Name: Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Lernen Sie die Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen für Immunologie und Zellbiologie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung bidirektionaler Interaktionen zwischen Epithel- und Immunzellen.

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E.R. bestätigt ein Ph.D. Stipendium des Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. würdigt ein Ph.D. Stipendium des Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. erkennt eine Doktorandenschaft von der NIHR GSTT BRC an. J.F.N. würdigt ein Marie-Skłodowska-Curie-Stipendium, ein King's Prize-Stipendium, ein RCUK/UKRI Rutherford Fund-Stipendium (MR/R024812/1) und einen Seed Award in Science vom Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Wir danken auch dem BRC-Durchflusszytometrie-Kernteam am Guy's Hospital. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 Reportermäuse waren ein großzügiges Geschenk von G. Eberl (Institut Pasteur, Paris, Frankreich). CD45.1 C57BL/6 Mäuse wurden freundlicherweise von T. Lawrence (King's College London, London) und P. Barral (King's College London, London) gegeben.

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<li>Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cell-epithelial+cell+modules+sustain+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis.</a> Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).</li>
<li>Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells%3A+major+players+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).</li>
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<li>Klose, C. S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+type+1+ILCs+from+a+common+progenitor+to+all+helper-like+innate+lymphoid+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages.</a> Cell. 157 (2), 340-356 (2014).</li>
<li>Bernink, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-12+and+-23+control+plasticity+of+CD127%2B+group+1+and+group+3+innate+lymphoid+cells+in+the+intestinal+lamina+propria%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria.</a> Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).</li>
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<li>Hoyler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+GATA-3+controls+cell+fate+and+maintenance+of+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells.</a> Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-25-responsive%2C+lineage-negative+KLRG1hi+cells+are+multipotential+%27inflammatory%27+type+2+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells.</a> Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).</li>
<li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529, 221-225 (2016).</li>
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<li>Eberl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+function+for+the+nuclear+receptor+RORgamma%28t%29+in+the+generation+of+fetal+lymphoid+tissue+inducer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells.</a> Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).</li>
<li>Spits, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells--a+proposal+for+uniform+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature.</a> Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).</li>
<li>Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+lymph+nodes+collect+CD4%2BCD3-+LTbeta%2B+cells+that+can+differentiate+to+APC%2C+NK+cells%2C+and+follicular+cells+but+not+T+or+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells.</a> Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).</li>
<li>Lindemans, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+promotes+intestinal-stem-cell-mediated+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration.</a> Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).</li>
<li>Meininger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+features+of+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific features of innate lymphoid cells.</a> Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).</li>
<li>Dutton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+innate+lymphoid+cell+populations+at+different+sites+in+mice+with+defective+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity.</a> Wellcome Open Research. 2, 117(2018).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Etablierung von murinen Dünndarmorganoiden, zur Isolierung seltener ILC1 durch Minimierung des Verlusts von Lymphozyten während des intestinalen Dissoziationsprotokolls und zur Etablierung von Kokulturen zwischen diesen beiden Kompartimenten. Es gibt viele Schritte zu diesem Protokoll, und während einige spezifisch für ILC1s sind, kann dieser Ansatz auf andere intestinale Immunzelltypen angewendet werden, und Co-Kultur-Setups können modular an individuelle Forschungsfragen ang...

