Schnelle Genotypisierung von Maus Tissue Mit Sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Hallo, mein Name ist Linda und ich arbeite im Labor von Dr. Edwin Niki an der University of California Irvine. Heute zeige ich Ihnen, wie ich mit dem Stigma's Cyber Green Extracting Tissue PCR-Kit transgene Mäuse schnell genotypisieren kann. Normalerweise verwende ich dieses Kit zur Genotypisierung unserer embryonalen Mäuse, wenn ich akut dissoziierte Zellkulturen anlege und rasch den Genotyp unserer Maus ermitteln muss.

Doch für die heutigen Zwecke haben wir Schwänze erwachsener Mäuse, an denen ich Ihnen zeigen kann, wie ich dieses Kit verwende. Dieses Protokoll beinhaltet eine schnelle Alkohol-Digestion und DNA-Extraktion sowie danach einen schnellen Neutralisationsschritt. Die extrahierte DNA verwenden wir in einer Echtzeit-PCR, mit der wir unsere PCR-Amplicons überwachen können.

Wenn Sie bereit sind, können wir beginnen. Bevor wir starten, sollten wir sicherstellen, dass unser Heizblock auf 95 Grad Celsius eingestellt ist, dass unser Cyber Green aufgetaut ist und bis zur Verwendung auf Eis gehalten wird, und dass unsere anderen Reagenzien auf Raumtemperatur angetaut werden. In meinem Eisbehälter habe ich die beiden Primer, die wir zur Genotypisierung verwenden werden; sie wurden speziell für unser Gen von Interesse entworfen und für die QPCR validiert.

Ich habe außerdem meine positive Kontrolle für das Gen der Interesse sowie meine negative Kontrolle und eine Gewebeprobe, die ich bereits von einer erwachsenen Maus gesammelt habe. Wenn Sie Ihre Gewebeprobe sammeln, ist es sehr wichtig, äußerst streng vorzugehen. Wenn wir embryonale Mäuseschwänze sammeln, spülen wir unsere Pinzette stets vor und vor jeder Gewebeprobe mit 70 % Ethanol ab.

Und wir spülen die Schwanzproben immer zuerst in TBS. Für jeden Schwanz müssen Sie einen Master-Mix aus Gewebepräparation und DNA-Extraktion herstellen. Dafür benötigen Sie 100 Mikroliter der Extraktionslösung und 25 Mikroliter der Gewebepräparationslösung. Ich werde meinen P-200 und gefilterte Pipettenspitzen verwenden, um 100 Mikroliter der Extraktionslösung und 25 Mikroliter der Gewebepräparationslösung in ein neues Eppendorf-Röhrchen abzumessen. Anschließend sollten Sie den Master-Mix durch Auf- und Abpipettieren mischen.

Und Sie möchten also 125 µL Ihrer Master-Mix-Lösung zu Ihrem Objekt der Untersuchung hinzufügen, wobei Sie sicherstellen müssen, dass bei einem erwachsenen Mäuseschwanz das geschnittene Ende vollständig in der Master-Mix-Lösung eingetaucht ist. Anschließend können Sie es kurz per Vortex-Mischung homogenisieren und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Während dieser 10-minütigen Inkubation bereite ich meinen bevorzugten Green-Master-Mix vor, der aus dem im Kit enthaltenen SYBR Green Master Mix, Milli-Q- oder PCR-Grad-Wasser sowie unseren Vorwärts- und Rückwärts-Primern besteht. Das war's.

Nun, da die 10-minütige Inkubation abgeschlossen ist, müssen wir die Reaktion bei 95 Grad für drei Minuten erhitzen und aktivieren. Die dreiminütige Inaktivierung ist beendet, und nun fügen wir die im Kit enthaltene Neutralisierungslösung hinzu, und zwar hundert Mikroliter pro Reaktion, und mischen dies durch Vortexen. Nachdem Sie den Neutralisierungspuffer zugegeben haben, können Ihre DNA-Proben bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden, bis Sie bereit sind, sie zu verwenden.

Eigentlich möchten wir unser Genotyp sofort erhalten. Daher gehen wir direkt zur QPCR über, sodass meine Schwänze neutralisiert und bereit sind. Meine Cyber-Green-PCR-Master-Mix ist fertig und ich habe meine PCR-Röhrchen auf einem Kühlblock vorbereitet.

Jetzt werde ich lediglich 16 Mikroliter meiner Master-Mix-Lösung in jedes Reaktionsgefäß geben und anschließend jeweils 4 Mikroliter des mutualisierten Extrakts oder 4 Mikroliter der positiven bzw. negativen Kontrolle hinzufügen. Im Grunde füge ich einfach 16 Mikroliter einer Master-Mix-Lösung zu jedem der Gefäße hinzu. Danach werde ich 4 Mikroliter des neutralisierten Extrakts zu den 60 Mikrolitern der Master-Mix-Lösung im Reaktionsgefäß hinzugeben, sodass sich ein Gesamtreaktionsvolumen von 20 Mikrolitern ergibt.

