Name: Bildgebung der Migration von Neutrophilen in der Maushaut zur Untersuchung des subzellulären Membranumbaus unter physiologischen Bedingungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Entdecken Sie die intravitale subzelluläre Mikroskopie zur Untersuchung der Membranremodellierung während der Neutrophilenmigration in der Maushaut. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung zellulärer Dynamiken im lebenden Gewebe.

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Diese Forschung wurde durch das intramurale Forschungsprogramm der National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research unterstützt.

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Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Trotz jahrzehntelanger Fortschritte auf dem Gebiet der Zellmigration und des Membranumbaus haben nur sehr wenige Studien IVM eingesetzt, um subzelluläre Merkmale bei lebenden Tieren sichtbar zu machen. Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren bieten ein leistungsfähiges Werkzeug, um neue Einblicke in die Migration von Neutrophilen in lebenden Tieren und insbesondere in den Umbau der Plasmamembran während dieses Prozesses zu gewinnen. Dieser Ansatz ermöglicht es, die Migration von Neutrophilen unter physiologischen Bedingungen unter Berücksichtigung der inhärenten Komplexität der Mikroumgebung des Gewebes zu untersuchen. In der Tat ermöglicht die Verwendung von MPM die Visualisierung mehrerer Merkmale innerhalb des Wirtsgewebes durch die Verwendung einer Kombination von Mausstämmen, die ausgewählte Fluoreszenzmarker exprimieren, exogener Gewebemarkierung, Anregung endogener Fluoreszenz und Signalen, die durch SHG oder THG erzeugt werden12,13.
Ein mögliches Problem, das bei diesem Verfahren zu berücksichtigen ist, sind Lichtschäden. Auch wenn MPM in Bezug auf Photobleichung und Phototoxizität im Allgemeinen sicherer ist als die konfokale Mikroskopie, ist bei der Bildgebung von lebendem Gewebe Vorsicht geboten34. Phototoxizität kann die Ergebnisse drastisch beeinträchtigen, indem sie entweder bildgebende Artefakte erzeugt, die von kleinen hellen Flecken bis hin zu größeren Bereichen geschädigten Gewebes reichen, oder indem sie eine Vielzahl von intrazellulären Signalwegen hemmt/stimuliert. Um Phototoxizität zu verhindern, sollte die Laserleistung auf ein Minimum beschränkt werden, und es müssen geeignete Kontrollen entwickelt werden, um zu überprüfen, ob physiologische Bedingungen eingehalten werden (z. B. Messung des Blutflusses, Sonden auf oxidativen Stress)35,36. Darüber hinaus werden bei diesem speziellen Verfahren, an dem die Haut beteiligt ist, Albino-Stämme dringend empfohlen, da das Melanin, das bei dunkelhaarigen Tieren vorhanden ist, empfindlicher auf Phototoxizität reagiert 36,37,38.
Zu den Haupteinschränkungen des Verfahrens gehören das verwendete Mikroskopsystem und die Art der Neutrophilen. Obwohl die Verwendung von MPM die Tiefe der Gewebebildgebung im Vergleich zu anderen lichtmikroskopischen Techniken (z. B. Konfokal, Spinning-Disk) erheblich erhöht, ist die Möglichkeit, die subzelluläre Dynamik im Ohr sichtbar zu machen, auf die äußersten Schichten des Gewebes (80-100 μm) beschränkt. Dies ist auf die intensive Lichtstreuung zurückzuführen, die von der dicken ECM-Schicht erzeugt wird und es schwierig macht, die Migration in den tieferen Schichten zu untersuchen. Eine weitere Einschränkung ist die Tatsache, dass Neutrophile sehr kurzlebig sind und nicht lange genug in Kultur gehalten werden können, um Gen-Editing-Techniken durchzuführen. Dies kann überwunden werden, indem Mäuse so verändert werden, dass sie Neutrophile produzieren, denen bestimmte Gene fehlen oder die ausgewählte Mutationen beherbergen, was natürlich die Forschungskosten und die Forschungsdauer erhöht.
Die hier beschriebenen Verfahren sind zwar auf die Untersuchung der Membrandynamik ausgelegt, können aber nicht nur bei Neutrophilen, sondern auch bei anderen Immunzelltypen und wandernden Zellen auf jede zellbiologische Fragestellung zugeschnitten werden. Die Informationen, die durch IVM mit geringer Vergrößerung über zelluläre Verhaltensweisen (z. B. wandernder Phänotyp, Zellgeschwindigkeit und Richtungsabhängigkeit22) gesammelt wurden, können mit mechanistischen Informationen ergänzt und korreliert werden, die durch ISMic über die Neupositionierung von Organellen, die Proteinsekretion, die Endozytose, die Kerndynamik, die Kalziumdynamik, die Organisation des Zytoskeletts und die Netose gewonnen wurden. Der Einsatz pharmakologischer und/oder genetischer Manipulationen kann die Rolle spezifischer molekularer Signalwege in dem interessierenden Prozess hervorheben, was dies zu einem einzigartigen und sehr leistungsfähigen Ansatz macht.

