Name: Evaluierung der Substratubiquitylierung mittels E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzelllysaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Lernen Sie die Bewertung der Substratubiquitylierung durch E3-Ubiquitin-Ligasen in Säugetierzelllysaten mittels Immunopräzipitation und Western Blot. Diese Methode hilft Forschern, Proteinmodifikationen zu untersuchen.

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F.R.T wird von der FAPESP-Fördernummer 2020/15771-6 und der CNPq Universal 405836/2018-0 unterstützt. P.M.S.P und V.S werden von CAPES unterstützt. C.R.S.T.B.C wurde durch die FAPESP-Stipendiennummer 2019/23466-1 unterstützt. Wir danken Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) für die materielle Unterstützung.

HINWEIS: Eine Übersicht über das Ubiquitylierungsassay-Protokoll in Säugetierzellen ist in Abbildung 1 dargestellt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63561/63561fig01.jpg"> Abbildung 1. Überblick über das Ubiquitylierungsassay-Verfahren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63561/63561fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
1. Zellkultur
<ol><li>Züchten Sie die HEK293T-Zelllinie in einer 100 mm TC-behandelten Kulturschale auf 80%-90% Konfluenz in Wachstumsmedien (Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) hohe Glukose, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und Penicillin (100 Einheiten), Streptomycin (100 μg) und L-Glutamin (0,292 mg/ml)). Inkubieren Sie die Kultur bei 37 °C in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 5% CO2.</li>
	<li>Um die Zellen zu passieren, saugen Sie die Medien mit einer serologischen Pipette aus der Kulturschale ab. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1 ml sterilisierter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS 1x).</li>
	<li>Lösen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml Trypsin / EDTA-Lösung (Ethylendiamintetraessigsäure). Die Schale bei 37 °C 5 min inkubieren. Resuspendieren Sie die Zellen mit einer serologischen Pipette in 2 ml Wachstumsmedien.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in ein frisches und sauberes 15-ml-Röhrchen und eine Zentrifuge bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Entfernen Sie den Überstand, indem Sie ihn vorsichtig ausgießen. Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 3 ml Wachstumsmedien durch Auf- und Abpipettieren, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten.</li>
	<li>Übertragen Sie 1 ml der Zellsuspension auf eine 100 mm TC-behandelte Kulturschale, die 9 ml Wachstumsmedien enthält. HINWEIS: Wenn sich die Zellen in gutem Zustand befinden, kann jede Kulturschale von HEK293T, bei der der Zusammenfluss 80% -90% beträgt, 2 Tage nach der Passage drei Kulturschalen mit 80% Konfluenz erzeugen.</li>
</ol>2. Zelltransfektion
HINWEIS: Es wird nicht empfohlen, die Zellkultur zu transfizieren, wenn der erreichte Zusammenfluss weniger als 80% beträgt.
<ol><li>Bestätigen Sie vor der Transfektion, ob die Zellen frei von Kontamination sind und sich an einem angemessenen Zusammenfluss für vorübergehende Transfektionen befinden.</li>
	<li>Für jede Transfektionsprobe werden die DNA-Polyethylenimin (PEI 1 μg/μL bei pH 7,2) Komplexe wie folgt hergestellt:<ol>
<li>Verdünnen Sie 3 μg jedes Plasmids in 100 μL opti-MEM I reduziertem Serummedium ohne Supplementierung und mischen Sie es vorsichtig, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren. HINWEIS: Hier wurden die Zellen mit 4 μg von jedem Plasmid transfiziert: Leere Vektor (pcDNA3) oder FLAG-Fbxo7-Konstrukte und UXT-V2-HA, mit oder ohne 6xHis-myc-Ubiquitin. Der gesamte DNA-Gehalt betrug 12 μg.</li>
		<li>Tauen Sie den PEI bei RT auf und fügen Sie ihn nach einem Anteil von 3 μL PEI pro 1 μg DNA in die Lösung ein. Homogenisieren Sie die Lösung, indem Sie sie nach oben und unten pipettieren. Dann inkubieren Sie es für 15 Minuten bei RT, um die Bildung von DNA-PEI-Komplexen zu ermöglichen. HINWEIS: Das optimale Verhältnis des PEI-Volumens pro DNA-Menge unterscheidet sich je nach ausgewählter Zelllinie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie das Gesamtvolumen der DNA-PEI-Komplexe zu jeder Schale hinzu, die die Zellkultur enthält, und mischen Sie sie vorsichtig, indem Sie die Platte hin und her schaukeln. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 5% CO2.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Wachstumsmedium nach 5 h, da eine längere PEI-Exposition für HEK293T-Zellen toxisch sein kann. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 5% CO2 für 36 h.</li>
</ol>3. Zelllyse und Immunpräzipitation
<ol><li>Nach der Inkubationszeit und 6 h vor der Zelllyse die transfizierten Zellen mit 10 μM des Proteasom-Inhibitors MG-132 behandeln. Inkubieren Sie die Zellen erneut bei 37 °C in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 5%CO2.</li>