Und ich führe dasselbe Verfahren für die positiven und negativen Kontrollen durch, indem ich vier Mikroliter zu 16 Mikrolitern mit einem PPR-Master-Mix hinzugebe. Sobald alle Komponenten zugegeben sind, können Sie sie mit einem optisch klaren Acht-Kappen-Streifen verschließen.

Sie sollten darauf achten, den optisch klaren Bereich der Deckel über Ihren Proben nicht zu berühren. Daher verwende ich ein Kim-Tuch, um vorsichtig auf die Deckel zu drücken und sicherzustellen, dass sie fest verschlossen sind. Ich habe die PCR- und DNA-Mischung vorsichtig verwirbelt und anschließend kurz zentrifugiert. Nun sind sie bereit, in das QPCR-Gerät eingelegt zu werden.

Was wir tun werden, ist zunächst, unsere Proben in die Opticon-PCR-Maschine einzuladen, und ich werde einen neuen Plattenversuch einrichten, bei dem unsere erste Vertiefung unsere Probe sein wird. Unsere zweite Vertiefung wird unsere positive Kontrolle sein und unsere dritte Vertiefung ist unsere negative Kontrolle. Wir geben an, dass unser Reaktionsvolumen insgesamt 20 µL beträgt. Als Nächstes werde ich ein Protokoll laden, das für die schnelle Genotypisierung einer Person entwickelt wurde.

Dieses Protokoll umfasst einen dreiminütigen Denaturierungsschritt, einen Zyklus aus 15 Sekunden Denaturierung, 15 Sekunden primärer Annealing und anschließend 20 Sekunden primärer Extension. Der primäre Extensionsschritt kann tatsächlich auf etwa 10 Sekunden verkürzt werden, wodurch sich insgesamt nur 40 Sekunden ergeben. Für jeden Zyklus werden diese drei Schritte etwa 40-mal wiederholt, wie bei einer normalen PCR, und am Ende wird eine Schmelzkurve aufgenommen.

Wir haben unsere Platte vorbereitet und unser Protokoll geladen. Jetzt müssen wir nur noch unsere QPCR durchführen, und sie beginnt mit der dreiminütigen Denaturierungsphase. Aus meiner Erfahrung heraus, unter Verwendung der von mir eingesetzten Primer und der Schwanzproben sowie der von mir gesuchten Gene, weiß ich, dass meine positiven Ergebnisse etwa ab 25 Zyklen auftreten, wenn sie eine signifikante Zykelschwelle überschreiten.

Nun hängt das Zeitpunkt des Ansprechens stark von Ihrer Gewebeprobe, dem gesuchten Ziel und der ursprünglich vorhandenen Menge an DNA ab. Wir können bereits erkennen, dass unsere positive Kontrolle bereits positiv reagiert hat und es sieht so aus, als wäre auch unsere Probe positiv. Wie Sie sehen, beginnt sie etwas später als unsere positive Kontrolle anzusteigen.

Wir müssen weiterhin abwarten, da der Prozess erst bei 27 Zyklen steht, aber hoffentlich können wir nach einigen weiteren Zyklen sicher sein, dass unsere Probe positiv ist, und ich kann dann mit meinem Experiment fortfahren. An diesem Punkt sehen Sie, dass die negative Kontrolle gerade erst anfängt anzusteigen, und zwar deshalb, weil ich einen überschüssigen Schwanz verwendet habe. Das hilft sicherzustellen, dass alles, was vor diesem überschüssigen negativen Schwanz erscheint, positiv sein wird.

Ab diesem Punkt betrachte ich alles, was vor dem negativen Signal erscheint, als positiv und fahre mit meinem Experiment fort. Nach Abschluss der PCR-Zyklen führt das Gerät eine Schmelzkurvenanalyse durch. Diese hilft Ihnen dabei, die Zusammensetzung und Reinheit Ihres Produkts zu bestimmen.

Dadurch können Sie überprüfen, ob Sie die positiven und negativen Proben korrekt ausgewählt haben. Beispielsweise weist die positive Probe einen charakteristischen, scharfen Schmelztemperaturpeak auf, der einem spezifischen, amplifizierten PCR-Produkt entspricht. Negative Proben weisen hingegen einen unspezifischen, breiten Schmelztemperaturpeak auf, der amplifizierter unspezifischer DNA entspricht, die während der PCR entstanden ist.

Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie wir Sigma's Cyber Green Extracting Amp verwenden, um adulte Mäuseschwänze schnell zu genotypisieren. Dieses Kit kann jedoch mit verschiedenen Tiergeweben, Haaren, Speichel und von mir auch zur Genotypisierung embryonaler Mäuseschwänze eingesetzt werden. Wir bevorzugen dieses Kit, da es schnell ist.

Ich kann mein Genotyp in einer Stunde zurückbekommen, und es ist sehr bequem und einfach. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg.