer und der Probentisch. (C) Um mit dem Frakturieren zu beginnen, werden die Träger mit der Probe auf den Probentisch übertragen, (D) die Gefrierfrakturierungseinheit wird gekühlt und ein Vakuum hergestellt. (E) Das Schneiden erfolgt durch motorisierte (F) Bewegung des Messers, aber das Brechen erfolgt vorzugsweise manuell. (G) Probe vor dem Schneiden und (H) nach dem Frakturieren. (I) Unmittelbar nach dem Brechen wird die Replik hergestellt. (J) Während dieses Vorgangs wird Pt auf der Probe schattiert. Platinschattierung wird als helles Licht (Funken) in der Kammer gesehen. (K) Die Probenträger werden in einem mit Wasser gefüllten Porzellanbrunnen gesammelt. (L) Nachbildung (Pfeil), die während des Reinigungsschritts in der Natriumhypochloritlösung schwimmt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63550/63550fig05.jpg"> Abbildung 5: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von gefriergebrochenen und Pt/C-beschatteten MVs. (A) Eine Übersicht über das gefriergebrochene und schattierte EV-Pellet (i) bei geringerer Vergrößerung. Die homogene Oberfläche ist Hintergrund (ii), helle Bereiche sind Brüche in den Repliken (iii), dunklere Bereiche sind Falten von Repliken (Sternchen) und unregelmäßige dunklere Schatten sind auf Eiskristalle zurückzuführen (zwei Sternchen). (B) Cluster von runden EVs mit konkaven und konvexen Oberflächen. (C) Hohe Vergrößerung von Elektrofahrzeugen. In konvexen Brüchen, die P-Fläche der EV-Membranen aufweisen, sind Intramembranpartikel (Pfeile) und Flecken einer glatten Oberfläche (Pfeilspitzen) zu sehen. Extrazelluläre Vesikel mit länglichen (Stern) und flachen Kugelformen (zwei Sterne) werden gefunden. (D) Der mittlere Durchmesser isolierter urothelialer MVs beträgt 304 nm ± 10 nm gemäß den von Hallett et al.17 vorgeschlagenen Größenmessungen. Die Daten werden als Mittelwert ± REM dargestellt. (E,F) E-Fläche und P-Fläche von MVs. Legende: Pfeile = Intramembranpartikel in P-Fläche, eingekreiste Pfeile = die Richtung der Pt/C-Abschattung. Skalenbalken: A = 10 μm, B-F = 400 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63550/63550fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Wir stellen ein Protokoll zur Isolierung und Gefrierfraktur von extrazellulären Vesikeln (EVs) vor, die aus krebsartigen Urothelzellen stammen. Die Gefrierbruchtechnik enthüllte den Durchmesser und die Form der EVs und - als einzigartiges Merkmal - die innere Organisation der EV-Membranen. Diese sind von immenser Bedeutung, um zu verstehen, wie Elektrofahrzeuge mit den Empfängermembranen interagieren.

Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie zur extrazellulären Vesikelanalyse

Extracellular vesicles (EVs) are membrane-limited structures released from the cells into the extracellular space and are implicated in intercellular ...