	<li>Saugen Sie die Medien mit einer serologischen Pipette aus jeder Kulturschale ab und waschen Sie sie einmal mit 1 ml 1x PBS. Lösen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml Trypsin hinzufügen und die Schale bei 37 ° C für 5 Minuten inkubieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Wachstumsmedien.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in ein frisches und sauberes 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 500 x g für 5 min bei RT.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand, indem Sie ihn vorsichtig ausgießen. Das Zellpellet wird vorsichtig in 200 μL eiskaltem NP-40-Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 225 mM KCl und 1% NP-40) resuspendiert, mit dem Protease- und Phosphatase-Inhibitoren-Cocktail (10 mM NaF und 1 mM Na3VO4) ergänzt und die Lösung in ein sauberes 1,5 mL-Mikroröhrchen übertragen.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Zelllysat für 30 min auf Eis. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zelllysate bei 16.900 x g für 20 min bei 4 °C.</li>
	<li>In der Zwischenzeit die Agarose-Anti-HA-Perlen mit dem eiskalten NP-40-Lysepuffer ausgleichen. Verwenden Sie 15 μL Agarose-Anti-HA-Perlen für jede Probe. Waschen Sie die Perlen mit 200 μL NP-40-Lysepuffer, indem Sie sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei 3.000 x g für 1 min bei 4 °C pulsieren. Mit einer Pipette den Überstand sehr vorsichtig absaugen und entsorgen; Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. Danach halten Sie die Perlen bis zum Gebrauch auf Eis ausgeglichen.</li>
	<li>Nach dem Zentrifugieren der Zelllysate wird der Überstand zurückgewonnen. Quantifizieren Sie den Proteingehalt im Gesamtlysat mit der Bradford-Methode16.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass jede Probe, die einer Immunpräzipitation unterzogen wird, eine gleiche Menge an Protein enthält. Inkubieren Sie das notwendige Zelllysatvolumen mit den ausgleichenden Agarose-Anti-HA-Perlen für 4 h und drehen Sie sich vorsichtig in einem rotierenden Inkubator bei 4 ° C, wodurch sich der UXT-V2-HA an die Agarose-Anti-HA-Perlen binden kann.</li>
	<li>Sammeln Sie die Agarose-Anti-HA-Perlen, indem Sie sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei 3.000 x g für 1 min bei 4 °C pulsieren. Den Überstand vorsichtig absaugen und verwerfen. Waschen Sie die Perlen dreimal mit eiskaltem NP-40-Zelllysepuffer und zweimal mit eiskaltem FLAG/HA-Puffer (10 mM Hepes pH 7,9, 15 mM MgCl2, 225 mM KCl und 0,1% NP-40).</li>
	<li>Entfernen Sie nach der letzten Wäsche vorsichtig den gesamten Überstand mit einer Pipette und eluieren Sie das polyubiquitylierte Protein mit HA-Peptid (300 μg / ml), das auf FLAG / HA-Puffer verdünnt ist. Die Agarose-Anti-HA-Perlen mit HA-Peptid für 1 h bei 4 °C in einer schaukelnden Shaker-Plattform inkubieren.</li>
	<li>Drehen Sie die Perlen bei 3.000 x g für 2 min bei 4 °C nach unten und pipettieren Sie vorsichtig den Überstand, der die polyubiquitinierten Proteine enthält. Bei Bedarf das Eluat in einem frischen und sauberen Mikroröhrchen bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Die Eluate und die Zelllysate werden in 10% SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)17 und Immunoblotting aufgelöst.</li>
	<li>In dieser Studie wurde ein Nasstransfer WB durchgeführt. Für diese Art des Transfers legen Sie das Gel in ein Transfersandwich aus Filterpapier-Gel-Membran-Filterpapier, polstern Sie es mit Pads ab und drücken Sie es durch ein Stützgitter zusammen. Platzieren Sie dieses System vertikal in einem mit Transferpuffer gefüllten Tank und zwischen Edelstahl/Platin-Drahtelektroden. Der Transfer erfolgt für 90 min bei 150 V im Nasstransferpuffer (Glycin 192 mM, Tris-Base 25 mM, 0,025% SDS, 20% Methanol). HINWEIS: Da die Zellextrakte quantifiziert wurden (Schritt 3.7), führen Sie eine SDS-PAGE mit einer gleichen Menge an Protein für jede Probe durch. Um das Eluat aufzulösen, führen Sie außerdem gleiche Volumina jeder Stichprobe aus.</li>
	<li>Sondieren Sie die Immunoblot-Membran mit ausgewählten Antikörpern 11. Stellen Sie sicher, dass ein Abstrichsignal im Eluat aus dem polyubiquitylierten Substrat detektiert wird, das im IP-Prozess gezogen wird, indem Sie einen Antimyc-Antikörper in den Proben verwenden, die die Wildtyp-E3-Ligase, das Substrat und Myc-ub enthalten. Stellen Sie im Zelllysat (Input) sicher, dass das Signal des gewählten Substrats, des Fbxo7-Proteins, der ubiquitylierten Proteine und eines Housekeeping-Proteins (z. B. GAPDH und β-Actin) nachgewiesen wird, um die gleiche Menge an Proteinen in jeder Gasse zu gewährleisten. HINWEIS: Die Verdünnung für jeden verwendeten Antikörper wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet.</li>
</ol>