Die Kommunikation zwischen dem Darmepithel und dem darmresidenten Immunsystem ist für die Aufrechterhaltung der Darmhomöostase von zentraler Bedeutung1. Störungen dieser Wechselwirkungen sind sowohl mit lokalen als auch mit systemischen Erkrankungen verbunden, einschließlich entzündlicher Darmerkrankungen (IBD) und Magen-Darm-Krebs2. Ein bemerkenswertes Beispiel für einen kürzlich beschriebenen kritischen Regulator der Homöostase stammt aus der Untersuchung angeborener lymphatischer Zellen (ILCs), die sich als Schlüsselfiguren in der intestinalen Immunlandschaftherauskristallisiert haben 3. ILCs sind eine Gruppe heterogener angeborener Immunzellen, die die intestinale Homöostase regulieren und Entzündungen weitgehend durch Zytokin-vermittelte Signalgebung orchestrieren4.
Murine ILCs sind grob in Subtypen unterteilt, basierend auf Transkriptionsfaktor-, Rezeptor- und Zytokinexpressionsprofilen5. Typ-1-ILCs, zu denen zytotoxische Natural Killer (NK)-Zellen und helferähnliche Typ-1-ILCs (ILC1s) gehören, werden durch die Expression des Transkriptionsfaktors (Eomesodermin) Eomes und T-Box-Proteins, die in T-Zellen (T-bet)6 exprimiert werden, sowie Sekretionszytokine, die mit T-Helfer-Typ-1 (TH1) assoziiert sind, definiert: Interferon-γ (IFNγ) und Tumornekrosefaktor (TNF) als Reaktion auf Interleukin (IL)-12, IL-15 und IL-187. Während der Homöostase sezernieren geweberesidente ILC1s den transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β), um die Epithelproliferation und den Matrixumbauvoranzutreiben 8. Typ-2-ILCs (ILC2s) reagieren in erster Linie auf eine Helmintheninfektion über die Sekretion von T-Helfer-Typ-2 (TH2)-assoziierten Zytokinen: IL-4, IL-5 und IL-13, und sind durch die Expression von Retinsäure-assoziierten Orphan-Rezeptoren (ROR) α (ROR-α)9 und GATA Binding Protein 3 (GATA-3)10,11,12 gekennzeichnet. . Bei Mäusen sind intestinale "entzündliche" ILC2s weiter durch die Expression des Killerzell-lektinähnlichen Rezeptors (Unterfamilie G Member 1, KLRG)13 gekennzeichnet, wo sie auf epitheliale Büschelzell-abgeleitete IL-2514,15 reagieren. Schließlich sind Typ-3-ILCs, zu denen lymphatische Gewebeinduktorzellen und helferähnliche Typ-3-ILCs (ILC3s) gehören, vom Transkriptionsfaktor ROR-γt16 abhängig und gruppieren sich in Gruppen, die entweder Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierungsfaktor (GM-CSF), IL-17 oder IL-22 als Reaktion auf lokale IL-1β- und IL-23-Signale17 absondern. Lymphoide Gewebeinduktorzellen gruppieren sich in Peyer-Pflastern und sind entscheidend für die Entwicklung dieser sekundären lymphatischen Organe während der Entwicklung18, während ILC3s der am häufigsten vorkommende ILC-Subtyp im erwachsenen murinen Dünndarmlamina propria sind. Eines der frühesten murinen Darm-Organoid-Co-Kultursysteme mit ILC3s wurde genutzt, um den Einfluss des Zytokins IL-22 auf den Signalwandler und den Aktivator der Transkription 3 (STAT-3) zu zerlegen, der den Leucin-Rich Repeat Containing G Protein Coupled Receptor 5 (Lgr5) + die Proliferation von Darmstammzellen19 vermittelt, ein starkes Beispiel für eine regenerative ILC-Epithel-Interaktion. ILCs zeigen eine Abdruck-Heterogenität zwischen den Organen 20,21 und eine Plastizität zwischen Teilmengen als Reaktion auf polarisierende Zytokine22. Was diese gewebespezifischen Abdrücke und Plastizitätsunterschiede antreibt und welche Rolle sie bei chronischen Erkrankungen wie IBD23 spielen, bleiben spannende Themen, die mit organoiden Co-Kulturen adressiert werden könnten.
Darmorganoide haben sich als erfolgreiches und zuverlässiges Modell zur Untersuchung des Darmepithels24,25 herausgestellt. Diese werden durch Kultivierung von intestinalen epithelialen Lgr5+-Stammzellen oder ganzen isolierten Krypten erzeugt, zu denen Paneth-Zellen als endogene Quelle des Wnt-Familienmitglieds 3A (Wnt3a) gehören. Diese 3D-Strukturen werden entweder in synthetischen Hydrogelen26 oder in Biomaterialien beibehalten, die die basale lamina propria nachahmen, zum Beispiel der Thermal-Crosslinking Basal Extracellular Matrix (TBEM), und werden durch Wachstumsfaktoren ergänzt, die die umgebende Nische nachahmen, insbesondere Epithelial Growth Factor (EGF), der Bone Morphogenetic Protein (BMP)-Inhibitor Noggin und ein Lgr5-Ligander und Wnt-Agonist R-Spondin127 . Unter diesen Bedingungen halten Organoide die epitheliale apiko-basale Polarität aufrecht und rekapitulieren die Krypta-Zotten-Struktur des Darmepithels mit knospenden Stammzellkrypten, die sich im Zentrum des Organoids endgültig in absorbierende und sekretorische Zellen differenzieren, die dann durch Anoikis28 in das innere Pseudolumen abgeworfen werden. Obwohl Darmorganoide allein als reduktionistische Modelle der Epithelentwicklung und -dynamik in Isolation von großem Vorteil waren29,30, bergen sie ein enormes zukünftiges Potenzial, um zu verstehen, wie diese Verhaltensweisen vom Immunkompartiment reguliert, beeinflusst oder sogar gestört werden.
