Untersuchung der narbenlosen Geweberegeneration bei embryonalen verwundeten Kükenhornhäuten

Eine Schädigung des erwachsenen Hornhautstromas führt zu einer schnellen Wundheilungsreaktion, die das Sehvermögen aufgrund der undurchsichtigen Narbengewebebildung beeinträchtigt. Dieses Protokoll erzeugt Wunden in embryonalen Kükenhornhäuten, die im Gegensatz zu Erwachsenen ohne Narbe heilen können. Angesichts der intrinsischen Fähigkeit der verletzten embryonalen Hornhaut, eine vollständige Rekapitulation der nativen Hornhautstruktur ohne nachweisbare Narbenbildung zu durchlaufen, dient das embryonale Küken als wichtiges Tiermodell zur Aufklärung der molekularen und zellulären Faktoren für die narbenlose Hornhautwundheilung.

Der schwierigste Aspekt dieser Technik ist die Erzeugung einer konsistenten Wunde, die sowohl das äußerste Epithel als auch das tiefere Hornhautstroma durchdringt. Wie man lernt, kann es hilfreich sein, die verwundeten Hornhäute in einem Querschnitt zu betrachten, damit die Tiefe des Wundeindringens in das Hornhautstroma beurteilt werden kann. Um zu beginnen, ordnen Sie die Eier horizontal auf einem Tablett an und markieren Sie sie an der Oberseite des Eies, um die erwartete Position des Embryos anzuzeigen.

Brüten Sie diese Eier in einem 38 Grad Celsius befeuchteten Inkubator mit aktivierter Schaukelfunktion aus. Nehmen Sie das Ei am dritten Tag der Embryonalentwicklung aus dem Inkubator und positionieren Sie es horizontal in einem sicheren Eihalter. Erstellen Sie ein kleines Loch in der Oberseite der Eierschale in der Nähe des spitzen Endes des Eies mit dem scharfen Ende der Sezierschere.

Führen Sie eine abgeschrägte Injektionsnadel mit 18 Gauge durch das Loch ein. Wenn die Nadel auf den Boden der inneren Oberfläche des Eies gedrückt wird und die abgeschrägte Seite der Nadel dem spitzen Ende des Eies zugewandt ist, entfernen Sie zwei bis drei Milliliter des Albumins aus dem Hühnerei und entsorgen Sie. Reinigen Sie die Eierschalenoberfläche, die das Loch umgibt, mit fusselfreien Tüchern, die leicht mit 70% Ethanol angefeuchtet sind, und wischen Sie sie trocken.

Verschließen Sie das Loch zum Entfernen von Albumin mit durchsichtigem Klebeband. Machen Sie mit dem scharfen Ende der Sezierschere ein zweites Fensterloch in die Oberseite der Eierschale. Stellen Sie sicher, dass die Schere nicht zu weit in die Eierschale hineinreicht, um zu vermeiden, dass der Embryo oder das embryonale Gefäß, das sich direkt unter der Seite des zweiten Lochs befindet, berührt und beschädigt wird.

Erweitern Sie das Fensterloch mit einer gekrümmten Pinzette auf einen Durchmesser von etwa zwei bis drei Zentimetern, um den sich entwickelnden Embryo unter der Schale freizulegen und Zugang zu ihm zu erhalten. Setzen Sie nun ein Ende der Pinzette in das Loch ein und halten Sie es parallel zur Eierschale und dicht nebeneinander. Wenn das andere Zangenende außerhalb der Eierschale positioniert ist, drücken Sie die beiden Pinzettenenden vorsichtig zusammen, damit sie kleine Stücke der Eierschale brechen und entfernen können.

Fahren Sie fort, Eierschalenfragmente zu brechen und zu entfernen, bis ein zwei bis drei Zentimeter großes Fenster übrig bleibt, das den Embryo direkt überlagert. Um die bakterielle Kontamination zu begrenzen, fügen Sie 100 bis 200 Mikroliter Ringerlösung mit 50 Einheiten pro Milliliter Penicillin und 50 Mikrogramm pro Milliliter Streptomycin durch das Fensterloch hinzu. Versiegeln Sie das Fensterloch mit klarem Klebeband.

Führen Sie diese Eiversiegelung durch, indem Sie eine Ecke des Bandes auf der Längsachse des Lochs ausrichten und das Band ein bis zwei Zentimeter vom Rand des Lochs entfernt auf die Schale drücken. Schließen Sie die Öffnung weiter ab, bis auf einer Seite eine hängende Klebebandklappe übrig bleibt. Drücken Sie die beiden Stücke Klebeband zusammen, wodurch eine gewölbte Form über das Loch entsteht, und drücken Sie die Klappe aus überhängendem Klebeband auf die Schale, um das Siegeln des Eies abzuschließen.

Geben Sie die Eier mit Fenster zur weiteren Entwicklung in den Inkubator zurück. Stellen Sie sicher, dass diese Eier horizontal gehalten werden und schalten Sie die Schaukelfunktion der Inkubatoren aus. Verwenden Sie ein Seziermikroskop, um sicherzustellen, dass sich der Embryo im richtigen Entwicklungsstadium befindet, und lokalisieren Sie die Positionen der amniochorionischen Membran und der chorioallantoischen Membran.

Verwenden Sie dann eine sterilisierte Mikrosezierungsschere, um ein Loch in die amniochorionische Membran direkt über dem Vorderglied zu schneiden, das sich von der Membran über dem Vorderglied bis zur Membran über dem Kopf erstreckt. Verwenden Sie zwei Paar feine sterile Pinzetten und greifen Sie das Amnion vorsichtig in zwei benachbarten Positionen zwischen der amniochorionischen Membran ACM und der chorioallantoischen Membran. Bewegen Sie vorsichtig jedes Paar Pinzetten, die beide die Fruchthaut fest greifen, voneinander weg, wobei sich ein Paar dorsal zum Embryo und das andere ventral bewegt.

Verwenden Sie sterilisierte feine Pinzetten, um die verbleibende Amnionmembran, die den Embryo bedeckt, zu sezieren und zu entfernen. Greifen Sie mit sterilisierten Pinzetten das Amnion in der Nähe der mittleren Schädelregion des Embryos und ziehen Sie das Amnion vorsichtig in eine Verhätschelrichtung in Bezug auf den Embryo in Richtung der früher verschobenen chorioallantoischen Membran. Verschließen Sie das Fensterloch erneut mit durchsichtigem Klebeband, wie im Manuskript beschrieben, und bringen Sie das Ei zur weiteren Entwicklung in den Inkubator zurück.

Die zusätzlichen embryonalen Membranen müssen möglicherweise neu positioniert werden, um sicherzustellen, dass das rechte Auge zugänglich ist. Wenn das rechte Auge aufgrund der Position des Embryos in der Eizelle nicht für eine Verwundung zugänglich ist, kann es als nicht verwundete Kontrolle dienen. Verwenden Sie ein Mikro-Seziermesser, um einen Schnitt zu machen, der die Ausdehnung der Hornhaut des rechten Auges überspannt, die parallel zum Aderhautgewebe und inline mit ihm ist.

Verwenden Sie das Mikro-Seziermesser, um die Hornhaut wieder an der gleichen Stelle wie der erste Schnitt zu zerreißen, zweimal mehr so, dass der Schnitt zwei und der Schnitt drei zusammen mit der gleichen Position in der Hornhaut wie eins schneiden. Um die Lebensfähigkeit zu verbessern, verwenden Sie die gekrümmte Iriszange, um den Embryo nach der Operation wieder unter die chorioallantoische Membran zu stecken, um das richtige Wachstum der chorioallantoischen Membran zu fördern. Als nächstes fügen Sie drei bis vier Tropfen Ringerlösung hinzu, die Antibiotika enthält, um den Embryo mit Feuchtigkeit zu versorgen und das Ei zu sterilisieren.