Die gerichtete Zellmigration ist ein kritisches Ereignis, das während verschiedener physiologischer und pathologischer Prozesse auftritt, einschließlich Entwicklung, Immunantwort, Gewebereparatur sowie Tumorinitiierung, -progression und -verbreitung 1,2. Dieser Prozess beruht auf spezifischen extrazellulären chemotaktischen Signalen, die von ihren verwandten Rezeptoren an der Plasmamembran wahrgenommen und dann in komplizierte intrazelluläre Signale umgewandelt werden. Diese Signalwege wiederum aktivieren die Zellmigration durch eine Reihe von Reaktionen, darunter die lokale Aktivierung des Zytoskeletts, Membrantransport und -umbau sowie die Zellpolarisation3. Zwei unterschiedliche Arten der Zellmigration wurden gut charakterisiert: mesenchymale und amöboide4. Die mesenchymale Migration ist relativ langsam (<1 μm/min), beruht auf einer starken Adhäsion zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix (EZM) und hängt von einem durch Metalloproteasen induzierten Matrixabbau ab. Im Gegensatz dazu ist die Amöbenmigration, eine Eigenschaft von Immunzellen, die schnell auf Entzündungsreize reagieren, schneller (>10 μm/min) und nutzt schwache Adhäsionen, um durch die EZM zu navigieren. Unabhängig von der Modalität erfordert die Zellmigration einen ständigen Umbau der Plasmamembran, was zur Bildung von protrusiven Strukturen an der Vorderkante der Zellen führt, die eng mit der Retraktion der Membran an der Rückseite koordiniert sind1.
Um die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die diesen subzellulären Prozessen zugrunde liegen, ist es von grundlegender Bedeutung, die Dynamik der Membranen in wandernden Zellen mit einer angemessenen zeitlichen und räumlichen Auflösung sichtbar zu machen. Da der Membranumbau stark von den Eigenschaften der Mikroumgebung des Gewebes beeinflusst wird, die die wandernden Zellen umgibt, ist es außerdem von entscheidender Bedeutung, diesen Prozess direkt im nativen Gewebe, in lebenden Tieren, abzubilden. Dies wird durch den Einsatz der Intravitalmikroskopie (IVM)5 erreicht. Die allererste IVM-Bildgebung wurde vor ~200 Jahren durchgeführt, als die Leukozytenextravasation mit einem einfachen Trans-Illuminationsmikroskop6 sichtbar gemacht wurde, und danach wurde die IVM hauptsächlich an halbtransparenten Modellorganismen wie Zebrafischen und Drosophila eingesetzt 7,8. In den letzten zwei Jahrzehnten wurde die IVM erfolgreich eingesetzt, um zelluläre Prozesse bei Mäusen, Ratten und größeren Säugetieren wie Schweinen zu untersuchen 5,9. Möglich wurde dies durch 1) bedeutende Entwicklungen in der konfokalen und Multiphotonenmikroskopie (MP) und 2) die Entwicklung von Gen-Editing-Technologien wie CRISPR-Cas9, die die schnelle Entwicklung einer Vielzahl von Tiermodellen zur Expression fluoreszenzmarkierter Proteine und Reporter ermöglicht haben. Darüber hinaus wurde die Visualisierung einzelner Zellen und ihrer Mikroumgebung während Prozessen wie der Tumorinitiierung, der Zellmigration und der Immunantwort sowohl durch andere Formen der exogenen Markierung, wie die systemische Einführung von Farbstoffen zur Markierung des Gefäßsystems10,11, als auch durch die Anregung endogener Moleküle, wie z.B. Kollagen durch die Zweite Harmonische Generation (SHG)10, ermöglicht. 12 und Nervenfasern durch die Dritte Harmonische Generation (THG)11,13. Schließlich hat eine Verbesserung der Techniken zur Minimierung von Bewegungsartefakten aufgrund von Herzschlag und Atmung zur Entwicklung der intravitalen subzellulären Mikroskopie (ISMic) geführt, die es den Forschern ermöglicht hat, mehrere subzelluläre Ereignisse direkt in lebenden Tieren mit einer ähnlichen Auflösung wie in vitro abzubilden und zu untersuchen 14,15,16,17. Beispiele für ISMic sind die Untersuchung der Zytoskelettdynamik während der Exozytose 14,15,16,17 und Endozytose15, der dynamische Umbau des Zytoskeletts während der Zellmigration 17,18, die mitochondriale Lokalisation und der Metabolismus19,20 und die Kalziumsignalisierung im Gehirn 21.
Dieses Protokoll beschreibt die verschiedenen Schritte und Verfahren zur Untersuchung des Zellmembranumbaus bei subzellulärer Auflösung während der Migration von Neutrophilen in der Ohrhaut einer lebenden Maus mit ISMic. Dieser Ansatz basiert auf den zuvor beschriebenen Protokollen22,23 und ist angepasst, um eine höhere räumliche und zeitliche Auflösung zu erreichen.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Röhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>27 G Nadel</td><td>Kendall</td><td>827112</td><td></td></tr><tr><td>27 G geflügeltes Infusionsset</td><td>Terumo</td><td>SV*27EL</td><td></td></tr><tr><td>30x Objektiv</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO30XS</td><td>1,05 NA, Silikonöl-Immersion</td></tr><tr><td>40x</td><td>Objektiv Olympus</td><td>UPLSAPO40XS</td><td>1,23 NA, Silikonöl-Immersion</td></tr><tr><td>60 mm Schalen</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6 mL</td><td>Spritze Kendall</td><td>8881516937</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazin (10 mg/ml)</td><td>Vet one</td><td>13985-587-50</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysepuffer</td><td>Qualität Biologisch</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>AND</td><td>EK-1200A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Zellensieb 40 & micro; m</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td>Bildvisualisierungs-/-analysesoftware</td></tr><tr><td>Fluoview Software</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Erfassungssoftware</td></tr><tr><td>FVB Mausstamm</td><td>Jackson</td><td>N/A</td><td>FVB Hintergrund</td></tr><tr><td>Gas Anästhesiesystem</td><td>Patterson veterinary</td><td>07-8915712</td><td>Link 7 Modell</td></tr><tr><td>Green Cell Tracker</td><td>Thermo</td><td>C2925</td><td>Solubilisiert in Zellkulturqualität DMSO für eine Konzentration von 1 mM (1000x)</td></tr><tr><td>Haarentfernungscreme</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (ohne Ca2+, Mg2+)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M pH 7,3</td><td>Qualität Biologisch</td><td>118-089-721</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1991</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11191-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>Bildvisualisierungs-/Analysesoftware</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Vet one</td><td>13985-528-40</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (100 mg/ml)</td><td>Vet one</td><td>13985-584-10</td><td></td></tr><tr><td>LyzM-cre x mT/mG</td><td>im Labor erzeugt</td><td>N/A</td><td>C57BL/6J Hintergrund</td></tr><tr><td>Manueller Mikromanipulator</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB MatWorks</td><td></td><td>N/A</td><td>Analysesoftware</td></tr><tr><td>mtomato Mausstamm</td><td>im Labor erzeugt</td><td>N/A</td><td>mT/mG, FVB Hintergrund</td></tr><tr><td>Multiphotonenlaser</td><td>Spectra Physics</td><td>Insight DS+</td><td></td></tr><tr><td>Multiphotonenmikroskop</td><td>Olympus</td><td>MPE-RS</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 10 &micro; L Spritze</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 33 G Nadel</td><td></td><td>WPI NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Objektiver Heizer</td><td>Bioptechs</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Objektiver Heizregler</td><td>Bioptechs</td><td>150803</td><td></td></tr><tr><td>Ophtalmic Salbe</td><td>Major</td><td>NDC 0904-6488-38</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoffkonzentrator</td><td>Caire</td><td>VisionAire 5</td><td></td></tr><tr><td>PBS (ohne Ca2+, Mg2+)</td><td>Qualität Biologisch</td><td>114-058-131</td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td>Qualität Biologisch</td><td>114-055-101</td><td></td></tr><tr><td>Tischheizung</td><td>Okolab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tischheizungssteuerung</td><td>Okolab</td><td>H401-T</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisches Klebeband</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td>Hypoallergener</td></tr><tr><td>Spritzentreiber</td><td>Harvard Apparat</td><td>PHD Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Wärmekissen</td><td>Parkland Scientific</td><td>A2789B</td><td></td></tr><tr><td>Wärmepumpe</td><td>Parkland Scientific</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin (100 mg/ml)</td><td>Vet one</td><td>13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

