Name: Aufreinigung ubiquitinierter p53-Proteine aus Säugetierzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Aufreinigung ubiquitinierter p53-Proteine aus Säugetierzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Ubiquitinierung in der Proteinfunktionsregulation.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Natural Science Foundation of China (81972624) an D.L.

HINWEIS: H1299-Zellen wurden freundlicherweise von der Stammzellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften zur Verfügung gestellt und erwiesen sich als negativ für Mykoplasmenkontamination.
1. Zellkultur
<ol><li>Für die Erstkultur 1 x 106 Zellen der menschlichen Lungenadenokarzinom-Zelllinie, H1299, in eine 10 cm Petrischale mit 10-12 ml RPMI 1640 Medium geben, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Glutaminzusatz, 1% Natriumpyruvat und Antibiotika (100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin). Halten Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5%CO2. Teilen Sie die Zellen alle 2-3 Tage, je nachdem, wann sie 80% -90% Konfluenz erreichen.</li>
	<li>Bereiten Sie einen Tag vor der Transfektion 6-9 x 10 6 Zellen für drei Petrischalen vor und legen Sie 2-3 x 106 Zellen in eine einzelne 10 cm Petrischale mit 10-12 ml Medium, um einen Zusammenfluss von 70% -90% während der Transfektion zu erreichen. HINWEIS: HEK293T-Zellen können aufgrund ihrer hohen Transfektionseffizienz und Proteinexpression auch zur Reinigung ubiquitinierter Proteine verwendet werden.</li>
</ol>2. Plasmidtransfektion
<ol><li>Fügen Sie 1,5 ml reduziertes Serummedium in drei 15-ml-Zentrifugenröhrchen hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Röhrchen transfektionsbereite Plasmid-DNA hinzu, um Verdünnungen wie folgt vorzunehmen. Röhre 1: 1 μg Flag-p53-Plasmid, 12 μg leerer Vektor; Röhre 2: 1 μg Flag-p53-Plasmid, 3 μg His-HA-Ub (HH-Ub)-Plasmid und 9 μg leerer Vektor; Röhrchen 3: 1 μg Flag-p53-Plasmid, 3 μg HH-Ub-Plasmid und 9 μg Mdm2-Plasmid. Fügen Sie jedem Röhrchen insgesamt 0,2 μg grün fluoreszierendes Protein (GFP)-Plasmid hinzu, um die Transfektionseffizienz zu überwachen. HINWEIS: Ein Pilotexperiment sollte durchgeführt werden, um die optimalen Mengen an Plasmiden zu bestimmen, die benötigt werden, um eine effiziente Zielproteinexpression in Zellen zu erreichen.</li>
	<li>Fügen Sie 78 μL Liposomentransfektionsreagenz zu 4,5 ml reduziertem Serummedium in einem anderen Zentrifugenröhrchen hinzu, um die Liposomen zu verdünnen. Mischen Sie gründlich durch Schnippen der Tube und lassen Sie sie 5 min bei Raumtemperatur (RT) stehen.</li>
	<li>1,5 ml der verdünnten Liposomenlösung in jedes Röhrchen aus Schritt 2.2 geben, das 1,5 ml der verdünnten DNA-Lösung enthält. Mischen Sie die Plasmide gründlich und vernetzen Sie sie mit den Liposomen für mindestens 20 min bei RT. Verwenden Sie für jede Transfektion ein Plasmid-DNA:Liposomen-Verhältnis von 1:2 (μg:μL).</li>
	<li>Verwerfen Sie das Originalmedium aus den Petrischalen und geben Sie 9 ml reduziertes Serummedium in jede Schale. Fügen Sie 3 ml der Liposom-DNA-Mischung zu jeder Schale hinzu und mischen Sie die Lösung, indem Sie die Platte 3x und dann 3x links und rechts 3x hin und her schütteln, um die Mischung gleichmäßig in der Platte zu verteilen.</li>
	<li>Kultur der Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2. Ersetzen Sie das Medium nach 4-6 h und kultivieren Sie die Zellen für 24-36 h.</li>
</ol>3. Zellsammlung
<ol><li>Nach 24-36 h behandeln Sie die Zellen mit MG132 in einer Endkonzentration von 10 μM für 4-6 h. HINWEIS: MG132 ist ein Peptidaldehyd, der die proteolytische Aktivität des 26S-Proteasom-Komplexes effizient blockiert. Die Mengen an Proteinen, die mit Lysin-48 (K48)-verknüpften Polyubiquitinketten ubiquitiniert werden, können erhöht werden, nachdem Zellen mit MG132 oder anderen Proteasom-Inhibitoren behandelt wurden.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen 2x (achten Sie darauf, die Zellen nicht auszuspülen) mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und saugen Sie die Zellen mit serologischen Pipetten ab.</li>
	<li>Geben Sie 1 ml PBS in die Schale, entfernen Sie die Zellen durch Schaben mit einem sauberen Schaber und geben Sie die Zellsuspension in Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie bei 700 x g für 5 min, um Zellpellets zu sammeln.</li>
</ol>4. Reinigung ubiquitinierter Proteine unter nichtdenaturierenden Bedingungen
<ol><li>Bereiten Sie den Flag-Lysepuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1% Triton X-100, 0,2% Sarkosyl und 10% Glycerin) frisch mit einem Proteaseinhibitor-Cocktail vor Gebrauch vor.</li>
