Name: Zellliniengesteuerte Massenspektrometrie-Proteomik im sich entwickelnden (Frosch-)Embryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Lernen Sie die liniengeführte Massenspektrometrie-Proteomik zur Analyse von Entwicklungsereignissen im Xenopus laevis Embryo. Diese Methode ermöglicht räumlich und zeitlich aufgelöste Einzelzelluntersuchungen.

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Wir danken Jie Li (University of Maryland, College Park) für die wertvollen Diskussionen über embryonale Dissoziation und FACS. Wir danken Vi M. Quach und Camille Lombard-Banek für die Unterstützung bei der Probenvorbereitung und Datenerhebung in früheren Studien, die beispielhaft für die proteomischen Anwendungen stehen, die in diesem Protokoll hervorgehoben werden. Teile dieser Arbeit wurden von der National Science Foundation unter der Fördernummer IOS-1832968 CAREER (an P.N.), den National Institutes of Health unter der Fördernummer R35GM124755 (an P.N.), dem University of Maryland-National Cancer Institute Partnership Program (an P.N.) und den Forschungspreisen der COSMOS Club Foundation (an A.B.B. und L.R.P.) unterstützt.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung der Proteinexpression in identifizierten Zelllinien in Embryonen der Xenopus-Spezies . Die Methodik, die auf HRMS zurückgeht, kombiniert eine hervorragende Spezifität bei der molekularen Identifizierung, die Fähigkeit zur Detektion mehrerer Proteine ohne molekulare Sonden (in der Regel Hunderte bis Tausende verschiedener Proteine) und die Fähigkeit zur Quantifizierung. Die Anpassungsfähigkeit an klassische Werkzeuge und Arbeitsabläufe in der Zell- und Entwicklung...