bildgebung der migration von neutrophilen in der maushaut zur untersuchung des subzellulären membranumbaus unter physiologischen bedingungen

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

Die Erforschung der Rekrutierung und Funktion von Immunzellen in Geweben war in den letzten zwei Jahrzehnten ein sehr aktives Feld. Neutrophile Zellen gehören zu den ersten Immunzellen, die den Ort der Entzündung erreichen und an der angeborenen Immunantwort während einer Infektion oder Gewebeschädigung teilnehmen. Bisher wurde die Migration von Neutrophilen erfolgreich mit verschiedenen experimentellen In-vitro-Systemen visualisiert, die auf einer einheitlichen Stimulation oder einer eingeschlossenen Migration unter Agarose oder mikrofluidischen Kanälen basieren. Diese Modelle rekapitulieren jedoch nicht die komplexe Mikroumgebung, in der Neutrophile in vivo vorfinden. Die Entwicklung von auf Multiphotonenmikroskopie (MPM) basierenden Techniken, wie z. B. die intravitale subzelluläre Mikroskopie (ISMic), bietet ein einzigartiges Werkzeug, um die Dynamik von Neutrophilen bei subzellulärer Auflösung unter physiologischen Bedingungen zu visualisieren und zu untersuchen. Insbesondere das Ohr einer lebend anästhesierten Maus bietet aufgrund seiner einfachen Zugänglichkeit und der fehlenden chirurgischen Exposition einen experimentellen Vorteil, um die interstitielle Migration von Neutrophilen in Echtzeit zu verfolgen. ISMic bietet die optische Auflösung, Geschwindigkeit und Erfassungstiefe, die erforderlich sind, um sowohl zelluläre als auch vor allem subzelluläre Prozesse in 3D über die Zeit (4D) zu verfolgen. Darüber hinaus kann die multimodale Bildgebung der interstitiellen Mikroumgebung (d. h. Blutgefäße, residente Zellen, extrazelluläre Matrix) leicht mit einer Kombination aus transgenen Mäusen, die ausgewählte Fluoreszenzmarker exprimieren, exogener Markierung über Fluoreszenzsonden, intrinsischer Gewebefluoreszenz und erzeugten Signalen der zweiten/dritten Harmonischen durchgeführt werden. Dieses Protokoll beschreibt 1) die Vorbereitung von Neutrophilen für den adoptiven Transfer in das Mausohr, 2) verschiedene Einstellungen für eine optimale subzelluläre Bildgebung, 3) Strategien zur Minimierung von Bewegungsartefakten bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung einer physiologischen Reaktion, 4) Beispiele für Membranumbau, die bei Neutrophilen mit ISMic beobachtet wurden, und 5) einen Arbeitsablauf für die quantitative Analyse des Membranumbaus bei migrierenden Neutrophilen in vivo.