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<li>Koegl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ubiquitination+factor%2C+E4%2C+is+involved+in+multiubiquitin+chain+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly.</a> Cell. 96 (5), 635-644 (1999).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt vorliegt.

Die Ubiquitylierung ist eine essentielle posttranslationale Modifikation, die die Spiegel mehrerer Proteine reguliert und eine entscheidende Rolle in vielen Signalwegen und biologischen Prozessen spielt, um eine gesunde intrazelluläre Umgebung zu gewährleisten. Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist einer der Schwerpunkte der neueren pharmazeutischen Forschung und bietet die Möglichkeit, Tumorsuppressoren zu stabilisieren oder den Abbau onkogener Produkte zu induzieren22. Zum Beispiel fördert di...

Posttranslationale Modifikationen (PTMs) sind ein wichtiger Mechanismus für die Proteinregulation, die für die Zellhomöostase essentiell ist. Die Proteinubiquitylierung ist eine dynamische und komplizierte Modifikation, die eine Auswahl verschiedener Signale erzeugt, was zu mehreren zellulären Ergebnissen in eukaryotischen Organismen führt. Die Ubiquitylierung ist ein reversibler Prozess, der in der Anlagerung eines Ubiquitinproteins mit 76 Aminosäuren an das Substrat besteht und in einer enzymatischen Kaskade auftritt, die aus drei verschiedenen Reaktionen besteht1. Der erste Schritt ist durch eine Ubiquitin-Aktivierung gekennzeichnet, die von einer ATP-Hydrolyse abhängt, um ein hochenergetisches Thioester-verknüpftes Ubiquitin zwischen dem Ubiquitin-C-Terminus und dem im aktiven Zentrum des E1-Enzyms vorhandenen Cysteinrest zu bilden. Anschließend wird das Ubiquitin auf das E2-Enzym übertragen und bildet mit dem Ubiquitin einen Thioester-ähnlichen Komplex. Danach wird das Ubiquitin kovalent durch das E2 oder häufiger durch das E3-Enzym, das das Substrat 2,3 erkennt und mit ihm interagiert, kovalent an das Substratgebunden. Gelegentlich sind E4-Enzyme (Ubiquitin-Kettendehnungsfaktoren) notwendig, um den Multiubiquitin-Kettenaufbauzu fördern 3.
Ubiquitin hat sieben Lysinreste (K6, K11, K27, K29, K33, K48 und K63), was die Bildung von Polyubiquitinketten ermöglicht, die unterschiedliche Verbindungen erzeugen, um verschiedene dreidimensionale Strukturen zu erzeugen, die von mehreren Effektorproteinen erkannt werden 4,5. Daher ist die Art der Polyubiquitinkette, die in das Substrat eingeführt wird, für das Schicksal seiner Zelleunerlässlich 6,7,8. Darüber hinaus könnte das Substrat auch durch seine N-terminalen Reste, die N-Degrons genannt werden, ubiquitiniert werden. Spezifische E3-Ubiquitin-Ligasen sind für die N-Degron-Erkennung verantwortlich und ermöglichen die Polyubiquitylierung des nahegelegenen Lysinrests9.
Heute sind mehr als 40 verschiedene SCF-spezifische Substrate charakterisiert. Unter diesen können wichtige Regulatoren mehrerer biologischer Signalwege, einschließlich Zelldifferenzierung und -entwicklung sowie Zellüberleben und -tod, gefunden werden10,11,12,13. Daher ist die Identifizierung spezifischer Substrate jeder E3-Ubiquitin-Ligase unerlässlich, um eine umfassende Karte verschiedener biologischer Ereignisse zu entwerfen. Auch wenn die Identifizierung echter Substrate biochemisch eine Herausforderung darstellt, ist der Einsatz biochemisch basierter Methoden sehr gut geeignet, um die Kettenspezifität und die Unterscheidung zwischen Mono- und Polyubiquitylierungzu bewerten 14. Diese Studie beschreibt ein vollständiges Protokoll für den Ubiquitylierungsassay unter Verwendung der Säugetierzelllinie HEK293T, die das Substrat UXT-V2 (Ubiquitously exprimierten Prefoldin-like Chaperon-Isoform 2) mit dem E3-Ubiquitin-Ligase-Komplex SCF (Fbxo7) überexprimiert. UXT-V2 ist ein essentieller Co-Faktor für die NF-κB-Signalgebung, und sobald dieses Protein in Zellen niedergeschlagen wird, hemmt es die TNF-α-induzierte NF-κB-Aktivierung11. So wird zum Nachweis von polyubiquityliertem UXT-V2 der Proteasom-Inhibitor MG132 verwendet, da er die Fähigkeit hat, die proteolytische Aktivität der 26S-Untereinheit des Proteasom-Komplexes15 zu blockieren. Darüber hinaus wird der Zellextrakt einem kleinen IP zur Reinigung des Substrats unterzogen, wobei ein spezifischer Antikörper verwendet wird, der zu Agaroseharz immobilisiert ist, um anschließend von WB unter Verwendung ausgewählter Antikörper nachgewiesen zu werden. Dieses Protokoll ist sehr nützlich, um die Substratubiquitylierung in der zellulären Umgebung zu validieren, und es kann auch für verschiedene Arten von Säugetierzellen und anderen E3-Ubiquitin-Ligase-Komplexen angepasst werden. Es ist jedoch notwendig, das getestete Substrat auch durch einen In-vitro-Ubiquitylierungsassay zu validieren, da sich beide Protokolle hinsichtlich der Identifizierung echter Substrate ergänzen.