Unser Verständnis der Zelldifferenzierung und der Genese von Geweben und Organen ist das Ergebnis jahrzehntelanger aufwendiger gezielter Screenings von Genen und ihren Produkten. Ein besseres Wissen über alle Biomoleküle und ihre Mengen während wichtiger zellulärer Ereignisse würde dazu beitragen, molekulare Mechanismen zu entschlüsseln, die die räumliche und zeitliche Musterung des Körperbauplans von Wirbeltieren steuern. Technologien, die molekulare Amplifikation und Sequenzierung ermöglichen, sind nun in der Lage, routinemäßig über eine große Anzahl von Genen und Transkripten zu berichten und hypothesengestützte Studien in der biologischen und translationalen Grundlagenforschung zu unterstützen. Um sich entwickelnde Systeme zu verstehen, spricht eine komplexe Beziehung zwischen Transkription und Translation für die direkte Analyse mehrerer Proteine und ihrer posttranslationalen Modifikationen. Die globale Proteomik unter Verwendung biologischer In-vitro-Systeme, wie z. B. induzierter pluripotenter Stammzellen, begann, die Mechanismen der Gewebeinduktion zu beschreiben 1,2. In komplexen Organismen, wie dem Wirbeltierembryo, beruht die Entwicklung auf Morphogengradienten im Kontext von Raum und Zeit3. Daraus folgt, dass das Wissen über proteomische Veränderungen bei der Differenzierung von Zellen zu spezialisierten Geweben, wie z. B. Nervengeweben, einen Schlüssel zur Entschlüsselung molekularer Programme bietet, die die normale und fehlerhafte Entwicklung steuern, und um Therapeutika der nächsten Generation zu steuern.
Der südafrikanische Krallenfrosch (Xenopus laevis) ist ein etabliertes Modell in der Zell- und Entwicklungs-, Neuro- und regenerativen Biologie. Der Nobelpreisfür Physiologie oder Medizin 2012 von Sir John Gurdon 4,5 für die Entdeckung der Pluripotenz des somatischen Kerns unterstrich die Bedeutung dieses Modells für Entdeckungen in Grundlagen- und translationalen Studien. Xenopus-Embryonen entwickeln sich außerhalb der Mutter, was die direkte Manipulation von Zellen, Zellklonen und Genexpression über verschiedene Entwicklungsstadien hinweg ermöglicht. Asymmetrische Pigmentierung und stereotype Zellteilungen ermöglichten die Kartierung reproduzierbarer Schicksalskarten des 16-6- und 32-zelligen Embryos im 7,8-Stadium. Für die hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS)-basierte Proteomik besteht ein weiterer Vorteil des Modells aus der relativ großen Größe (~1 mm Durchmesser), die einen hohen Proteingehalt für die Analyse liefert (~130 μg in Embryonen im frühen Spaltungsstadium, ~10 μg Proteingehalt in einzelnen Zellen des 16-zelligen Embryos)9,10.
Derzeit ist HRMS die führende Technologie der Wahl für den Nachweis von Proteinen. Diese Technologie ermöglicht den direkten, sensitiven und spezifischen Nachweis und die Quantifizierung von mehreren, in der Regel Hunderten bis Tausenden verschiedener Proteine11. Die Bottom-up-Proteomik von HRMS umfasst eine Reihe miteinander verbundener Schritte. Nach der Extraktion aus der Zell-/Gewebeprobe werden Proteine mit einem proteolytischen Enzym, wie z.B. Trypsin, verdaut (Bottom-up-Proteomik). Die resultierenden Peptide werden anhand ihrer unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften getrennt, einschließlich Hydrophobie (Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie, LC), Nettoladung (Ionenaustauschchromatographie), Größe (Größenausschlusschromatographie) oder elektrophoretische Mobilität (Kapillarelektrophorese, CE). Die Peptide werden dann aufgeladen (ionisiert), typischerweise durch Elektrospray-Ionisation (ESI), und Peptidionen werden durch Gasphasenfragmentierung mittels Tandem-HRMS detektiert und sequenziert. Die resultierenden Peptiddaten werden auf das Proteom des untersuchten Organismus abgebildet. Mit proteinspezifischer (proteotypischer) Peptidionen-Signalintensität, die mit der Konzentration korreliert, kann die Proteinquantifizierung markierungsfrei oder markierungsbasiert (Multiplexing-Quantifizierung) durchgeführt werden. Die HRMS-Proteomik liefert eine reichhaltige Informationsquelle über den molekularen Zustand des untersuchten Systems, die die Generierung von Hypothesen und anschließende funktionelle Studien ermöglicht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Räumlich-zeitlich skalierbare Proteomik, die eine zellliniengesteuerte HRMS-Proteomik im sich entwickelnden (Frosch-)Embryo ermöglicht. (A) Visualisierung der Probe (1) unter Verwendung eines Stereomikroskops (2) zur Injektion einer identifizierten Zelle (Inset) unter Verwendung einer hergestellten Mikropipette (3) unter Kontrolle durch einen Translationstisch (4). (B) Subzelluläre Probenahme der identifizierten linken D11-Zelle in einem 16-zelligen Embryo. (C) Präparation einer ganzenD-11-Zelle aus einem 16-zelligen Embryo. (D) Fluoreszierende (grüne) Nachverfolgung der linken und rechten D111-Nachkommen aus einem 32-zelligen Embryo zur Steuerung der Dissektion des neuralen Ektoderms (NE) in der Gastrula (Stadium 10) und Isolierung des Nachkommengewebes von der Kaulquappe mittels FACS. Maßstabsbalken: 200 μm für Embryonen, 1,25 mm für das Fläschchen. Die Abbildungen wurden mit Genehmigung der Referenzen 15,19,21,59 angepasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die HRMS-basierte Quantifizierung einer großen Anzahl von Proteinen in identifizierten Zellen/Geweben in sich entwickelnden X. laevis-Embryonen. Der Ansatz baut auf einer genauen Zellidentifikation, reproduzierbaren Zellschicksalskarten und etablierten Methoden zur Verfolgung von Zelllinien in diesem biologischen Modell auf 6,7,8. Wie in Abbildung 1 gezeigt, untersuchen wir Proteome aus einzelnen Zellen, indem wir Ganzzelldissektion oder Kapillarmikroskopie verwenden, um zellulären Inhalt abzusaugen. Die Überwachung der Abstammungslinie einer Zelle ermöglicht es uns, die raumzeitliche Entwicklung des Proteoms zu untersuchen, wenn Zellen während der Gastrulation Gewebe bilden. Die Nachkommen der Zelle werden fluoreszenzmarkiert, indem ein Fluorophor injiziert wird, der an inertes Dextran oder mRNA für fluoreszierendes Protein (z. B. grün fluoreszierendes Protein oder GFP) konjugiert ist. Die markierten Nachkommen werden zu den gewünschten Entwicklungszeitpunkten isoliert. Während der Gastrulation können Zellklone, die eng geclustert sind, durch Dissektion isoliert werden. Nach der Gastrulation können Zellklone aufgrund von Migrationsbewegungen innerhalb des Embryos verteilt und durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) aus dissoziierten Geweben isoliert werden. Proteine in diesen Zellen und Geweben werden mittels Bottom-up-Proteomik unter Verwendung von HPLC oder CE zur Trennung und ESI-Tandem-HRMS zur Identifizierung gemessen. Die zellliniengesteuerte HRMS-Proteomik ist auf verschiedene Zellgrößen und Abstammungslinien innerhalb des Embryos skalierbar und spezifisch, sensitiv und quantitativ. Anhand ausgewählter Beispiele, die hier gezeigt werden, zeigen wir auch, dass dieses Protokoll skalierbar und breit an verschiedene Zelltypen und Zelllinien anpassbar ist.