Hier werden zwei verschiedene Ergebnissätze vorgestellt, um die klassische IVM und ISMic zu veranschaulichen, die eine zelluläre bzw. subzelluläre Auflösung bieten. Im ersten Beispiel wurden Neutrophile aus einer Wildtyp-Maus (WT) aufgereinigt, mit Cell Tracker Green markiert, um das Zytoplasma zu färben, und in eine transgene Maus injiziert, die ein fluoreszierendes Protein exprimierte, das auf die Plasmamembran abzielt (mTomato-Maus, auch bekannt als mT/mG33, Abbildung 1 und Film 1 und Film 2). Diese Empfängermaus ermöglichte die Visualisierung von strukturellen Merkmalen im Ohrgewebe wie Blutgefäße, ansässige Zellen und Haarfollikel (Abbildung 1C und Film 1) über einen IVM-basierten Ansatz (Schritt 6.8.1). Kollagenfasern, die über SHG nachgewiesen wurden (nachgewiesen bei der halben Wellenlänge der Anregung), wurden in einem komplizierten Netzwerk in der Dermis angeordnet, wo Neutrophile injiziert wurden. Entlang des Randes der Haarfollikel (HF) wurde eine Schicht von Epithelzellen (d.h. Keratinozyten) beobachtet. Gelegentlich wurden Artefakte von Haarresten sichtbar, die zu einer lokalen Vertiefung der Haut führten (H). Die laserinduzierten Verletzungen waren aufgrund ihrer starken Autofluoreszenz, die in allen Kanälen nachgewiesen wurde, und aufgrund der Veränderungen der Kollagenanordnung leicht sichtbar (Abbildung 1D). Eine vollständigere Ansicht der 3D-Architektur der Haut und der Lokalisierung der injizierten Neutrophilen kann in Film 1 genossen werden, der einen Z-Stapel der Haut von der äußeren zur inneren Schicht und ein 3D-Volumen-Rendering darstellt. Die Zeitrafferbildgebung zeigte, dass die Neutrophilen die Ohrhaut beprobten und mit der EZM und dem Wirtsgewebe interagierten (Video 2). Die Bildgebung mit dieser Auflösung und die Erfassung eines Z-Stacks alle 30 s ermöglicht die Zellverfolgung und die Messung von Motilitätsparametern (d. h. Geschwindigkeit und Richtung), aber eine präzise und detaillierte Analyse des Membranumbaus ist bei dieser Auflösung eine Herausforderung.
Im zweiten Beispiel wurde der Membranumbau mit dem ISMic-Ansatz (Schritt 6.8.2) unter Verwendung von mGFP-exprimierenden Neutrophilen bewertet, die aus LyzM-cre mT/mG-Mäusen gereinigt und in WT-Tiere injiziert wurden (Abbildung 2A, experimentelles Flussdiagramm). Unter Verwendung des ISMic-Protokolls (Video 3 und Standbilder in Abbildung 2B) und nach Laserverletzung wird ein dynamischer Umbau der Plasmamembran während der Migration beobachtet, und die Bildung von Membranvorsprüngen an der Vorderkante und die Retraktion der Rückseite der Zellen werden deutlich sichtbar gemacht (Abbildung 2 und Video 3). Die Zeitraffersequenzen, die in Film 3 hervorgehoben werden, zeigen die Komplexität der Interaktionen mit dem ECM. Tatsächlich wanderten Neutrophile durch den interstitiellen Raum und bewegten sich entweder entlang der Fasern oder in den Zwischenräumen. Schließlich wurden quantitative Aspekte wie die Krümmungsänderungen und die Flächenänderungen an der Vorder- und Rückseite der Zellen für jeden Zeitpunkt quantifiziert. Am Beispiel der in Abbildung 2B beschriebenen Zelle wurde die lokale Dynamik der Plasmamembran mit Hilfe einer Algorithmus-Pipeline (siehe Schritt 7) analysiert, die auf der Identifizierung von 100 Grenzpunkten unter der Zelloberfläche basiert (Abbildung 3A). Die Änderungen der lokalen Krümmung (Abbildung 3B) und des durch Plasmamembranvorsprünge unterstrichenen Bereichs (Abbildung 3C) wurden für jeden Grenzpunkt berechnet und für jeden Zeitrahmen als Kymographen berichtet (Abbildung 3D,E). Sowohl die Vorder- als auch die Rückseite der Zellen weisen eine höhere Krümmung auf als die Seite der Zellen (Abbildung 3D). Negative Bereichsänderungen (Retraktionen, blaue Bereiche) sind an der Rückseite der Zellen deutlicher als an der Vorderkante, wo die positiven Flächenänderungen stärker ausgeprägt sind (Vorsprünge, rote Bereiche) (Abbildung 