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikroröhrchen</td><td>Axygen</td><td>PMI110-06A</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-behandelte Kulturschale</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Cralplast</td><td>655111</td><td></td></tr><tr><td>Agarose-Anti-HA-Kügelchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6779</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-Antikörper</td><td>Seracare</td><td>5220-0341</td><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG-Anti-Kaninchen-Antikörper</td></tr><tr><td></td><td>Seracare</td><td>5220-0337</td><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Anti-Aktin-Antikörper</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3853</td><td>Verwendete Verdünnung: 1:2000</td></tr><tr><td>Anti-Fbxo7-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1407251</td><td>Verwendete Verdünnung: 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-HA-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3663</td><td>Verwendete Verdünnung: 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Myc-Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>2272</td><td>Verwendete Verdünnung: 1:1000</td></tr><tr><td>Bradford-Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td>Rinderserumalbumin-Zellinkubator</td></tr><tr><td></td><td>Nuaire</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>500 x g für 5 min</td></tr><tr><td>ChemiDoc</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitales pH-Messgerät</td><td>Kasvi</td><td>K39-2014B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium</td><td>Corning</td><td>10-017-CRV</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td> mit hohem Glukosegehalt <td>Gibco</td><td>F4135</td><td>Filtrat vor der Verwendung</td></tr><tr><td>HA-Peptid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2149</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Life Science</td><td>0365-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kline Rotator</td><td>Global Trade Technology</td><td>GT-2OIBD</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Boston Biochem</td><td>I-130</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5418R</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4 (Ortovanadato)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose-Blotting-Membran</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td>10600016</tr><tr><td>NP40 (IGEPAL CA-630)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Mikroskop</td><td>OPTIKA Mikroskope</td><td>SN510768</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td><td>Für die Säugetierexpression</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-Fbxo7</td><td>&nbsp; Mit freundlicher Spende von Dr. Marcelo Dam&aacute; </td><td></td> rio <td>Tag 2xFlag (N-Anschluss). Restriktionsenzyme: EcoRI und XhoI</td></tr><tr><td>pcDNA3-2xFlag-fbxo7-&Delta; F-Box</td><td>&nbsp; Mit freundlicher Spende von Dr. Marcelo Dam&aacute; </td><td></td> rio <td>Tag 2xFlag (N-Anschluss). Restriktionsenzyme: EcoRI und XhoI. &Delta; 335-367</td></tr><tr><td>pcDNA3-UXTV2-HA</td><td>&nbsp; Mit freundlicher Spende von Dr. Marcelo Dam&aacute; </td><td></td> rio <td>Tag HA (C-Klemme). Restriktionsenzyme: EcoRI und XhoI</td></tr><tr><td>pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin</td><td>&nbsp; Mit freundlicher Spende von Dr. Marcelo Dam&aacute; </td><td></td><td>rio Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriktionsenzyme: EcoRI und KpnI</td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamin 100x</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung 10x</td><td>AccuGENE</td><td>51226</td><td>Um ein 1x PBS zu erhalten, verdünnen Sie das 10x PBS in Reinstwasser</td></tr><tr><td>Polyethylenimin (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>VWR Life Science</td><td>0860-50G</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer Cocktail SIGMAFAST</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Schaukelschüttler</td><td>Kasvi</td><td>19010005</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE System</td><td>BioRad</td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>Solution Homogenisator</td><td>Phoenix Luferco</td><td>AP-22</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine (TrypLe Express)</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Western Blot Luminol Reagenz</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>SC-2048</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluierung der substratubiquitylierung mittels e3-ubiquitin-ligase in säugetierzelllysaten

Evaluation of Substrate Ubiquitylation by E3 Ubiquitin-ligase in Mammalian Cell Lysates

Ubiquitylierung ist eine posttranslationale Modifikation, die in eukaryotischen Zellen auftritt und für die Regulation mehrerer biologischer Signalwege, einschließlich Zellüberleben, -proliferation und -differenzierung, entscheidend ist. Es ist ein reversibler Prozess, der aus einer kovalenten Bindung von Ubiquitin an das Substrat durch eine Kaskadenreaktion von mindestens drei verschiedenen Enzymen besteht, die aus E1 (Ubiquitin-Aktivierungsenzym), E2 (Ubiquitin-konjugierendes Enzym) und E3 (Ubiquitin-Ligase-Enzym) bestehen. Der E3-Komplex spielt eine wichtige Rolle bei der Substraterkennung und Ubiquitylierung. Hier wird ein Protokoll zur Bewertung der Substratubiquitylierung in Säugetierzellen unter Verwendung einer vorübergehenden Co-Transfektion eines Plasmids, das für das ausgewählte Substrat, eine E3-Ubiquitin-Ligase und ein markiertes Ubiquitin kodiert, beschrieben. Vor der Lyse werden die transfizierten Zellen mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 (Carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) behandelt, um einen proteasomalen Substratabbau zu vermeiden. Darüber hinaus wird der Zellextrakt einer kleinräumigen Immunpräzipitation (IP) unterzogen, um das polyubiquitylierte Substrat für den anschließenden Nachweis durch Western Blotting (WB) unter Verwendung spezifischer Antikörper für den Ubiquitin-Tag zu reinigen. Daher wird ein konsistentes und unkompliziertes Protokoll für den Ubiquitylierungsassay in Säugetierzellen beschrieben, um Wissenschaftler bei der Behandlung der Ubiquitylierung spezifischer Substrate und E3-Ubiquitin-Ligasen zu unterstützen.

UXT (ubiquitär exprimiertes Transkript) ist ein präfoldinartiges Protein, das ubiquitär exprimierte Proteinfaltungskomplexe in Maus- und menschlichen Geweben wie Herz, Gehirn, Skelettmuskulatur, Plazenta, Bauchspeicheldrüse, Niere und Leberbildet 18. Zwei Spleißisoformen von UXT, die als UXT-V1 und UXT-V2 bezeichnet werden, wurden beschrieben, die unterschiedliche Funktionen und subzelluläre Standorte erfüllen. UXT-V1 ist überwiegend im Zytoplasma und in den Mitochondrien lokalisiert und an TNF-α-...

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für einen Ubiquitylierungsassay eines spezifischen Substrats und einer E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzellen. HEK293T-Zelllinien wurden zur Proteinüberexpression verwendet, das polyubiquitylierte Substrat wurde durch Immunpräzipitation von Zelllysaten gereinigt und in SDS-PAGE aufgelöst. Immunoblotting wurde verwendet, um diese posttranslationale Modifikation zu visualisieren.

Evaluierung der Substratubiquitylierung mittels E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzelllysaten

Ubiquitylation is a post-translational modification which occurs in eukaryotic cells that is critical for several biological pathways' regulation, ...