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63586/63586fig02.jpg"> Abbildung 2: Der bioanalytische Arbeitsablauf. Die Mikrodissektion und Kapillaraspiration (FACS) erleichterte die Probenahme des zellulären und klonalen Proteingehalts. Die Depletion von reichlich vorhandenen Dotterproteinen und die Trennung durch Kapillarelektrophorese (CE) oder Nano-Flow-Flüssigkeitschromatographie (LC) verbesserte die Identifikationsempfindlichkeit (ID) unter Verwendung von hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS) mit Elektrospray-Ionisation (ESI). Die Quantifizierung ergab eine Dysregulation, die neue Informationen für hypothesengetriebene Studien in Verbindung mit Informationen aus der Genontologie (GO) lieferte. Die Abbildungen wurden mit Genehmigung von Referenz15 angepasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63586/63586fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Acetonitril (LC-MS-Qualität)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0492</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A643-500</td><td></td></tr><tr><td>Analysesäule</td><td>Thermo Scientific</td><td>164941</td><td></td></tr><tr><td>Analytische Mikrowaage</td><td>Mettler-Toledo</td><td>XSE105DU</td><td></td></tr><tr><td>Automatische Peptidfraktionierungsplattform</td><td>Agilent</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatkapillaren</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat-Kapillaren (zur Herstellung von Strahlern)</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>C18 Spin-Säulen (zum Entsalzen)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Kamera zum Überwachen von Elektrospray</td><td>Edmund Optics Inc.</td><td>EO-2018C</td><td></td></tr><tr><td>Combretastatin A4</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7744</td><td></td></tr><tr><td>Kommerzielles CESI-System</td><td>AB SCIEX</td><td>CESI(</td><td></td></tr><tr><td>Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure (CAPS)</td><td>VWR</td><td>97061-492</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Millipore Sigma</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 488; 10.000 MW, anionisch, fixierbar</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D22910</td><td></td></tr><tr><td>Diothiothreitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0861</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ62786AP</td><td></td></tr><tr><td>Epifluoreszenz-Lichtquelle</td><td>Lumencore</td><td>AURA III</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBing Mikrozentrifuge Röhren: Protein</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-698-793</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure (LC-MS-Qualität)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Gefrierschrank (-20 &Grad; C)</td><td>Fisher Scientific</td><td>97-926-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gefrierschrank (-80 &Grad; C)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSX40086A</td><td></td></tr><tr><td>Quarzglaskapillare</td><td>Molex</td><td>1088150596</td><td></td></tr><tr><td>Heat Block</td><td>Benchmark</td><td>BSH300</td><td></td></tr><tr><td>Hochdruck-Flüssigkeitschromatographiesystem</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Dionex Ultimate 3000 RSLC Nanosystem</td><td></td></tr><tr><td>Hochspannungsnetzteil</td><td>Spellman</td><td>CZE1000R</td><td></td></tr><tr><td>Hochauflösendes Massenspektrometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Massenspektrometer</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Kappen</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4013-40A</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Fläschchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4013-11</td><td></td></tr><tr><td>Illuminator z.B. Schwanenhälse</td><td>Nikon</td><td>C-FLED2</td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity Pathway Analysis</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodacetamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC122275000</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS-Qualität)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS-Qualität)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokapillarabzieher</td><td>Suttor Instruments</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Warner Instrument, Handem, CT</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Micropippette-Abzieher</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>MS Datenanalysesoftware, kommerzielle</td><td>ProteomeDiscoverer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS Datenanalysesoftware, Opensource</td><td>MaxQuant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>non-idet 40 Ersatz</td><td>Millipore Sigma</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 60 mm und 80 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S08184</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 10 &micro; L-Bett Zip-Tips (zum Entsalzen)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>87782</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Bicinchoninsäure Protein-Assay-Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce quantitativer kolorimetrischer Peptid-Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Trypsin-Protease (MS-Qualität)</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI90058</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Fläschchen</td><td>Eppendorf</td><td>0030108434 , 0030108442</td><td></td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>Kühlbrutschrank</td><td>Thermo Scientific</td><td>PR505755R/3721</td><td></td></tr><tr><td>Natriumisethionat</td><td>Millipore Sigma</td><td>220078</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyrophosphat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221368-100G</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl BGE Fläschchen</td><td>Sonderanfertigungen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probenfläschchen aus Edelstahl</td><td>Sonderanfertigungen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop (Objektiv 10x)</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1270, SZX18</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>VWR</td><td>97063-790</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpen (2)</td><td>Harvard Apparate</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Spritzen (gasdicht): 500&ndash; 1000 &Mikro; L</td><td>Hamilton</td><td>1750TTL</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipetten (Kunststoff, Einweg)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Fallensäule</td><td>Thermo Scientific</td><td>164750</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M Lösung)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ22638AP</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumkonzentrator für den Betrieb bei 4&ndash; 10 & Grad; C</td><td>Labconco</td><td>7310022</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>Benchmark</td><td>BS-VM-1000</td><td></td></tr><tr><td>Wasser (LC-MS-Qualität)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>Wasser (LC-MS-Qualität)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>XYZ Translationstisch</td><td>Thorlabs</td><td>PT3</td><td></td></tr><tr><td>XYZ Translationstisch</td><td>Custom-Built</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zellliniengesteuerte massenspektrometrie-proteomik im sich entwickelnden (frosch-)embryo