Im Video stellen wir ein Protokoll für die Gefrierfrakturierung von extrazellulären Vesikeln vor, die aus Blasenkrebszellen in vitro stammen. Extrazelluläre Vesikel sind membranbegrenzte Vesikel, die von Zellen abgeleitet werden, in den extrazellulären Raum freigesetzt werden und eine Rolle in der interzellulären Kommunikation spielen. Innerhalb extrazellulärer Vesikel unterscheiden wir drei Populationen, Exosomen, Mikrovesikel und apoptotische Körper, die sich durch ihren Ursprung, ihre Größe und ihre molekulare Zusammensetzung unterscheiden.Die molekulare Zusammensetzung extrazellulärer Vesikel spiegelt das molekulare Profil der Spenderzelle wider und stört biologische Prozesse in der Empfängerzelle. Die Zusammensetzung der begrenzenden Membran zellulärer Vesikel ist jedoch entscheidend für die Interaktion mit der Empfängerzellmembran. Um die Organisation der begrenzenden Membran zu analysieren, müssen extrazelluläre Vesikel zuerst isoliert und dann an die Gefrier-Fraktur-Technik herangeführt werden.Freeze-Fracture ist eine elektronenmikroskopische Technik, die sich der Untersuchung der zweidimensionalen Organisation biologischer Membranen, einschließlich Vesikeln, widmet. Die Schritte des Gefrierbrechens sind das schnelle Einfrieren der Probe, das Brechen der Probe, das Erstellen der Nachbildung der gefrorenen gebrochenen Oberfläche und das Reinigen der Replik, um biologische Materialien zu entfernen. Nachbildungen werden schließlich mit dem Transmissionselektronenmikroskop visualisiert.Unser Ziel war es, die Gefrierbruchtechnik zu verwenden, um Mikrovesikel in Bezug auf Form, Größe und Zusammensetzung der Membran zu charakterisieren. Beginnen Sie mit dem Wachstum von Zellen im Zellinkubator. Untersuchen Sie Zellen unter dem Mikroskop, um ihre Variabilität und Konfluenz zu bestätigen.Sammeln Sie Kulturmedien mit Mikrovesikeln in Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 300 g-Kräften für 10 Minuten. Sammeln Sie Überstände. Anschließend Zentrifugenüberstand bei 2000 g-Kräften und 10.000 g-Kräften.Danach beobachten Sie die Spitze der Röhre für ein weißliches Pellet, das Mikrovesikel anzeigt. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Fügen Sie 1,5 Milliliter PBS hinzu und suspendieren Sie das Pellet mit Mikrovesikeln erneut.Dann zentrifugieren Sie bei 10.000 g-Kräften. Achten Sie auf das weißliche Pellet. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie vorsichtig Fixiermittel hinzu.20 Minuten bei 4 Grad Celsius stehen lassen. Als nächstes entfernen Sie das Fixiermittel und fügen Sie Waschpuffer hinzu, um das Pellet zu spülen, ohne es erneut auszusetzen. 10 Minuten bei 4 Grad Celsius stehen lassen.Entfernen Sie den Waschpuffer und fügen Sie 30% Glycerin zum Pellet hinzu. Pellet wieder in homogene Suspension suspendieren und 30 Minuten bei 4 Grad Celsius inkubieren. Bereiten Sie saubere Kupferträger mit einer mittleren Grube vor und entwickeln Sie einen Kolben mit Stirnrunzeln und flüssigem Stickstoff.Übertragen Sie die Probe unter dem Mikroskop in die mittlere Grube des Kupferträgers. Mischen Sie erstarrtes Freon, um verflüssigt zu werden. Greifen Sie den äußeren Ring des Trägers mit einer Pinzette und tauchen Sie ihn in gekühltes Freon.Nach acht Sekunden wird der Träger schnell in den Entwicklungskolben mit flüssigem Stickstoff überführt. Mark Kryo abscheulich und kühle es. Unter flüssigem Stickstoff sammeln Sie die Träger in das Abwesen, schließen Sie es und lagern Sie es im flüssigen Stickstoffbehälter, bis das Frakturieren einfriert.Bereiten Sie die Gefrierfraktionseinheit gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers vor. Starten Sie das Vakuumsystem und kühlen Sie die Gerätekammer auf minus 150 Grad Celsius ab. Kupferträger mit gefrorener Probe in die Gefrierfraktionierungseinheit überführen.Stellen Sie die Messertemperatur auf minus 100 Grad Celsius ein und warten Sie auf das Vakuum. Beginnen Sie mit dem Schneiden der Probe, indem Sie die motorisierte Bewegung des Messers einschalten, bis die Oberfläche der Probe glatt ist. Für das Fracturing schalten Sie die motorisierte Bewegung des Messers aus und fahren Sie mit der langsamen manuellen Steuerung des Messers fort.Fahren Sie mit der Platinschattierung im 45-Grad-Winkel fort. Schalten Sie die Hochspannung ein und erhöhen Sie den Strom zur Platinpistole. Platinfunken sollten beginnen, die Probe zu überschatten.Überwachen Sie die Position von Platin auf dem Quarzkristalldickenmonitor. Die empfohlene Dicke von Platin beträgt 2,5 Nanometer. Schalten Sie Strom und hohe Spannung aus.Fahren Sie mit der Kohlenstoffbeschattung in einem Winkel von 90 Grad fort. Schalten Sie die Hochspannung ein und erhöhen Sie den Strom für die Carbonpistole. Funken von Kohlenstoff sollten beginnen, die Probe zu beschatten.Wenn 2,5 Nanometer Kohlenstoff erhalten werden, schalten Sie den Strom und die hohe Spannung aus. Übertragen Sie diese Proben mit den Repliken von der Gefrierbrucheinheit auf eine 12-Ventil-Platte, die mit doppelt destilliertem Wasser gefüllt ist. Repliken schwimmen auf der Wasseroberfläche, während die Träger sinken.Übertragen Sie Repliken mit Drahtschlaufe auf eine mit Natriumhypoclorit gefüllte 12-Ventilplatte und inkubieren Sie über Nacht. Repliken in doppelt destilliertem Wasser waschen. Sammeln Sie sie auf einem Mesh-Kupfer-TM-Rost und lassen Sie sie zwei Stunden an der Luft trocknen.Verwenden Sie ein Transmissionselektronenmikroskop, um Repliken abzubilden und mikroskopische Aufnahmen zu erhalten. Für eine genaue Interpretation von Repliken und Mikrographien befolgen Sie die Richtlinien für die richtige Orientierung in der Nomenklatur. Analysen von Repliken zeigten, dass isoliertes konditioniertes Medium eine angereicherte Fraktion von Vesikeln enthielt.Isolierte Vesikel wurden entweder in Dreier- oder Mehrergruppen gesammelt oder sehr einzeln verteilt. Die Vesikel waren kugelförmig. Der Durchmesser der Vesikel entsprach dem Durchmesser der Mikrovesikel.Freeze-Fracturing zeigte auch eine zweidimensionale Organisation der Mikrovesikelmembran. Die exoplasmatische Phase der Mikrovesikel hatte ein glattes, gleichmäßiges Aussehen, während wir in der Protoplastenphase Intermembranpartikel beobachteten. Intermembranpartikel traten sporadisch auf, was bedeutet, dass Mikrovesikel, die aus Krebsmaterialzellen isoliert wurden, nur eine geringe Menge an Membranproteinen oder Proteinanordnungen enthalten.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die im vorgestellten Protokoll verwendete Gefrier-Fraktur-Technik als optimale Technik zur Charakterisierung extrazellulärer Vesikel erweist und zur Bewertung anderer Populationen extrazellulärer Vesikel verwendet werden kann. Ein entscheidender Vorteil der Gefrierbruchtechnik ist ihre Fähigkeit, die innere Organisation der vesikelbegrenzenden Membran aufzulösen, die die biologische Funktion extrazellulärer Vesikel bestimmt.