3E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig01.jpg"> Abbildung 1: IVM von Neutrophilen in der Haut des Mausohrs. (A) Schematische Darstellung des Ohraufbaus auf dem Mikroskoptisch. (B) Experimentelles Flussdiagramm. (C) Repräsentatives Bild der Ohrhaut einer mTomato-Maus, der fluoreszenzmarkierte Neutrophile injiziert wurden, mit unterschiedlichen Projektionen. Haarfollikel (HF), Blutgefäß (BV), Epidermis (E), Dermis (D), Basalzellschicht (BCL) und Haarartefakt (aufgrund von Haarresten an der Hautoberfläche, H). (D) Repräsentatives Bild der Haut von Mäusen nach einer sterilen Laserverletzung: blauer Kanal (rechts), grüner und roter Kanal (Mitte), zusammengeführtes Bild (links). Die Verletzung ist auf der linken Seite des Bildes durch eine starke Autofluoreszenzemission sowohl im grünen als auch im roten Kanal sowie durch eine Störung der EZM sichtbar, die durch die Bildung eines Lochs in den Kollagen-I-Fasern beobachtet wird. In C und D, Grün: Neutrophile; Rot: Wirtsgewebe der Maus; Cyan: Kollagen-I SHG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig02.jpg"> Abbildung 2: Zeitraffer der Migration von mGFP-Neutrophilen in einem WT-Mausohr. (A) Experimentelles Flussdiagramm. (B) Repräsentative Standbilder aus Film 3. (C) Volumen-Rendering derselben Zelle zur Visualisierung der 3D-Organisation der Membran. Der Bereich der hohen Membrandynamik wird durch einen Pfeil verdeutlicht (rot für Retraktion und blau für Protrusion). (D) Nahaufnahme und geneigte Visualisierung des gerenderten Zellenvolumens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63581/63581fig03.jpg"> Abbildung 3: Analysepipeline zur Quantifizierung der Membrandynamik, die mit ISMic erfasst wurde. (A) Bestimmung der Zellkontur und Aufteilung der Grenzpunkte (100 Grenzpunkte) zwischen zwei aufeinanderfolgenden Frames für mGFP-Neutrophile, beschrieben in Abbildung 2B. (B) Farbige Berandungen stellen die lokale Membrankrümmung dar, die für jeden Grenzpunkt bestimmt wird. (C) Der lokale Bereich ändert sich zwischen zwei aufeinanderfolgenden Bildern (aktuell: blau und nächste: rot). Die grünen Bereiche stellen die Tracking-Ergebnisse der lokalen Membranbewegung dar. Gelbe Pfeile zeigen die allgemeine Richtung der Membranverschiebung an. (D) Grenzkrümmungskymograph der Zelle im Zeitverlauf. Die vertikale Achse stellt die Indizes der Randpunkte dar, wobei 1 und 100 die Rückseite der Zelle entsprechend ihrer Migrationsrichtung darstellen. (E) Kymograph der lokalen Flächenveränderung, der die Membranprotrusion (rot) und die Membranretraktion (blau) der Zelle im Laufe der Zeit widerspiegelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/63581fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Film 1: Grün markierte Neutrophile in einem mTomato-Mausohr mittels IVM sichtbar gemacht. Rot: mTomate Wirtsmausgewebe. Cyan: Kollagen-I SHG; Grün: neutrophil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie1_Jove_final.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.</a>
Film 2: IVM von Neutrophilen, die in die Haut eines mTomato-Mausohrs wandern. Videos sind Projektionen eines Bildstapels mit maximaler Intensität, die für ͂27 min mit einer Bildrate von 5 Bildern/s aufgenommen wurden. Rot: mTomate Wirtsmausgewebe. Cyan: Kollagen-I SHG; Grün: neutrophil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie2_Jove_final.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.</a>
Film 3: ISMic des Membranumbaus während der Migration von Neutrophilen in einem WT-Mausohr. Videos sind Projektionen eines Bildstapels mit maximaler Intensität, die für ͂8 min mit einer Bildrate von 10 Bildern/s aufgenommen wurden. Rot: mTomate Wirtsmausgewebe. Cyan: Kollagen-I SHG; Grün: mGFP-Neutrophile; Hellgrün: ausgeschmolzene Neutrophile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63581/Movie3_Jove_final.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.</a>