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Die Charakterisierung molekularer Vorgänge bei der Entstehung von Geweben und Organen in Zellen eröffnet das Potenzial, die normale Entwicklung besser zu verstehen und effiziente Heilmittel für Krankheiten zu entwickeln. Technologien, die eine genaue Identifizierung und Quantifizierung verschiedener Arten und einer großen Anzahl von Proteinen ermöglichen, würden noch fehlende Informationen über molekulare Mechanismen liefern, die die Entwicklung von Geweben und Organismen in Raum und Zeit orchestrieren. Hier stellen wir ein Massenspektrometrie-basiertes Protokoll vor, das die Messung von Tausenden von Proteinen in identifizierten Zelllinien in Xenopus laevis (Frosch) Embryonen ermöglicht. Der Ansatz baut auf reproduzierbaren Zellschicksalskarten und etablierten Methoden auf, um Zellen und ihre Nachkommen (Klone) aus diesem Modell der Wirbeltierentwicklung zu identifizieren, fluoreszierend zu markieren, zu verfolgen und zu beproben. Nach der Entnahme des Zellinhalts mittels Mikroprobenahme oder der Isolierung von Zellen durch Dissektion oder fluoreszenzaktivierte Zellsortierung werden Proteine extrahiert und für die Bottom-up-Proteomik-Analyse verarbeitet. Flüssigkeitschromatographie und Kapillarelektrophorese werden verwendet, um eine skalierbare Trennung für die Proteindetektion und -quantifizierung mit hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS) zu ermöglichen. Repräsentative Beispiele werden für die proteomische Charakterisierung von Nervengewebe-Schicksalszellen angeführt. Die zellliniengesteuerte HRMS-Proteomik ist an verschiedene Gewebe und Organismen anpassbar. Es ist sensitiv, spezifisch und quantitativ genug, um in die räumlich-zeitliche Dynamik des Proteoms während der Wirbeltierentwicklung zu blicken.