Dieses Protokoll ermöglicht es, die Ubiquitylierung eines bestimmten Substrats durch eine E3-Ligase zu bewerten. Wir wissen, dass die Charakterisierung der Ligase-Substrat-Interaktion entscheidend ist, um ihre Funktion in Zellen zu verstehen. Diese Technik erfordert keine teuren Reagenzien oder ausgeklügelte Ausrüstung.Es benötigt Plasmide und die Kodierung der interessierenden Gene, entwickelt einen Immunpräzipitationsassay mit Zelllysaten und einen Western Blot zum Nachweis der Substratubiquitylierung. Mehrere menschliche Krankheiten wie Krebs und neurologische Störungen sind mit einer Dysregulation der E3-Ligase verbunden. Daher könnte die Identifizierung der Substratubiquitylierung durch spezifische E3-Ligase bei der Behandlung oder Diagnose dieser Krankheiten helfen.Die Demonstration des Verfahrens wird von Valentine Spagnol sein. Erhöhen Sie zunächst die HEK293T-Zelllinie auf 80 bis 90% Konfluenz in Dulbeccos modifiziertem Eagles-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 100 Einheiten Penicillin, 100 Mikrogramm Streptomycin und 0,292 Milligramm pro Milliliter L-Glutamin. Dann inkubieren Sie diese Kultur bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 5% Kohlendioxid.Passieren Sie die Zellen, indem Sie die Medien mit einer serologischen Pipette aus der Kulturschale absaugen und waschen Sie sie einmal mit einem Milliliter sterilisiertem 1X PBS. Als nächstes lösen Sie die Zellen durch Zugabe von einem Milliliter Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäurelösung und suspendieren diese Zellen nach fünf Minuten Inkubation bei 37 Grad Celsius in zwei Millilitern Wachstumsmedien mit einer serologischen Pipette. Die Zellsuspension in ein frisches und sauberes 15-Milliliter-Röhrchen geben und bei 500 mal G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugieren.Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in drei Millilitern Wachstumsmedien durch Pipettieren nach oben und unten, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten. Übertragen Sie dann einen Milliliter dieser Zellsuspension auf eine 100-Millimeter-TC-behandelte Kulturschale, die neun Milliliter Wachstumsmedien enthält. Bestätigen Sie vor der Transfektion, ob die Zellen frei von Kontamination sind und sich an einem angemessenen Zusammenfluss für vorübergehende Transfektionen befinden.Für jede Transfektionsprobe bereiten Sie die DNA-Polyethyleneim-Komplexe vor, indem Sie drei Mikrogramm jedes Plasmids in 100 Mikroliter Opti-MEM 1 reduziertem Serummedium ohne Supplementierung verdünnen und vorsichtig mischen, indem Sie die Lösung auf und ab pipettieren. Als nächstes tauen Sie das DNA-Polyethyleneimin bei Raumtemperatur auf und fügen Sie es der Lösung hinzu, nachdem Sie einen Anteil von drei Mikrolitern DNA-Polyethyleneimin pro Mikrogramm DNA erreicht haben. Homogenisieren Sie die Lösung, indem Sie sie nach oben und unten pipettieren.Dann inkubieren Sie es für 15 Minuten bei Raumtemperatur, um die Bildung von DNA-Polyethyleneimin-Komplexen zu ermöglichen. Fügen Sie das Gesamtvolumen der DNA-Polyethyleneim-Komplexe zu jeder Schale hinzu, die die Zellkultur enthält, und mischen Sie sie vorsichtig, indem Sie die Platte hin und her schaukeln. Dann inkubieren Sie diese Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator.Nach der Inkubation und sechs Stunden vor der Zelllyse die transfizierten Zellen mit dem 10-Mikromolaren Proteasom-Inhibitor MG132 behandeln und die Zellen im befeuchteten Zellkultur-Inkubator inkubieren. Als nächstes aspirieren Sie die Medien aus jeder Kulturschale mit einer serologischen Pipette und waschen Sie die Zellen einmal mit einem Milliliter 1X PBS. Dann lösen Sie die Zellen durch Zugabe von einem Milliliter Trypsin und inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten.Suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Wachstumsmedien und übertragen Sie die Zellsuspension in ein frisches und sauberes Zwei-Milliliter-Mikroröhrchen und zentrifugieren Sie es bei 500 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Sobald die Zentrifugation beendet ist, entfernen Sie den Überstand, indem Sie ihn vorsichtig ausgießen und das Zellpellet vorsichtig in 200 Mikrolitern eiskaltem MP40-Lysepuffer resuspendieren, ergänzt durch den Protease- und Phosphatase-Inhibitoren-Cocktail. Dann geben Sie diese Lösung in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen.Inkubieren Sie