Im folgenden Protokoll wird eine Methode der Kokultur zwischen murinen Dünndarmorganoiden und von Lamina propria abgeleiteten ILC1s beschrieben, die kürzlich verwendet wurde, um zu identifizieren, wie diese Population unerwartet die Darmsignaturen von Entzündungen verringert und stattdessen zu einer erhöhten Epithelproliferation über TGF-β in diesem System beiträgt8.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45 (BV510)</td><td>BioLegend</td><td>103137</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus NK1.1 (PE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-5941-83</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), serumfrei</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CD127 Monoklonaler Antikörper (APC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>CD19 Monoklonaler Antikörper (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>CD3e Monoklonaler Antikörper (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0051-82</td><td></td></tr><tr><td>CD5 Monoklonaler Antikörper (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>COLLAGENASE D, 500MG</td><td>Merck</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex HA-RSpondin1-Fc HEK293T Zellen</td> Die <td>Zelllinie wurde zur Gewinnung des konditionierten RSpondin1-Überstands verwendet, die Zelllinie und das Materialtransferabkommen wurden vom Kuratorium der Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD, PhD, Stanford University)</td><td></td><td></td> zur Verfügung gestellt</tr><tr><td>.</td><td>Merck</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nährstoffmischung F-12 (Advanced DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DNASE I, GRADE II</td><td>Merck</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X)</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>Ethilenedimin Tetraacetatsäure</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2482-100</td><td></td></tr><tr><td>FC Block</td><td>2B Scientific</td><td>BE0307</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, qualifiziert, inaktiviert</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100X)</td><td>Gibco</td><td>3050-038</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (10X)</td><td>Gibco</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1X)</td><td>Gibco</td><td>12549069</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T- mNoggin-Fc Die</td><td>Zelllinie wurde zur Gewinnung von konditioniertem Noggin-Überstand verwendet, eine Zelllinie, die durch ein Materialtransferabkommen mit dem Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, Niederlande, erworben wurde und auf der Veröffentlichung von Farin, Van Es und Clevers Gastroenterology (2012) basiert.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Pufferlösung (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>KLRG1 Monoklonaler Antikörper (PerCP eFluor-710)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-5893-82</td><td></td></tr><tr><td>Lebend/tot fixierbarer blauer Totzellen-Fleckenkit, für UV-Anregung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6G/Ly-6C Monoklonaler Antikörper (eFluor 450)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenolrot-frei, LDEV-frei</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcystein (500mM)</td><td>Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NKp46 Monoklonaler Antikörper (PE Cyanin7)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25-3351-82</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1 x) 7,2 pH</td><td>Thermo Fisher Wissenschaftliche</td><td>12549079</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Gibco</td><td>70013032</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Cytiva</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>rekombinantes humanes EGF, tierversuchsfreies Protein</td><td>R& D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IL-15 GMP-Protein, CF</td><td>R& D Systems</td><td>247-GMP</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante humane IL-2 (trägerfrei)</td><td>BioLegend</td><td>589106</td><td></td></tr><tr><td>rekombinante Maus IL-7 (trägerfrei)</td><td>R& D Systems</td><td>407-ML-005/CF</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid (ROCK-Inhibitor)</td><td>Biotechne</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Plastics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube</td><td>Falcon</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tube</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pippette</td><td>StarLab</td><td>E4860-0010</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>11507411</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pippette</td><td>StarLab</td><td>E4860-0025</td><td></td></tr><tr><td>p10 Pippettenspitzen</td><td>StarLab</td><td>S1121-3810-C</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Pippettenspitzen</td><td>StarLab</td><td>I1026-7810</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pippettenspitzen</td><td>StarLab</td><td>E1011-0921</td><td></td></tr><tr><td>Mit Standardgewebekulturen behandelte 24-Well-Platte</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td>Centrifuge Eppendorf 5810 R CO2- <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>und temperaturgesteuerter Inkubator</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170 R/S</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Flow Assisted Cellular Sorter BD Ausrüstung FACS Aria II <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beheizter Shaker</td><td>Stuart Equipment</td><td>SI500</td><td></td></tr><tr><td>Eisbox</td><td></td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Inverses Lichtmikroskop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)</td><td></td></tr><tr><td>p10 Pippette</td><td>Eppendorf</td><td>3124000016</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Pippette</td><td>Eppendorf</td><td>3124000063</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pippette</td><td>Eppendorf</td><td>3124000032</td><td></td></tr><tr><td>Pippette-Pistole</td><td>Eppendorf</td><td>4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Nasseis</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