Die Migration von Neutrophilen beruht auf dem schnellen und kontinuierlichen Umbau der Plasmamembran als Reaktion auf den Chemolockstoff und seine Wechselwirkungen mit der extrazellulären Mikroumgebung. Hierin wird ein Verfahren beschrieben, das auf der Intravitalen Subzellulären Mikroskopie basiert, um die Dynamik des Membranumbaus bei Neutrophilen zu untersuchen, die in das Ohr von anästhesierten Mäusen injiziert werden.

Bildgebung der Migration von Neutrophilen in der Maushaut zur Untersuchung des subzellulären Membranumbaus unter physiologischen Bedingungen

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Diese Methode beschreibt eine Technik zur Untersuchung des Membranumbaus während der Migration von Neutrophilen beim lebenden Tier mittels intravitaler subzellulärer Mikroskopie. Dieses Protokoll bietet einen einzigartigen Ansatz, um die Membrandynamik während der Tiermigration unter physikalischen Bedingungen zu untersuchen und die Mikroumgebung des Gewebes zu entschlüsseln. Diese Technik kann so angepasst werden, dass sie den Membranumbau und das Zytoskelett, die dynamische Organrepositionierung und den Membrantransport in verschiedenen Zelltypen und wandernden Zellen berücksichtigt.Zu Beginn fügen Sie den grünen Fluoreszenzfarbstoff zur Neutrophilensuspension hinzu, die von der Wildtyp-Maus in 1,5 Millilitern BSA-beschichtetem Röhrchen gereinigt wurde. 30 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren in einem Röhrchenrotator inkubieren. Geben Sie drei Waschgänge mit HBSS, gefolgt von einer Zentrifugation bei 400 mal G bei Raumtemperatur für fünf Minuten und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Hanks'Balanced Salt Solution.Geben Sie diese Suspension in das BSA-beschichtete Rohr in einem Rohrrotator unter leichtem Rühren bis zum Injektionsvorgang. Vor der Injektion resuspendieren Sie das Zellpellet in Kochsalzlösung, um eine Dichte von 2 bis 5 Millionen Zellen pro 20 Mikroliter zu erreichen. Bringen Sie das betäubte Tier auf ein Wärmekissen mit 37 Grad Celsius, um seine Körpertemperatur zu halten.Nachdem Sie den Pfotenentzugsreflex getestet haben, entfernen Sie die Haare mit einem feinen Trimmer aus dem Ohr, um die Bildqualität zu optimieren. Legen Sie das Tier auf die Seite, halten Sie den Rand des Ohrs fest und glätten Sie es mit dem chirurgischen Klebeband entlang des Wärmekissens, füllen Sie dann eine Spritze mit einer 33-Gauge-Nadel mit der Neutrophilensuspension und montieren Sie sie auf einen Mikromanipulator. Bewegen Sie die Nadel vorsichtig in Richtung Ohr und stechen Sie langsam in die Haut.Sobald sich die Nadel in der Haut befindet, drücken Sie langsam auf den Kolben und geben Sie zwei bis drei Mikroliter Zellsuspension ab. Nachdem Sie die Injektion für zwei bis drei verschiedene Bereiche des Ohrs vorsichtig wiederholt haben, entfernen Sie vorsichtig das chirurgische Klebeband und lassen Sie das Tier unter Aufsicht wieder zu Bewusstsein kommen. Lassen Sie das Tier vor der Bildgebung eine Stunde ruhen, damit sich das Gewebe und die Zellen von der Injektion erholen können.Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop eingeschaltet ist und der Tisch und die Linsen auf 37 Grad Celsius vorgeheizt sind, bevor Sie das betäubte Tier auf den Mikroskoptisch legen. Decken Sie das Loch in der Bühne mit einem Glasdeckglas ab. Bewegen Sie das betäubte Tier vorsichtig auf die Bühne.Wenn die Bildgebung länger als eine Stunde geplant ist, tragen Sie die Augensalbe auf und sichern Sie das auf Flügelinfusionen basierende Perfusionssystem. Geben Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf die Mitte des Deckglases und legen Sie das injizierte Ohr der Neutrophilen darauf. Glätten Sie das Ohr vorsichtig mit einem sterilen Wattestäbchen in der Mitte des Deckglases, um Lufteinschlüsse zu entfernen.Sichern Sie das Ohr, indem Sie einen Holzstab vorsichtig an die Seite des Ohrs drücken, näher an den Kopf des Tieres, und ihn mit Klebeband verriegeln. Suchen Sie dann mit dem Mikroskop-Okular einen Interessenbereich und wechseln Sie in den Multiphotonen-Erfassungsmodus. Stellen Sie die Wellenlänge der Laseranregung auf 900 bis 930 Nanometer ein, um die gleichzeitige Erfassung von grünem Fluoreszenzfarbstoff, mTomato und Kollagen-I zu ermöglichen.Stellen Sie dann die entsprechenden Spiegel- und Filterkombinationen auf die Detektoren ein, um das emittierte Licht zu sammeln. Bestimmen Sie die Einstellung, die für die Hardwarekonfiguration am besten geeignet ist. Auch wenn