	<li>Fügen Sie 800 μL eiskalten Flag-Lysepuffer zu den Zellen in jedem Röhrchen hinzu, mischen Sie die Zellen mit einem Wirbeloszillator oder einer Pipettenpistole und inkubieren Sie die Mischung dann auf einem Rotator bei 4 °C für 30 min.</li>
	<li>Die Mischung 5-10 kurzen Ultraschallimpulsen aussetzen. Führen Sie die Ultraschallbehandlung auf dem Eis mit einer Beschallungsfrequenz von 20 kHZ und 80% Amplitude durch, wobei jeder Impuls 1 s dauert. Das Gemisch auf einem Rotator bei 40 Umdrehungen pro Minute (U/min) bei 4 °C für 30 min inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Ultraschallproben bei 8.000 x g für 20-30 min bei 4 °C. Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen.</li>
	<li>Aliquot 80 μL (1/10) des Zellextrakts und mischen Sie mit 20 μL 5x Natriumdodecylsulfat (SDS) Ladepuffer. Die Proben 5 min bei 98 °C kochen, 2 min auf Eis abkühlen lassen und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern. Verwenden Sie diese Proben als Eingabegruppe, um die Proteinexpression zu überwachen.</li>
	<li>30 μL Anti-Flag M2-Antikörper-konjugierte (Flag/M2) Kügelchen zu den verbleibenden Zellextrakten geben und auf einem Rotator bei 4 °C für mindestens 4 h oder über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 1.500 x g für 2 min bei 4 °C, um die Perlen zu sammeln. Fügen Sie 1 ml eiskalten Flag-Lysepuffer zu den Perlen hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 1.500 x g für 2 min bei 4 °C, um die Perlen zu sammeln. Wiederholen Sie Schritt 4.7 für 4-6 Mal.</li>
	<li>40 μL Flag-Peptide in einer Endkonzentration von 200 ng/μL zu den Beads geben und auf einem Rotator bei 4 °C für 2 h inkubieren, um die gebundenen Proteine zu eluieren.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 1.500 x g für 5 min bei 4 °C. Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen.</li>
	<li>Fügen Sie 10 μL 5x SDS-Ladepuffer hinzu, kochen Sie die Mischung bei 98 °C für 5 min, kühlen Sie sie 2 min auf Eis und lagern Sie sie bei -20 °C für Western Blotting. Alternativ lagern Sie das Eluat aus Schritt 4.10 direkt bei -80 °C für andere nachgeschaltete Experimente. HINWEIS: Die Menge der gereinigten ubiquitinierten Proteine kann erhöht werden, indem die Anzahl der Zellen und die Menge der transfizierten Plasmide erhöht werden. Eine Epitop-Tagging-Strategie kann angepasst werden, um zelluläre Komplexe zu reinigen, die spezifisch an ubiquitiniertes p53 unter nativen Reinigungsbedingungen binden. Durch die gleichzeitige Exprimierung von Flag-p53, mdm2 und HA-Ubiquitin kann der ubiquitinierte p53-Proteinkomplex durch sequentielle Flag- und HA-Antikörper-konjugierte Agarose aus Säugetierzellen immunpräzipitiert werden. Um die Bindungspartner von ubiquitinierten p53-Proteinen zu erhalten, sollte der weniger strenge BC100-Lysepuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 100 mM NaCl, 10% Glycerin, 0,2 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 und 1x Proteaseinhibitor) während des Reinigungsprozesses verwendet werden. Das Eluat aus dem HA-Peptid wird einer Massenspektrometrie unterzogen, um alle Partner zu identifizieren, die spezifisch an ubiquitiniertes p53 binden.</li>
</ol>5. Reinigung ubiquitinierter Proteine unter Denaturierungsbedingungen
<ol><li>1 ml eiskaltes PBS zu den in Schritt 3.3 erhaltenen Zellpellets geben und gleichmäßig mischen. Aliquot 100 μL (1/10 Vol.) der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen als Eingangsprobe.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 700 x g für 5 min bei 4 °C, um die Zellpellets zu sammeln. Fügen Sie 80 μL Flag-Lysepuffer zur Eingangsprobe hinzu, mischen Sie die Zellen mit einem Wirbeloszillator oder einer Pipettenpistole und lysieren Sie die Zellen 1 h lang auf Eis.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 8.000 x g für 20-30 min bei 4 °C. Aliquot 80 μL des Überstands in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	<li>20 μL 5x SDS-Ladepuffer in den Überstand geben, bei 98 °C 5-10 min kochen, 2 min auf Eis abkühlen lassen und bis zum Gebrauch bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die restlichen 900 μL der Zellsuspension bei 700 x g für 5 min bei 4 °C, um das Zellpellet zu sammeln. 1 ml Ubiquitinpuffer 1 (UB-Puffer 1; 6 M Guanidin-HCI, 0,1 M Na2HPO4, 6,8 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) und 0,2% Triton X-100, frisch ergänzt mit 10 mM β-Mercaptoethanol und 5 mM Imidazol) zu den Zellpellets geben und mehrmals durch Pipettieren auf und ab mischen, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. HINWEIS: Die Konzentration von Imidazol kann von 5 mM bis 20 mM variieren, um die unspezifische Proteinbindung an das nickelgeladene Harz zu verringern. Der Ubiquitin-Puffer enthält Guanidinhydrochlorid, das sowohl Ligasen als auch DUBs inaktiviert. β-Mercaptoethanol ist eine klare, farblose Flüssigkeit mit einem starken, unangenehmen Geruch, ähnlich wie faule Eier. Eine hochkonzentrierte Lösung verursacht schwere Schäden an der Schleimhaut, den oberen Atemwegen, der Haut und den Augen. Tragen Sie Handschuhe und Schutzbrille und operieren Sie im Abzug.</li>