kokultur von murinen dünndarm-epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen zellen

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Komplexe Co-Kulturen von Organoiden mit Immunzellen bieten ein vielseitiges Werkzeug, um die bidirektionalen Wechselwirkungen zu hinterfragen, die das empfindliche Gleichgewicht der Schleimhauthomöostase untermauern. Diese multizellulären 3D-Systeme bieten ein reduktionistisches Modell für die Behandlung multifaktorieller Erkrankungen und die Lösung technischer Schwierigkeiten, die bei der Untersuchung seltener Zelltypen wie geweberesidenten angeborenen lymphatischen Zellen (ILCs) auftreten. Dieser Artikel beschreibt ein murines System, das Dünndarmorganoide und von Dünndarmlamina propria abgeleitete helferähnliche Typ-1-ILCs (ILC1s) kombiniert, die leicht auf andere ILC- oder Immunpopulationen ausgedehnt werden können. ILCs sind eine gewebeansässige Population, die besonders in der Schleimhaut angereichert ist, wo sie die Homöostase fördern und schnell auf Schäden oder Infektionen reagieren. Organoide Co-Kulturen mit ILCs haben bereits begonnen, neue epitheliale Immunsignalmodule im Darm zu beleuchten und zu zeigen, wie verschiedene ILC-Untergruppen die Integrität und Regeneration der Darmepithelbarriere beeinflussen. Dieses Protokoll wird weitere Untersuchungen über reziproke Wechselwirkungen zwischen Epithel- und Immunzellen ermöglichen, die das Potenzial haben, neue Einblicke in die Mechanismen der Schleimhauthomöostase und -entzündung zu liefern.

Nach erfolgreichem Abschluss sollten frisch isolierte Krypten innerhalb von 2-4 Tagen knospende Kryptenstrukturen bilden (Abbildung 1A). Gesunde und robuste Organoidkulturen sollten aktiv wachsen und können wie im Protokoll beschrieben durchlaufen und erweitert werden.
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Dünndarm-ILC1 aus der RORγtGFP murine transgenen Reporterlinie, die die Isolierung von lebendem ILC1 durch FACS ermögli...