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Forschung

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Krebsforschung

Quelle: Biller, S. J., et al. Isolierung und Charakterisierung cyanobakterieller extrazellulärer Vesikel. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt die Präparation von extrazellulären Cyanobakterienvesikeln für die Transmissionselektronenmikroskopie durch Negativfärbung, die eine hochauflösende Visualisierung der Vesikelmorphologie, -größe und -reinheit für strukturelle und vergleichende Analysen ermöglicht.

Visualisierung cyanobakterieller extrazellulärer Vesikel mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Grundlegende Techniken und Ausgestaltungen der Gefrierbruch-Verarbeitung von biologischen Proben und Nanomaterialien für die Prüfung durch Transmissionselektronenmikroskopie beschrieben. Diese Technik ist eine bevorzugte Methode für die Entdeckung ultrastrukturelle Merkmale und Spezialisierungen von biologischen Membranen und für den Erhalt von ultrastruktureller Ebene dimensionale und räumliche Daten in den Materialwissenschaften und der Nanotechnologie-Produkte.

Technische Grundlagen Elemente der Gefrierbruch-/ Gefrier Etch in Biological Elektronenmikroskopie

Diese Handschrift beschreibt eine einfach zu bedienende und kostengünstige Methode zum Kryofixation Suspensionszellen durch Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar zu machen.

Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie

Das Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Verwendung mit Zelle Kultur Überstände, Oberfläche Epitope auf kleine extrazelluläre Vesikel (EV) zu erkennen. Es nutzt spezifische EV Immunopräzipitation mit Perlen mit Antikörpern, die Oberflächenantigen CD9, erkennen CD63 und CD81 gekoppelt. Die Methode ist für nachgeschaltete Flow Cytometry Analyse optimiert.

Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien

Zur etikettenfreien Immobilisierung von Exosomen und extrazellulären Vesikeln aus flüssigen Proben und deren Bildgebung mittels Atomkraftmikroskopie (AFM) wird ein Schritt-für-Schritt-Verfahren beschrieben. Die AFM-Bilder werden verwendet, um die Größe der Vesikel in der Lösung zu schätzen und andere biophysikalische Eigenschaften zu charakterisieren.

Bildgebung von extrazellulären Vesikeln durch Atomkraftmikroskopie

Hier legen wir ein leicht anwendbares Protokoll vor, um die Speicherstabilität von extrazellulären Bläschen zu beurteilen, einer Gruppe natürlich vorkommender Nanopartikel, die von Zellen produziert werden. Die Vesikel werden als Modellenzym mit Glucuronidase beladen und unter unterschiedlichen Bedingungen gelagert. Nach der Lagerung werden ihre physikalisch-chemischen Parameter und die Aktivität des verkapselten Enzyms ausgewertet.

Bewertung der Speicherstabilität von extrakellulären Bläschen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Kennzeichnung von extrazellulären Vesikeln aus Thrombozytenlysat vor, um ihre Migration und Aufnahme in Knorpelexplantaten zu überwachen, die als Modell für Osteoarthritis verwendet werden.

Markierung extrazellulärer Vesikel zur Überwachung der Migration und Aufnahme in Knorpelexplantaten

Die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) wird verwendet, um die typische Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie zu umgehen und Exosomen auf der Nanometerskala zu betrachten. Es kann sowohl in zwei als auch in drei Dimensionen eingesetzt werden, um Exosomen zu charakterisieren.

Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie extrazellulärer Vesikel in drei Dimensionen

In diesem Artikel wird eine neue Generation multiparametrischer Analyseplattformen mit erhöhtem Durchsatz für die Charakterisierung von extrazellulären Vesikel-Untergruppen vorgeschlagen. Die Methode basiert auf einer Kombination von gemultiplexten Biosensormethoden mit metrologischen und morphomechanischen Analysen durch Rasterkraftmikroskopie, gekoppelt mit Raman-Spektroskopie, um vesikuläre Ziele zu qualifizieren, die auf einem Microarray-Biochip gefangen sind.

Multimodale Analyseplattform auf einem Multiplex-Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie-Chip zur Analyse extrazellulärer Vesikel-Untergruppen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskeln und Knochenmark mittels enzymatischer Verdauung und Größenausschlusschromatographie, wodurch reproproduzierbare Rückgewinnung von vesikelangereicherten Fraktionen aus strukturell komplexen, leistungsarmen Geweben für die nachgelagerte molekulare Analyse ermöglicht wird.

Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskulatur und Knochenmark mittels Größenausschlusschromatographie

Erfahren Sie die Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie zur Analyse extrazellulärer Vesikel aus Blasenkrebszellen. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Untersuchung von Membranorganisation und Vesikelstruktur.

Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie zur extrazellulären Vesikelanalyse

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