	<li>Unterziehen Sie die Zelllysate 10-20 Runden Ultraschall, bis die Lösung nicht mehr viskos ist. Führen Sie die Ultraschallbehandlung auf dem Eis mit einer Beschallungsfrequenz von 20 kHZ und 80% Amplitude durch, wobei jeder Impuls 1 s dauert. Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g für 20-30 min bei RT und überführen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Fügen Sie 30 μL nickelgeladenes Harz zum Überstand hinzu und inkubieren Sie auf einem Rotator bei 15 U/min für 4 h oder über Nacht bei RT. Zentrifugieren Sie bei 1.500 x g für 2 min bei RT, um die Perlen zu sammeln.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml UB-Puffer 1 hinzu, inkubieren Sie mit Rotation in einem Shaker für 10 Minuten bei RT und zentrifugieren Sie bei 1.500 x g für 2 Minuten bei RT, um die Perlen zu sammeln.</li>
	<li>1 ml Ubiquitinpuffer 2 (UB-Puffer 2; 8 M Harnstoff, 0,1M Na2HPO4, 6,8 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) und 0,2% Triton X-100) zu den Perlen geben, mit Rotation in einem Shaker für 10 min bei RT inkubieren und bei 1.500 x g für 2 min zentrifugieren, um die Perlen zu sammeln. Wiederholen Sie dies noch einmal.</li>
	<li>Zu den Perlen 1 ml PBS hinzufügen, mit Rotation in einem Shaker für 10 min bei RT inkubieren und bei 1.500 x g für 2 min bei RT zentrifugieren, um die Perlen zu sammeln. Wiederholen Sie dies noch einmal.</li>
	<li>Elue gebundene Proteine durch Inkubieren der Beads mit 40 μL Imidazol in einer Endkonzentration von 0,5 M für 1 h bei RT. Zentrifuge bei 1.500 x g für 2 min bei RT.</li>
	<li>Den Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen geben, 10 μL 5x SDS-Ladepuffer hinzufügen, bei 98 °C für 5 min kochen, 2 min auf Eis abkühlen lassen und bei -20 °C für Western Blotting lagern. Alternativ können Sie das unverarbeitete Eluat bei -80 °C für andere nachgeschaltete Experimente lagern.</li>
</ol>6. Nachweis von gereinigten ubiquitinierten Proteinen durch Western Blotting
<ol><li>Die Proben aus den Schritten 4.11 und 5.12 werden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) gelöst und dann durch Western Blotting auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, um Zielproteine unter Verwendung der entsprechenden Antikörper wie beschrieben18 nachzuweisen.</li>
	<li>Kurz gesagt, inkubieren Sie die Membran durch Eintauchen in 20 ml Blocklösung, die 5% Milchpulver enthält, in TBST-Puffer (15 mM Tris-HCI; pH = 7,6, 4,6 mM Tris-Base, 150 mM NaCI, frisch ergänzt mit 0,1% Tween-20 vor Gebrauch) bei RT für 1 h. Dann inkubieren Sie die Membran mit primären Antikörpern bei RT für 2 h oder über Nacht bei 4 °C. Verwenden Sie die folgenden Antikörper für jeden Satz. Alle primären Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1:1000 verwendet.<ol><li>Nachweis des gesamten p53-Proteins, einschließlich ubiquitiniertem p53, mit einem monoklonalen Anti-p53-Antikörper nach Immunpräzipitation mit Flag/M2-Agaroseperlen.</li>
		<li>Nachweis ubiquitinierter p53-Proteine mit einem Anti-HA-Antikörper oder Anti-Ubiquitin-Antikörper nach Immunpräzipitation mit Flag/M2-Agaroseperlen.</li>
		<li>Nachweis ubiquitinierter p53-Proteine mit einem monoklonalen Anti-p53-Antikörper nach nickelgeladenem Harzpulldown.</li>
		<li>Nachweis des gesamten ubiquitinierten Proteins mit einem Anti-HA-Antikörper oder Anti-Ubiquitin-Antikörper nach einem nickelgeladenen Harz-Pulldown.</li>
	</ol></li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten sekundären Antikörpern bei RT für 1 h nach 3x Waschen mit TBST-Puffer für jeweils 5 min. Alle sekundären Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1:3000 verwendet. Dann waschen Sie die Membran mit TBST-Puffer 3x für jeweils 5 min mit leichtem Rühren.</li>
	<li>Starten Sie das Chemilumineszenz-Bildgebungssystem, um Signale von Western Blotting zu erkennen. Die Substratlösung wird für HRP vorbereitet, indem die Lösungen A und B im Verhältnis 1:1 gemischt werden.</li>
	<li>Legen Sie die Nitrozellulosemembran mit der Vorderseite nach oben in die Camera Obscura, und beschichten Sie die Substratlösung mit einer Pipettierpistole gleichmäßig auf der Membran. Wählen Sie das automatische Belichtungsverfahren, um Chemilumineszenzsignale zu erfassen, und passen Sie die Belichtungszeit manuell an, bis ein ideales Signal erfasst wird.</li>
</ol>

<ol><li>Kwon, Y. T., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+code+in+the+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).</li>
<li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).</li>
<li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligases%3A+Structure%2C+function%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li>
<li>Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-binding+domains+-+from+structures+to+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-binding domains - from structures to functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).</li>
<li>Oh, E., Akopian, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin-dependent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin-dependent signaling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).</li>
<li>Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+deubiquitylating+enzyme+specificity+begets+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).</li>
<li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery%3A+emerging+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).</li>
<li>Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+the+p53+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surfing the p53 network.</a> Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).</li>
<li>Boutelle, A. M., Attardi, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+and+Tumor+suppression%3A+It+takes+a+network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 and Tumor suppression: It takes a network.</a> Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).</li>
<li>Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53%3A+800+million+years+of+evolution+and+40+years+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).</li>
<li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinded+by+the+light%3A+The+growing+complexity+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Blinded by the light: The growing complexity of p53.</a> Cell. 137 (3), 413-431 (2009).</li>
<li>Brooks, C. L., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+ubiquitination%3A+Mdm2+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond.</a> Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+modifications%3A+exquisite+decorations+of+the+powerful+guardian%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian.</a> Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).</li>
<li>Dobbelstein, M., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2%3A+Open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Mdm2: Open questions.</a> Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).</li>
<li>Kulikov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2+facilitates+the+association+of+p53+with+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono-+versus+polyubiquitination%3A+differential+control+of+p53+fate+by+Mdm2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2.</a> Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).</li>
<li>Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+purification+of+ubiquitinated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the purification of ubiquitinated proteins.</a> Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).</li>
<li>Green, M., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+M+%22Molecular+Cloning+A+Laboratory+Manual.+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition)</a>. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28(2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die Ubiquitinierung spielt bei fast allen physiologischen und pathologischen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle2. In den letzten Jahren wurden große Fortschritte beim Verständnis der molekularen Rolle von Ubiquitin in Signalwegen gemacht und wie Veränderungen im Ubiquitin-System zu verschiedenen menschlichen Krankheiten führen2. Die Aufreinigung ubiquitinierter Proteine trägt dazu bei, Einblicke in die genaue Rolle der Ubiquitinierung in diesen Prozessen zu erhal...