Dieses Protokoll ermöglichte die Untersuchung von Proteinen in einzelnen Zellen und ihrer Abstammungslinien bei der Etablierung von Geweben in X. laevis-Embryonen. Abbildung 1 veranschaulicht eine solche Anwendung des Ansatzes zur Untersuchung von Proteinen in Zellen mit dem Schicksal von Nervengewebe und des neu induzierten neuralen Ektoderms im Embryo. Wie in Abbildung 1A dargestellt, integrierte der bioanalytische Arbeitsablauf traditionelle Werkzeug...

In dieser Arbeit beschreiben wir eine massenspektrometriebasierte proteomische Charakterisierung von Zelllinien mit bekannten Gewebeschicksalen im Embryo von Xenopus laevis im Wirbeltier.

Zellliniengesteuerte Massenspektrometrie-Proteomik im sich entwickelnden (Frosch-)Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Dieser liniengesteuerte Ansatz ermöglicht die proteomische Analyse wichtiger Entwicklungsereignisse mit räumlicher und zeitlicher Auflösung innerhalb des Wirbeltierembryos und vermittelt Informationen, die durch Messungen des gesamten Embryos nicht zugänglich wären. Dieser Ansatz kann leicht erweitert werden, um Proteine, Metaboliten und Transkripte verschiedener embryonaler Zellen zu untersuchen, während sie sich während der Entwicklung differenzieren. Diese Methode kann unser Verständnis der molekularen Mechanismen verbessern, die die normale Entwicklung und die Entwicklung von Krankheiten steuern, einschließlich der Mechanismen der Gewebeinduktion und des Zellschicksals während der frühen Entwicklung.Verwenden Sie eine Haarschlaufe, um jeden Embryo in eine Vertiefung zu führen, und positionieren Sie ihn vorsichtig so, dass sich die Zielzelle im richtigen Winkel zur Mikronadel befindet. Folgen Sie den Schicksalskarten des Xenopus laevis-Gewebes, um die Vorläuferzelle der interessierenden Abstammungslinie zu identifizieren. Verwenden Sie zwei angespitzte Pinzetten, um die Vitellinmembran, die den Embryo umgibt, vorsichtig zu entfernen.Isolieren Sie die einzelnen Zellen aus dem Emb

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Xenopus embryonalen Epithelien sind ein ideales Modellsystem, um die Zelle Verhaltensweisen wie Polarität Entwicklung und Formänderung beim epithelialen Morphogenese zu studieren. Traditionelle Histologie des festen Proben wird zunehmend durch Live-Cell-konfokale Bildgebung ergänzt. Hier zeigen wir Methoden, um Frosch Gewebe zu isolieren und zu visualisieren leben Epithelzellen und deren Zytoskelett mit Live-cell konfokalen Mikroskopie.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Das Schicksal einer einzelnen embryonalen Zelle kann durch vererbte Moleküle und / oder durch Signale von benachbarten Zellen beeinflusst werden. Mit Hilfe Schicksal Karten der Spaltung der Bühne Xenopus Embryos können einzelne Blastomeren für Kultur isoliert identifiziert werden, um die Beiträge der ererbten Moleküle gegenüber Zell-Zell-Interaktionen zu beurteilen.