migrierende Zellen in Intervallen von 30 Sekunden bis zu einer Minute verfolgt werden können, bilden subzelluläre Ereignisse mit einer höheren Geschwindigkeit von mindestens weniger als zehn Sekunden ab.Verwenden Sie bei der klassischen intravitalen Mikroskopie ein 30-faches Objektiv und einen Galvo-Scanner mit einer Bildgröße von 512 x 512 Pixeln, um die Zellmigration zu verfolgen und das Gewebe der Wirtsmaus zu untersuchen, und stellen Sie die Verschiebung der Z-Achse mit dem motorisierten Tisch mit einer Schrittweite von zwei Mikrometern ein, um die Abbildung eines 30 Mikrometer tiefen Volumens alle 30 Sekunden zu ermöglichen. Verwenden Sie bei der intravitalen subzellulären Mikroskopie ein 40-faches Objektiv und einen Resonanzscanner mit dreifacher Mittelwertbildung, um den hochdynamischen Membranumbau mit höherer Vergrößerung und Auflösung abzubilden. Stellen Sie auch die Verschiebung der Z-Achse mit einem Piezo mit einer Schrittweite von einem Mikrometer ein, der alle vier bis fünf Sekunden eine 20 Mikrometer tiefe Volumenabbildung ermöglicht.Induzieren Sie eine sterile Laserverletzung, um die Migration von Neutrophilen auszulösen, indem Sie einen Hochleistungs-Anregungslaser 10 Sekunden lang auf einen schmalen Bereich von 20 x 20 Mikrometern fokussieren. Identifizieren Sie laserinduzierte Verletzungen durch ihre starken Autofluoreszenzsignale, die in allen Kanälen auftreten, und durch die daraus resultierende Veränderung der Kollagenanordnung. Speichern Sie die Daten am Ende des Experiments für weitere Analysen.Die Empfängermaus ermöglichte die Visualisierung struktureller Merkmale im Ohrgewebe wie Blutgefäße, ansässige Zellen und Haarfollikel über einen auf Intravitalmikroskopie basierenden Ansatz. Die laserinduzierten Verletzungen waren aufgrund ihrer starken Autofluoreszenz, die in allen Kanälen nachgewiesen wurde, und aufgrund der Veränderungen der Kollagenanordnung leicht sichtbar. Eine vollständige Ansicht der dreidimensionalen Architektur der Haut und der Lokalisation der injizierten Neutrophilen zeigt einen Z-Stapel der Haut von den äußeren zu den inneren Schichten IN einem dreidimensionalen Volumen-Rendering.Die Zeitrafferbildgebung zeigte, wie die Neutrophilen die Ohrhaut abtasteten und mit der intrazellulären Matrix und dem Wirtsgewebe interagierten. Mit Hilfe der intravitalen subzellulären Mikroskopie werden der dynamische Umbau der Plasmamembran während der Migration, die Bildung von Membranvorsprüngen an der Vorderkante und die Retraktion der Rückseite der Zellen deutlich sichtbar gemacht. Die Zeitraffersequenzen zeigen die Komplexität der Wechselwirkungen mit der intrazellulären Matrix.Die lokale Dynamik der Plasmamembran wurde mit Hilfe einer Algorithmus-Pipeline analysiert, die auf der Identifizierung von 100 Grenzpunkten unter der Zelloberfläche basiert. Die Änderungen der lokalen Krümmung und der durch Plasmamembranvorsprünge unterstrichenen Fläche wurden für jeden Grenzpunkt berechnet und für jeden Zeitrahmen als Kymographen berichtet. Sowohl die Vorder- als auch die Rückseite der Zellen behalten eine höhere Krümmung bei als die Seite der Zellen.Negative Bereichsänderungen sind an der Rückseite der Zellen deutlicher als an der Vorderkante, wo die positiven Bereichsänderungen stärker ausgeprägt sind. Nach der Bildgebung kann Gewebe entnommen, fixiert und für die Färbung aufbereitet werden, um das gewünschte Ziel weiter zu bewerten und die Mechanismen aufzuklären. Dieses Verfahren zur Abbildung der Membrandynamik kann so angepasst werden, dass es umfassendere zellbiologische Fragen in verschiedenen Zelltypen und wandernden Zellen in ihrer jeweiligen Umgebung beantwortet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir eine nicht-invasive Zwei-Photonen (2P)-Mikroskopie Ansatz zur Untersuchung Leukozyten homing in der Maus Fußballen. Wir besprechen die technischen Aspekte unserer Tissue Imaging Vorbereitung und gehen den Leser durch ein typisches Experiment von der ersten bis zur Ausführung und Datensammlung eingestellt.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Wir beschreiben ein Protokoll von Hellfeld Intravitalmikroskopie zur Messung dynamischer Neutrophilen-Endothel-Zell-Interaktionen während der neutrophilen Granulozyten Rekrutierung in Reaktion auf die Quelle eines neutrophilen Lockstoff in vivo. Neutrophile intraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Maus cremaster Muskelgewebe visualisiert mit Zeitraffer-Video Fotografie und verfolgt mit ImageJ.