Ubiquitin ist ein evolutionär konserviertes Protein aus 76 Aminosäuren 1,2,3. Ubiquitin bindet kovalent Lysinreste an Zielproteine durch Kaskaden mit aktivierenden (E1), konjugierenden (E2) und Ligase (E3) Enzymen. Ubiquitin wird zunächst durch das Enzym E1 aktiviert und dann auf die E2-konjugierenden Enzyme übertragen. Anschließend interagieren E3-Ubiquitin-Ligasen sowohl mit Ubiquitin-beladenen E2-Enzymen als auch mit Substratproteinen und vermitteln die Bildung einer Isopeptidbindung zwischen dem C-Terminal von Ubiquitin und einem Lysinrest im Substrat 1,2,3,4,5. Ubiquitinierung beinhaltet die Anlagerung von Ubiquitin-Einheiten an Lysinreste auf Substratproteinen oder an sich selbst, was zu Proteinmonoubiquitinierung oder Polyubiquitinierung führt. Dieser Ubiquitinierungsprozess findet intrazellulär in Eukaryoten statt und reguliert eine Vielzahl biologischer Prozesse. Die Ubiquitinierung führt zum Abbau von Substratproteinen über das Ubiquitin-Proteasom-System 1,2,3,4,5. Darüber hinaus moduliert die Ubiquitinierung die subzelluläre Proteinlokalisation, die Proteinkomplexbildung und den Proteintransport in Zellen 3,5. Ubiquitin-Einheiten, die an Substratproteine gebunden sind, können durch deubiquitinierende Enzyme (DUBs) entfernt werden6,7. Insbesondere bieten die verschiedenen Arten, in denen Ubiquitinketten zusammengesetzt sind, eine Vielzahl von Möglichkeiten, verschiedene biologische Prozesse zu regulieren 1,5. Die genaue Rolle der Ubiquitinierung bei der Regulierung der Substratproteinfunktion ist bisher unvollständig verstanden. Die Aufreinigung ubiquitinierter Proteine trägt zur Aufklärung der Auswirkungen der Proteinubiquitinierung auf eine Vielzahl zellulärer Prozesse bei.
Das p53-Protein ist eines der wichtigsten Tumorsuppressorproteine und weist bei fast allen menschlichen Krebserkrankungen genetische Mutationen oder Inaktivierungen auf 8,9,10,11. P53-Stabilität und -Aktivität werden in vivo durch posttranslationale Modifikationen, einschließlich Ubiquitinierung, Phosphorylierung, Acetylierung und Methylierung12,13, empfindlich reguliert. Das p53-Protein hat eine kurze Halbwertszeit von 6 min bis 40 min in verschiedenen Zellen, die hauptsächlich aus seiner Polyubiquitinierung und dem anschließenden proteasomalen Abbau resultiert10,12. Maus double minute 2 (Mdm2) ist eine E3-Ubiquitin-Ligase von p53, die an den N-Terminus von p53 bindet, um ihre Transkriptionsaktivität12,14,15 zu hemmen. Mdm2 fördert die Polyubiquitinierung und den proteasomalen Abbau von p53, um seine Stabilität zu kontrollieren, und induziert die Monoubiquitinierung von p53, um seinen nuklearen Export zu erleichtern12,14,15,16. Hier wird am Beispiel der Mdm2-vermittelten p53-Ubiquitinierung eine Methode zur Aufreinigung ubiquitinierter Proteine aus Säugetierzellen im Detail vorgestellt. Die Regulatoren, die den Ubiquitinierungsstatus von Zielproteinen beeinflussen, können mit diesem In-vivo-Ubiquitinierungsassay identifiziert werden, wenn sie in Säugetierzellen überexprimiert oder niedergeschlagen/ausgeschaltet werden. Darüber hinaus können ubiquitinierte Proteine als Substrate für In-vitro-Deubiquitinierungstests verwendet werden. Ein Hochdurchsatz-Screening kann durchgeführt werden, um spezifische DUBs für Zielproteine zu identifizieren, indem ubiquitinierte Substrate mit einzelnen DUBs inkubiert werden. Ubiquitinierte Proteine können als Gerüst fungieren, um nachgeschaltete Signalproteine in Zellen zu rekrutieren. Ein ubiquitinierter Zielproteinkomplex kann durch sequentielle Immunpräzipitation unter nativen Reinigungsbedingungen gereinigt und massenspektrometrisch identifiziert werden. Das aktuelle Protokoll kann umfassend verwendet werden, um die zellulären Proteine zu untersuchen, die durch Ubiquitinierung reguliert werden.
Es wurden mehrere Methoden zur Reinigung ubiquitinierter Proteine etabliert, darunter die Verwendung von affinitätsmarkiertem Ubiquitin, Ubiquitin-Antikörpern, Ubiquitin-bindenden Proteinen und isolierten Ubiquitin-bindenden Domänen (UBDs)17. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das affinitätsmarkiertes Ubiquitin als Mediator verwendet, um ubiquitinierte Proteine in Säugetierzellen zu reinigen. Die Verwendung von poly-His-getaggtem Ubiquitin bietet Vorteile gegenüber den anderen Methoden. Ubiquitinierte Proteine werden in Gegenwart starker Denaturierungsmittel gereinigt, was die unspezifische Bindung an nickelgeladenes Harz reduziert, indem zelluläre Proteine linearisiert und Protein-Protein-Interaktionen gestört werden. Im Gegensatz dazu kann die Verwendung von Ubiquitin-Antikörpern, Ubiquitin-bindenden Proteinen und isolierten UBDs als Mediatoren Bindungspartner nicht effektiv vom Zielprotein ausschließen, da die Reinigung unter weniger strengen Bedingungen durchgeführt werden muss. Darüber hinaus kann die Reinigung auch zu einer erhöhten Bindung von nicht verwandten Proteinen mit diesen Mediatoren führen. Darüber hinaus besteht eine Bindungsneigung für verschiedene Ubiquitin-Verknüpfungstypen sowie Mono- und Polyubiquitinierung durch Ubiquitin-bindende Proteine oder isolierte UBDs17. Die Verwendung von Poly-His-markiertem Ubiquitin trägt dazu bei, alle zellulären ubiquitinierten Proteine herunterzuziehen. Alternativ erleichtert die Verwendung kommerziell erhältlicher Anti-Flag- oder Anti-HA-Antikörper-konjugierter Agarose die Immunpräzipitation großflächiger Flag- oder HA-markierter Zielproteine unter nicht-denaturierenden Bedingungen. Ein zweiter Reinigungsschritt, beispielsweise durch nickelgeladenes Harz, das auf poly-His-markiertes Ubiquitin abzielt, kann verwendet werden, um ubiquitinierte Zielproteine mit hoher Reinheit für nachgeschaltete Experimente zu gewinnen. Insbesondere kann eine Epitop-Tagging-Reinigungsstrategie angepasst werden, wenn ein spezifischer Antikörper nicht erworben werden kann, um Zielproteine effektiv zu immunpräzipitieren. Schließlich behält die Reinigung ubiquitinierter Proteine in Säugetierzellen im Vergleich zur Reinigung in vitro den Ubiquitin-Bindungsmodus von Zielproteinen unter physiologischeren Bedingungen bei.

<table><tbody><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sangon Biotech</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL Maus IgG, HRP-gebundenes ganzes Ab (von Schafen)</td><td>GE healthcare</td><td>NA931</td><td>Sekundäres Antibdoy</td></tr><tr><td>Amersham ECL Ratten-IgG, HRP-gebundenes ganzes Ab (vom Esel)</td><td>GE healthcare</td><td>NA935</td><td>Sekundäres Antibdoy</td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td>FLAG/M2 Kügelchen</td></tr><tr><td>Monokolonaler Anti-GFP-Antikörper</td><td>Santa cruz</td><td>sc-9996</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-HA High Affinity</td><td>Roche</td><td>11867423001</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Mono-Mdm2-Antikörper (SMP14)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-965</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-p53 monokolonaler Antikörper (DO-1)</td><td>Santa cruz</td><td>sc-126</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Alddich</td><td>E5134</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>VivaCell</td><td>C04001-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FLAG Peptid</td><td>Sigma-Alddich</td><td>F3290</td><td>Elutionspuffer vorbereiten</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Ergänzung</td></tr><tr><td>Guanidin-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100287-0500</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>H1299</td><td>Stammzellbank, Chinesische Akademie für Immidazol</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0100</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemilumineszenz HRP Substrat</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reagenzien</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>MG132 MedChemExpress <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>HY-13259</td><td>Proteasom-Inhibitor</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501727-0500</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610476-0005</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Alddich</td><td>201154</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501726-0500</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>QIAGEN</td><td>30230</td><td>nickelgeladenes Harz</td></tr><tr><td>Nitrozellulose-Blotting-Membran</td><td>GE Healthcare</td><td>10600002</td><td>0,45 & Mikro; Mio. Porengröße</td></tr><tr><td>Opti-MEM reduziertes Serummedium</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Transfektionsmedium</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-cv</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607011-0100</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>Proteasehemmer Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biological Industries</td><td>01-100-1ACS</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>Sigma-Alddich</td><td>L5777</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>SDS Loading Buffer</td><td>Beyotime</td><td>P0015L</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Ergänzung</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501492-0005</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Tris-HCI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610103-0250</td><td>Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech</td><td>A110694-0500</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100777-0500</td><td>Nahrungsergänzungsmittel</td></tr><tr><td>Ultra High Sensitive Chemilumineszenz Imaging System</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>ChemiDoc XRS+</td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sangon Biotech</td><td>A510907-0500</td><td>Lösungsmittel</td></tr></tbody></table>