Blastomere Explantate für das Schicksal der Zelle Engagement während der embryonalen Entwicklung Testen

Die Analyse der Proteinexpression in jungen embryonalen Mausklappen wurde durch das begrenzte verfügbare Gewebe erschwert. Dieses Manuskript enthält ein Protokoll zur Präparation von Proteinen aus sich entwickelnden embryonalen Mausklappenregionen für die Western-Blot-Analyse.

Proteinisolierung aus den Entwicklungs embryonalen Mäuseherzklappen Region

Die Frage, wie Chromatin Regulierungsbehörden und Chromatin-Staaten betreffen das Genom in vivo ist der Schlüssel zum Verständnis, wie frühe Zellschicksal Entscheidungen werden in den sich entwickelnden Embryo gemacht. ChIP-Seq-die beliebteste Ansatz zur Chromatin Funktionen auf globaler Ebene, wird hier für Xenopus Embryonen beschrieben untersuchen.

Genomweite Snapshot von Chromatin Regulierungsbehörden und Staaten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen von ChIP-Seq

Das Manuskript hier bietet eine einfache Reihe von Methoden für die Sekretion und Verbreitung von fluoreszierend markierten Liganden in Xenopus-Analyse. Dies bietet einen Rahmen für die Prüfung der Fähigkeit von anderen Proteinen zu Ligand Verteilung ändern und erlaubt Experimente, die Einblick in die Mechanismen, die Morphogen Gradienten geben kann.

Mittels konfokaler Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen

Dieses Protokoll stellt eine Methode quantitative, single-cell in situ Analyse der Proteinexpression durchzuführen lineage in mouse Spezifikation Präimplantationsembryonen zu studieren. Die Verfahren, die für die Sammlung von Blastozysten, Vollmontage Immunfluoreszenz-Nachweis von Proteinen, Imaging von Proben auf einem konfokalen Mikroskop und Kern Segmentierung und Bildanalyse beschrieben.

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

Wir beschreiben Schritte, mit denen schnell in Situ Probenahme von einen kleinen Teil einer einzelnen Zelle mit hoher Präzision und minimalen Invasion mit Kapillar-basierten Mikro-Probenahme, chemische Charakterisierung einer Momentaufnahme der metabolischen Aktivität in zu erleichtern Embryonen mit einer speziell angefertigten Einzelzelle Kapillarelektrophorese und Massenspektrometrie-Plattform zu leben.

Mikrosonde Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry für einzellige Metabolomik in Live-Frosch (Xenopus Laevis) Embryonen

Hier präsentierten wir eine multiplexierte einzellige mRNA-Sequenzierungsmethode, um die Genexpression in embryonalen Geweben der Maus zu profilieren. Die tropfenbasierte einzelzellbasierte mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) in Kombination mit Multiplexing-Strategien kann Einzelne Zellen aus mehreren Proben gleichzeitig profilieren, was die Reagenzkosten deutlich reduziert und experimentelle Chargeneffekte minimiert.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie ist das wertvollste Werkzeug in der Entwicklungsbiologie. Ein wichtiges Thema in vergleichenden Studien ist die Varianz der Umgebung. Unser Protokoll beschreibt ein experimentelles Framework für die gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Proben und befasst sich daher proaktiv mit diesem Problem.

Gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Insektenembryonen in probenkammerbasierten Lichtbogenfluoreszenzmikroskopen

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) ist eine auf chemischer Biologie basierende Methode zur Untersuchung reaktiver niedermolekularer Signalwege. Diese Technik kann auf lebende Fische in verschiedenen Entwicklungsstadien angewendet werden. Hier koppeln wir Standard-Assays im Zebrafisch mit Z-REX für die Analyse des Signalwegs.

Überwachung von On-Target-Signalantworten in Zebrafischlarven - Z-REX entschlüsselt präzise Mechanismen elektrophiler Wirkstoffe und Metaboliten

Lernen Sie die liniengeführte Massenspektrometrie-Proteomik zur Analyse von Entwicklungsereignissen im Xenopus laevis Embryo. Diese Methode ermöglicht räumlich und zeitlich aufgelöste Einzelzelluntersuchungen.

Zellliniengesteuerte Massenspektrometrie-Proteomik im sich entwickelnden (Frosch-)Embryo

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