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

Dieses Video zeigt in vivo Bildgebung, um die Rekrutierungsdynamik von Neutrophilen an einer Infektionsstelle in einer immungeschwächten, transgenen Maus mit GFP-exprimierenden Neutrophilen zu untersuchen. Dabei werden Leuchtbakterien injiziert, um eine Infektion auszulösen. Dies führt zur Rekrutierung von Neutrophilen an der Infektionsstelle, deren Verfolgung durch Bildgebung erfolgt.

Überwachung der Rekrutierungsdynamik von Neutrophilen und der bakteriellen Belastung an der Infektionsstelle in einem Mausmodell

Leukozyten überqueren die endothelialen Monolayer mit Hilfe der parazellulären oder transzelluläre Route. Wir haben einen einfachen Test zu folgen die Verteilung endogener junctional VE-Cadherin und PECAM-1 während Leukozyten transendotheliale Migration unter physiologischen Fluss zwischen den beiden Seelenwege unterscheiden.

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung des Verhaltens von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie an anästhesierten Mäusen.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Die Mechanismen, die die interstitielle Motilität von CD4 Effektor T-Zellen an Entzündungsstellen bestimmen, sind relativ unbekannt. Wir stellen eine nicht-invasive Ansatz zu visualisieren und in vitro -geprimte CD4 - T - Zellen in den entzündeten Ohr Dermis, so dass für das Studium des dynamischen Verhaltens dieser Zellen in situ zu manipulieren.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

Dieses aktuelle Protokoll verwendet Fluoreszenzreporter, In-vivo-Markierung und intravitale Bildgebungstechniken, um die Überwachung des dynamischen Prozesses des Neutrophilen-Primings bei lebenden Tieren zu ermöglichen.

Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse

Hier zeigen wir, wie man eine intravitale Mikroskopie auf postkapillaren Venulen des Maus-Cremaster-Muskels durchführt. Häufig angewendet auf verschiedene Modelle von Entzündungen und Sepsis, insbesondere solche, die durch Chemokine und Zytokine induziert werden, heben wir ihre Relevanz in der Untersuchung von Muskopathien mit übertriebener Muskel-Leukozyten-Infiltration hervor.

Leukozyten-Infiltration von Cremaster-Muskeln bei Mäusen bewertet durch Intravital-Mikroskopie

Hier stellen wir drei Methoden zur Beurteilung der Neutrophilenmigration und -infiltration sowohl in vivo als auch in vitro vor. Diese Methoden können verwendet werden, um vielversprechende Therapeutika zu entdecken, die auf neutrophile Migration abzielen.

Erkennung von Migration und Infiltration von Neutrophilen bei Mäusen

Hier beschreiben wir Protokolle zur Durchführung von Live-Bildgebung und quantitativer Analyse der Chemoattraktanrezeptordynamik in...

Live-Bildgebung von Chemokinrezeptoren in Zebrafisch-Neutrophilen während Wundreaktionen

Die In-vivo-Bildgebung der Gelenke ist eine wertvolle Technik, um das Migrationsverhalten der Leukozyten und die molekulare Dynamik in den entzündeten Gelenken aufzudecken. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die in vivo Bildgebende der Gelenke mit einem Mausmodell der Typ-II-Kollagen-induzierten Arthritis (CIA) vor.

Im lebenden Organismus Die Bildgebung deckt das Wanderverhalten der Leukozyten in den Gelenken auf

Entdecken Sie die intravitale subzelluläre Mikroskopie zur Untersuchung der Membranremodellierung während der Neutrophilenmigration in der Maushaut. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung zellulärer Dynamiken im lebenden Gewebe.

Bildgebung der Migration von Neutrophilen in der Maushaut zur Untersuchung des subzellulären Membranumbaus unter physiologischen Bedingungen (Video) | JoVE Journal

Bildgebung der Migration von Neutrophilen in der Maushaut zur Untersuchung des subzellulären Membranumbaus unter physiologischen Bedingungen

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