aufreinigung ubiquitinierter p53-proteine aus säugetierzellen

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Ubiquitination ist eine Art posttranslationale Modifikation, die nicht nur die Stabilität, sondern auch die Lokalisation und Funktion eines Substratproteins reguliert. Der Ubiquitinierungsprozess findet intrazellulär in Eukaryoten statt und reguliert fast alle grundlegenden zellbiologischen Prozesse. Die Reinigung ubiquitinierter Proteine hilft bei der Untersuchung der Rolle der Ubiquitinierung bei der Steuerung der Funktion von Substratproteinen. Hier wird ein schrittweises Verfahren zur Reinigung ubiquitinierter Proteine in Säugetierzellen am Beispiel des Tumorsuppressorproteins p53 beschrieben. Ubiquitinierte p53-Proteine wurden unter strengen nichtdenaturierenden und denaturierenden Bedingungen gereinigt. Das gesamte zelluläre Flag-markierte p53-Protein wurde mit Anti-Flag-Antikörper-konjugierter Agarose unter nicht denaturierenden Bedingungen gereinigt. Alternativ wurde das gesamte zelluläre His-markierte ubiquitinierte Protein unter Verwendung von nickelgeladenem Harz unter Denaturierungsbedingungen gereinigt. Ubiquitinierte p53-Proteine in den Eluaten wurden erfolgreich mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen. Mit diesem Verfahren können die ubiquitinierten Formen eines bestimmten Proteins effizient von Säugetierzellen gereinigt werden, was Studien über die Rolle der Ubiquitinierung bei der Regulierung der Proteinfunktion erleichtert.