dieses Zelllysat für 30 Minuten auf Eis und zentrifugieren Sie nach der Inkubation die Zelllysate bei 16.900 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. In der Zwischenzeit die Agarose-Anti-HA-Perlen mit eiskaltem MP40-Lysepuffer ausgleichen. Verwenden Sie 15 Mikroliter Agarose-Anti-HA-Perlen für jede Probe.Waschen Sie die Perlen mit 200 Mikrolitern MP40-Lysepuffer, indem Sie sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei 3.000 mal G für eine Minute bei vier Grad Celsius pulsieren. Als nächstes aspirieren und verwerfen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. Danach halten Sie die Perlen bis zum Gebrauch auf Eis ausgeglichen.Nach dem Zentrifugieren der Zelllysate wird der Überstand zurückgewonnen und der Proteingehalt im Gesamtlysat mit der Bradford-Methode quantifiziert, um sicherzustellen, dass jede Probe, die einer Immunpräzipitation unterzogen wird, eine gleiche Menge an Protein aufweist. Inkubieren Sie das notwendige Zelllysatvolumen mit den ausgleichenden Agarose-Anti-HA-Perlen vier Stunden lang und drehen Sie sich vorsichtig in einem rotierenden Inkubator bei vier Grad Celsius, wodurch sich der UXT-V2-HA an die Agarose-Anti-HA-Perlen binden kann. Sammeln Sie die Agarose-Anti-HA-Perlen, indem Sie sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei 3.000 mal G für eine Minute bei vier Grad Celsius pulsieren.Den Überstand vorsichtig absaugen und verwerfen. Waschen Sie die Perlen dreimal mit eiskaltem MP40-Zelllysepuffer und zweimal mit eiskaltem FLAG HA-Puffer. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche den gesamten Überstand vorsichtig mit einer Pipette und eluieren Sie das polyubiquitylierte Protein mit 300 Mikrogramm pro Milliliter HA-Peptid, verdünnt auf FLAG HA-Puffer.Inkubieren Sie die Agarose-Anti-HA-Perlen mit HA-Peptid für eine Stunde bei vier Grad Celsius in einer schaukelnden Shaker-Plattform. Als nächstes drehen Sie die Perlen bei 3.000 mal G für zwei Minuten bei vier Grad Celsius nach unten und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, der die polyubiquitinierten Proteine enthält. Bei Bedarf lagern Sie das Elutionsmittel in einem frischen und sauberen Mikroröhrchen bei minus 20 Grad Celsius.Lösen Sie die Eluenten und die Zelllysate in 10% Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Immunoblotting auf. Um ein Wet Transfer Western Blotting durchzuführen, legen Sie das Gel in ein Transfersandwich aus Filterpapier, Gelmembranfilterpapier, polstern Sie es mit Pads und drücken Sie es durch ein Stützgitter zusammen. Platzieren Sie dieses System dann vertikal in einem Tank, der mit Transferpuffer zwischen Edelstahl- oder Platindrahtelektroden gefüllt ist.Die Übertragung erfolgt für 90 Minuten bei 150 Volt in einem nassen Transferpuffer. Sondieren Sie schließlich die Immunoblot-Membran mit einem Anti-Myc-Antikörper. Die spezifische Polyubiquitylierung von UXT-V2-HA, vermittelt durch F-Box-Protein 7 in Zellen, wurde beobachtet, nachdem das Elutionsmittel aus Anti-HA-Immunpräzipitation mit einem Anti-Myc-Antikörper untersucht wurde, der das mit dem Substrat konjugierte Myc-UB nachweist.Die Spezifität von Anti-Myc für polyubiquityliertes Substrat wurde in den Bahnen eins und zwei visualisiert, wobei ein Abstrich von polyubiquitylierten Proteinen nicht nachgewiesen wurde, wenn Zellen in Abwesenheit von UXT-V2-HA-Plasmid mit F-Box-Protein 7 und Myc-ub co-transfiziert wurden. Zusätzlich wurde in der Kombination von F-box Protein 7 und UXT-V2-HA ohne das Myc-ub-Plasmid kein Abstrich visualisiert, der der Protein-Polyubiquitinierung entspricht. Wenn eine leere Vektor-Wildtyp-F-Box-Protein-7- oder F-Box-Protein-7-Mutante, die nicht in der Lage war, aktives SCF zusammenzusetzen, in Kombination mit UXT-V2-HA und Myc-ub transeziert wurde, wurde ein starkes Abstrichsignal von polyubiquityliertem UXT-V2 nur für Wildtyp-F-Box-Protein 7 beobachtet, was darauf hindeutet, dass UXT-V2 durch SCF F-Box-Protein-7-Komplex und Zellen im Vergleich zu den Kontrollen polyubiquityliert wurde.Die Mono-Fällungsschritte, einschließlich der Inkubation von Zelllysaten mit den Gleichgewichtsperlen und der Elution von immunpräzipitierten Proteinen, sind unerlässlich, um das Ziel dieses Protokolls zu erreichen. Nach diesem Verfahren sollte ein In-vitro-Ubiquitylierungsassay durchgeführt werden, um die Spezifität der Substratubiquitylierung durch die E3-Ligase zu bestätigen.