Dieses Protokoll bietet detaillierte Anweisungen zur Etablierung von murinen Dünndarmorganoiden, zur Isolierung angeborener Lymphzellen des Typs 1 aus der murinen Dünndarmlamina propria und zur Etablierung von 3-dimensionalen (3D) Kokulturen zwischen beiden Zelltypen, um bidirektionale Wechselwirkungen zwischen Darmepithelzellen und angeborenen lymphatischen Typ-1-Zellen zu untersuchen.

Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Dieses Protokoll bietet ein wichtiges Werkzeug, um die Wechselwirkungen zwischen intestinalen Immunzellen und dem Epithel zu untersuchen und zu analysieren, wie diese Wechselwirkungen bei der intestinalen Homöostase und Entzündung regulieren können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die exquisite Menge an experimenteller Kontrolle, die durch das Reduktions-in-vitro-Modell erleichtert wird, mit dem Fragen in der Epithel- und Immunbiologie beantwortet werden können. Dieses System wurde bereits verwendet, um die Rolle von ILC1 bei der Expansion von CD44-positiven Epithelkrypten zu bestimmen und hat das Potenzial, unser Verständnis von entzündungsvermittelten Magen-Darm-Erkrankungen weiter zu verbessern.Platzieren Sie zunächst die thermisch vernetzende basale extrazelluläre Matrix auf Eis, um eine mit der Standardgewebekultur behandelte 24-Well-Platte aufzutauen und vorzuwärmen, indem Sie sie in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator legen. Entfernen Sie anschließend die Platte, die Organoide enthält, aus dem Inkubator und entsorgen Sie das Medium aus dem zu durchlassenden Brunnen. Fügen Sie dann 500 Mikroliter eiskaltes fortschrittliches DMEM F12 zu den Bohrlöchern hinzu und ernten Sie mit einer P-1000-Spitze die Organoide aus allen Vertiefungen in ein 15-Milliliter-Rohr.Spülen Sie den Boden der Bohrlöcher mit 250 bis 300 Mikrolitern eiskaltem DMEM F12 ab, um sicherzustellen, dass keine Organoide im Bohrloch verbleiben und sich in das 15-Milliliter-Rohr mit geernteten Organoiden einschließen. Suspendieren Sie das ein bis zwei Tage alte geerntete Organoidpellet in einem Milliliter eiskaltem DMEM F12. Beschichten Sie ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit PBS2 pro angeborener lymphatischer Zellen, die die Probe replizieren, und verteilen Sie dann mit einer vorbeschichteten PBS2-Spitze etwa 100 bis 200 Organoide in die Röhre.Mit einer PBS2-beschichteten P-1000-Spitze fügen Sie dem PBS2-beschichteten 1,5-Milliliter-Röhrchen, das die Organoide enthält, ein Volumen von nicht weniger als 500 ILC1, wie aus dem Sortierschritt berechnet, hinzu. Drehen Sie ILC1 und Organoide bei 300 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius nach unten und achten Sie darauf, Tischzentrifugen mit kleinem Durchmesser zu vermeiden, da sie die Zellen entlang der Kante des Rohrinneren ziehen, anstatt ein Pellet an der Spitze des Rohres zu erzeugen. Entfernen Sie dann den Überstand langsam und vorsichtig, ohne das Pellet zu stören, und legen Sie die Probe auf Eis.Während Sie die Röhre auf einer kalten Oberfläche halten, resuspendieren Sie die Organoide und ILC in 30 Mikrolitern thermisch vernetzender basaler extrazellulärer Matrix mindestens 10 bis 15 Mal, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Tragen Sie 30 Mikroliter ILC-Organoide pro Vertiefung in der thermisch-vernetzenden basalen extrazellulären Matrix auf eine vorerwärmte 24- oder 48-Well-Platte auf, um eine einzige Kuppel zu bilden. Danach legen Sie die Platte für 10 bis 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid direkt in den Inkubator.Dann fügen Sie 550 Mikroliter vollständiges ILC1-Medium pro Bohrung mit den gewünschten experimentellen Zytokinen oder blockierenden Antikörpern hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 Stunden. Entfernen Sie die Platte nach 24 Stunden vorsichtig aus dem Inkubator und lassen Sie die Platte eine Minute lang in einer Gewebekulturhaube sitzen, um sicherzustellen, dass sich die Lymphozyten absetzen. Entfernen Sie 200 bis 250 Mikroliter Medien und legen Sie sie in eine leere Vertiefung einer 24-Well-Platte.Überprüfen Sie mit einem inversen Mikroskop den Überstand, um sicherzustellen, dass keine Lymphozyten entfernt wurden. Wenn der Überstand klar ist, fügen Sie 300 Mikroliter frisches ILC1-Medium zur Co-Kultur im ursprünglichen Brunnen hinzu. Wenn Lymphozyten im Überstand vorhanden sind, zentrifugieren Sie bei 300 bis 400 G für drei bis fünf Minuten bei vier Grad Celsius und resuspendieren Sie das Pellet in 300 Mikroliter frischem ILC1-Medium.Fügen Sie dann die Zellsuspension zu den verbleibenden 200 bis 250 Mikrolitern Medien im ursprünglichen Vertiefungsraum hinzu. Führen Sie nachgelagerte Analysen mittels Immunfluoreszenz, Durchflusszytometrie oder FACS-Aufreinigung von Zielpopulationen in Lysepuffer für die Genexpressionsanalyse durch eine Einzelzell- oder Massen-RNA-Suche oder RT-qPCR durch, wie im Text beschrieben. Nach erfolgreichem Abschluss der Passage zeigten gesunde und robuste Organoidkulturen, dass die frisch isolierten Krypten innerhalb von zwei bis vier Tagen knospende Kryptenstrukturen bilden sollten.Die durchflusszytometrische Analyse wurde durchgeführt, um Dünndarm-ILC1 aus der transgenen RON-Gamma-T-Murin-Reporterlinie zu isolieren, und der erwartete ILC-Zählbereich betrug 350 bis 3.500 isolierte Zellen. Nach der Aussaat mit Organoiden können Co-Kulturen durch immunchemische Zytochemie sichtbar gemacht werden. Die konfokale Mikroskopie zeigte die Bilder von Dünndarmorganoiden, die allein und in Gegenwart von ILC1s kultiviert werden.Die immunzytochemische Färbung zeigt das Vorhandensein von CD45-positivem ILC1 in unmittelbarer Nähe zu Zonula-Okkludenprotein-1-positiven Epithelzellen in organoiden ILC1-Co-Kulturen. Die Durchflusszytometrie zeigte, dass das epitheliale zelluläre Adhäsionsmolekül intestinale Epithelzellen in Organoiden markiert, während CD45 ILC1s markiert. Das durchflusszytometrische Diagramm und die Immunchemie zeigten eine erhöhte Expression von CD44 in Darmepithelzellen, wenn es mit ILC1 kokultiviert wurde.Die RT-qPCR-Studien zeigen, dass die ILC1-Kokultur spezifisch CD44-Variante 6 hochregulierte, die durch TGF-beta 1, 2, 3 neutralisierende Antikörper gehemmt und durch rekombinantes TGF-beta 1 in Dünndarm-Organoid-Nur-Kulturen hochreguliert wurde. Es ist wichtig, bei der Manipulation der Organoide vorsichtig zu sein, um sicherzustellen, dass die gesamten Strukturen erhalten bleiben und zu überprüfen, ob die Strukturen nach der Zentrifugation ausreichend pelletiert wurden. Durch die Erhöhung der Systemkomplexität durch die Zugabe anderer Immun- und Nicht-Immunkomponenten kann dieses In-vitro-System genutzt werden, um weitere Fragen in der Darmbiologie zu beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Videoprotokoll erklären wir Schritt für Schritt die lentivirale Transduktion in Organoiden des primären Darmepithels und die Verarbeitung und nachgelagerte Analyse dieser Kulturen mittels quantitativer RT-PCR, RNA-Microarray und Immunhistochemie.