Verschließen Sie das Fensterloch wieder mit durchsichtigem Klebeband und kehren Sie zum Inkubator zurück, wobei das Ei horizontal bleibt. Lassen Sie den Embryo sich entwickeln und die Hornhautwunde für einen gewünschten Zeitraum heilen. Euthanasieren Sie nach der Inkubation den Embryo und verwenden Sie eine gekrümmte Iriszange, um das Auge in einer Petrischale mit Ringers Kochsalzlösung zu ernten, indem Sie das Auge sanft auf seiner hinteren Seite greifen, wo sich das Auge und das Gesichtsgewebe treffen, und vorsichtig das ganze Auge weg und frei vom Gesichtsgewebe heben.

Verwenden Sie eine feine Pinzette, um ein kleines Loch von drei bis fünf Zentimetern in den Rücken des ganzen Auges zu stechen und fixieren Sie das ganze Auge in 4% Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius über Nacht mit leichter Erregung. Um eine ideale Wunde zu erreichen, ist es wichtig, ein scharfes Mikrodissektionsmesser zu verwenden und während der Platzwunde den richtigen Druck auszuüben. Wenn Sie zu wenig Druck ausüben, führt dies zu einer flachen Wunde, die das Hornhautepithel reißt, ohne das vordere Stroma ausreichend zu durchdringen.

Wenn zu viel Druck ausgeübt wird, führt dies zu einer vollständigen Wunde, die das gesamte Stroma durchdringt und den Kammerwasser der äußeren Umgebung aussetzt. Die Durchführung der richtigen zerreißenden Schnitte erzeugt eine ideale Wunde, die sich zunächst null bis drei Tage nach der Wunde vergrößert. Danach kommt es zu einer Reepithelialisierung und Neubildung von Gewebe, um die Wunde nach der Verwundung um 11 Tage narbenfrei zu schließen.

Es wurde festgestellt, dass die raumzeitliche Lokalisation der extrazellulären Matrixproteine, Fibronektin und Tenascin innerhalb der heilenden Wunde zu Zeitpunkten, die der Reepithelialisierung der Hornhaut entsprechen, erhöht war, was auf ihre Beteiligung am Wundverschluss, der Migration von Epithelzellen und dem Überleben hindeutet. Die Immunhistochemie des gesamten Berges zeigte, dass die Nerven, die der verwundeten zentralen Hornhaut direkt gegenüberstanden, vorübergehend vom heilenden Hornhautgewebe gehemmt werden. Trotz früherer Hemmung innervieren die Hornhautnerven schließlich das vollständig verheilte Hornhautgewebe 11 Tage nach der Verwundung auf ähnliche Dichteniveaus und in ähnlichen Mustern wie die nicht verwundeten Kontrollen am 18. Tag.

Wie die harmonische Bildgebung der zweiten Generation zeigt, sind Bündel von Kollagenfasern in unterschiedlichen Tiefen der zentralen Hornhautwunde orthogonal angeordnet, die der nativen Makrostruktur des nicht verwundeten zentralen Hornhautgewebes entsprechen. In Kombination mit klassischen entwicklungsbiologischen Ansätzen wie Gewebetransplantation und Perlenimplantation sowie modernen Ansätzen zur Genmanipulation wie retroviraler Infektion und DNA-Elektroporation verspricht dieses Tiermodell, molekulare Faktoren und zelluläre Mechanismen aufzudecken, die notwendig sind, um die heilung narbenloser Hornhautwunden zu fördern. Die Bestimmung wichtiger molekularer Faktoren in Matrixproteinen, die die heilung von fetalen narbenlosen Wunden regulieren, wird den Weg für Therapien ebnen, die einen erholsameren Heilungsprozess mit weniger Narbenbildung und besserer Rekapitulation der normalen Gewebearchitektur fördern.