evaluation-substrate-ubiquitylation-e3-ubiquitin-ligase-mammalian

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ubiquitinierung ist ein wichtiger posttranslationale Modifikation durch eine Gruppe von drei Enzymen durchgeführt. Mutationen von Genen in dieser Modifikation beteiligt sind mit vielen verschiedenen menschlichen Krankheiten assoziiert. Hier beschreiben wir Protokolle, um Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen...

Detektion von Protein Ubiquitination

Dieses Video demonstriert die in vitro Methode zur SUMOylierung von Substratproteinen unter Verwendung einer sequentiellen Enzymkaskade. Weiterhin wird der SUMOylierte Status des Proteins mit Hilfe der Elektrophorese- und Immunblotting-Technik identifiziert.

SUMOylation Assay: Eine in vitro Technik zum Nachweis des SUMOylierungsstatus von Substratproteinen durch Immunoblotting

Im Gegensatz zu Ubiquitin Ligases wurden einige E3 SUMO Ligases identifiziert. Dieses modifizierte in-vitro- Sumoylierung Protokoll ist in der Lage, neuartige SUMO E3 Ligases durch eine in-vitro- Rekonstitution Assay zu identifizieren.

In-vitro- Sumoylierung Assay SUMO E3 Ligase Tätigkeit zu studieren

Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung, Detektion und Identifizierung von diGly Peptiden, die aus ubiquitinierten Proteinen aus komplexen biologischen Proben stammen. Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar, robust und übertrifft die veröffentlichten Methoden in Bezug auf den Grad der Tiefe der Ubiquitinom-Analyse.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

Ubiquitination ist eine post-translationale Modifikation, die eine wichtige Rolle in zellulären Prozessen spielt und durch Deubiquitination eng koordiniert wird. Defekte in beiden Reaktionen liegen den menschlichen Pathologien zugrunde. Wir bieten Protokolle zur Durchführung von Ubiquitination und Deubiquitination Reaktion in vitro mit gereinigten Komponenten.

In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-Likes (Ubls) spezifische Proteome zu etablieren, um Änderungen dieser Art von post-translationalen Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, die mit einer bestimmten Erkrankung wie einer Behandlung oder einem Phänotyp verbunden sind.

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Ziel dieses Manuskripts ist es, einen Überblick über die umfassenden biochemischen und funktionellen Studien der RING-Typ E3 Ubiquitin Ligasen zu präsentieren. Diese mehrstufige Pipeline mit detaillierten Protokollen validiert eine enzymatische Aktivität des getesteten Proteins und zeigt, wie die Aktivität mit der Funktion verknüpft werden kann.

Funktionelle Charakterisierung von RING-Typ E3 Ubiquitin Ligases In Vitro und In Planta

Diese Methode beschreibt die Bewertung globaler Veränderungen in der Ubiquitin-Kettentopologie. Die Bewertung erfolgt durch die Anwendung eines auf Massenspektrometrie basierenden zielgerichteten Proteomik-Ansatzes.

Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Die vorliegende Studie liefert detaillierte In-vitro-Ubiquitylierungs-Assay-Protokolle für die Analyse der katalytischen Aktivität der E3-Ubiquitin-Ligase.  Rekombinante Proteine wurden mit prokaryotischen Systemen wie der Escherichia coli-Kultur exprimiert.

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

Ubiquitination ist ein entscheidender Regulator der intrazellulären Proteinfunktionen. Hier beschreiben wir zwei Zelllysemethoden zur Erkennung der Substratprotein-Ubiquitinationswerte in Säugetierzellen und vergleichen deren Wirksamkeit bei der Analyse von Ubiquitinationsniveaus. Die Proteinüberexpression in HEK293T Zellen wurde durch vorübergehende Transfektion induziert, und ubiquitinierte Proteine wurden durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen.

Vergleichende Strategien zur Nachweisung der Uquitination in Säugetierzelllysaten unter Verwendung von SMAD2/SMURF2 als Modell

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Ubiquitinierung von Streptococcus pneumoniae mit Säugetierzelllysat oder einem reinen Ubiquitin-Enzymkomplex, gefolgt von einer Behandlung mit gereinigtem VCP/p97-UFD1-NPLOC4-Proteinkomplex, um dessen bakteriolytische Aktivität zu bewerten, was die Untersuchung ubiquitinabhängiger Immuneffektoren ermöglicht.

In-vitro Rekonstitution der bakteriellen Ubiquitination und VCP/p97-vermittelte Elimination

Lernen Sie die Bewertung der Substratubiquitylierung durch E3-Ubiquitin-Ligasen in Säugetierzelllysaten mittels Immunopräzipitation und Western Blot. Diese Methode hilft Forschern, Proteinmodifikationen zu untersuchen.

Evaluierung der Substratubiquitylierung mittels E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzelllysaten

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