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Aus Stammzellen gewonnene Kulturen bergen ein enormes Potenzial zur Modellierung von Infektionskrankheiten. Hier wird die Kultur von mausischen und menschlichen Magenorganoiden beschrieben, die aus adulten Stammzellen gewonnen werden. Den Organoiden wird der Magenerreger Helicobacter pylori mikroinjiziert.

Organoide als Modell für Infektionskrankheiten: Kultur von humanen und murinen Magen Organoide und Mikroinjektion von Helicobacter Pylori

Hier wird ein Protokoll zu ernten, zu pflegen und zu behandeln Maus kleine Darm-Organoide mit pathogen associated molecular patterns (PAMPs) und Listeria monocytogenes beschrieben, sowie Betonung auf die Genexpression und die richtige Normalisierungstechniken für Protein.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie man murine primäre epitheliale Dickdarmmonoschichten direkt aus Darmkrypten erzeugt. Wir bieten experimentelle Ansätze zur Erzeugung konfluenter Monoschichten auf permeablen Filtern, konfluente Monoschichten für die Kratzwundeheilung und biochemische Studien sowie spärliche und konfluente Monoschichten für die Immunfluoreszenzanalyse.

Erzeugung von murinen primären Dickdarmepithel-Monoschichten aus Darmkrypten

Hier stellen wir zwei Protokolle vor, die die Modellierung von intestinalen apikal-spezifischen Interaktionen ermöglichen. Organoid-abgeleitete intestinale Monoschichten und Air-Liquid-Interface (ALI)-Kulturen erleichtern die Erzeugung von gut differenzierten Epithelien, die sowohl von luminaler als auch von basolateraler Seite zugänglich sind, während polaritätsinvertierte Darmorganoide ihre apikale Seite freilegen und für Hochdurchsatz-Assays zugänglich sind.

Kulturmethoden zur Untersuchung apikal-spezifischer Wechselwirkungen mit intestinalen Organoidmodellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Etablierung eines murinen Kolonorganoidsystems zur Untersuchung der Aktivität und Funktion von Kolonstammzellen in einem Claudin-7-Knockout-Modell.

Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Kultivierung von 3D-Organoiden aus kryokonservierten Epithelkryptionen. Wir beschreiben auch eine Methode zur Etablierung von Zellmonolagen, die von 3D-Organoiden abgeleitet sind und den Zugang zur apikalen Seite von Epithelzellen ermöglichen.

Kultivierung von Ferkel-Darm-3D-Organoiden aus kryokonservierten Epithelkrypten und Etablierung von Zellmonoschichten

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung von murinen Dünndarmkrypten und kultivieren intestinale 3D-Organoide aus den Krypten. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode zur Generierung von Organoiden aus einer einzelnen intestinalen Stammzelle in Abwesenheit einer subepithelialen zellulären Nische.

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

Die Studie präsentiert eine Methode zur in-vitro-Untersuchung bakterieller Infektionen unter Verwendung von Gewebestammzell-abgeleiteten Intestinalorganoiden. Das Protokoll beschreibt, wie man Organoide in zwei Dimensionen kultiviert und differenziert, sie mit adhärent-invasiven Escherichia coli infiziert und wichtige Werte bewertet, darunter das Durchbrechen der Epithelbarriere, die Bildgebung der Infektion und die Antwort der epithelialen RNA.

Eine zweidimensionale Organoidkultur auf Invasin- oder Basementmembranextrakt zur Untersuchung von Wirts-Bakterien-Interaktionen

Dieses Papier beschreibt verschiedene Methoden der...

Co-Kultur Modelle Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf lebenden menschlichen Zellen gezüchtet Airway

Lernen Sie die Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen für Immunologie und Zellbiologie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung bidirektionaler Interaktionen zwischen Epithel- und Immunzellen.

Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen

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