Das schematische Diagramm zeigt die Flag-tagged p53 (Flag-p53) und His/HA double-tagged ubiquitin (HH-Ub) Proteine (Abbildung 1A). Die Verfahren zur Reinigung ubiquitinierter Proteine sind in Abbildung 1B zusammengefasst. Poly-His-markiertes Ubiquitin kann zu Zielproteinen in Säugetierzellen ligiert werden. Ubiquitinierte Proteine können mit Flag/M2-Beads unter nichtdenaturierenden Bedingungen oder durch immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC)...

Das Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Reinigung ubiquitinierter Proteine aus Säugetierzellen am Beispiel des Tumorsuppressorproteins p53. Ubiquitinierte p53-Proteine wurden unter strengen nichtdenaturierenden und denaturierenden Bedingungen aus Zellen gereinigt.

Aufreinigung ubiquitinierter p53-Proteine aus Säugetierzellen

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Mit diesem Protokoll können die ubiquitinierten Formen eines bestimmten Proteins effizient von Säugetierzellen gereinigt werden, was Studien über die Rolle der Ubiquitinierung bei der Regulierung der Proteinfunktion erleichtert. Die Reinigung von ubiquitinierten Proteinen in Säugetierzellen im Vergleich zur Reinigung in vitro behält den Ubiquitin-Bindungsmodus von Zielproteinen unter stärker radiologischen Bedingungen bei. Beginnen Sie mit der Zugabe von 1,5 Milliliter reduziertem Serummedium in drei 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Fügen Sie jeder Röhre transfektionsbereite Plasmid-DNA hinzu und fügen Sie 0,2 Mikrogramm grün fluoreszierendes Proteinplasmid hinzu, um die Transfektionseffizienz zu überwachen. Fügen Sie 78 Mikroliter Liposomentransfektionsreagenz zu 4,5 Milliliter reduziertem Serummedium in einem anderen Zentrifugenröhrchen hinzu, um die Liposomen zu verdünnen. Mischen Sie gründlich, indem Sie die Tube schnippen und lassen Sie sie dann fünf Minuten bei Raumtemperatur stehen.Geben Sie 1,5 Milliliter der verdünnten Liposomenlösung in jedes Röhrchen, das 1,5 Milliliter der verdünnten DNA-Lösung enthält. Die Plasmide gründlich mischen und mindestens 20 Minuten bei Raumt

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ubiquitinierung ist ein wichtiger posttranslationale Modifikation durch eine Gruppe von drei Enzymen durchgeführt. Mutationen von Genen in dieser Modifikation beteiligt sind mit vielen verschiedenen menschlichen Krankheiten assoziiert. Hier beschreiben wir Protokolle, um Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen...

Detektion von Protein Ubiquitination

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Extraktion und Reinigung von ubiquitinylierten Peptiden, die Reste von Diglycin-Peptiden aus einer komplexen Peptidmischung enthalten. Das vorgestellte Verfahren kann dabei helfen, ursprüngliche Ubiquitinierungsstellen im Protein zu identifizieren.

Immunaffinitätsbasierte Extraktion von ubiquitinylierten Peptiden: Eine Technik zur selektiven Extraktion von Ubiquitin-markierten Peptiden aus gereinigten Peptidfraktionen

Die hier beschriebene Methode ist eine neue Vesikel Isolierung Protokoll, das für die Reinigung von den zellulären Kompartimenten ermöglicht dem exogene Antigenen durch endoplasmatische Retikulum verbundenen Abbau in Kreuz-Präsentation verarbeitet werden.

Reinigung der Membran-Fach für endoplasmatische Retikulum-assoziierten Abbau von exogenen Antigenen in Kreuz-Präsentation

Im Gegensatz zu Ubiquitin Ligases wurden einige E3 SUMO Ligases identifiziert. Dieses modifizierte in-vitro- Sumoylierung Protokoll ist in der Lage, neuartige SUMO E3 Ligases durch eine in-vitro- Rekonstitution Assay zu identifizieren.

In-vitro- Sumoylierung Assay SUMO E3 Ligase Tätigkeit zu studieren

Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung, Detektion und Identifizierung von diGly Peptiden, die aus ubiquitinierten Proteinen aus komplexen biologischen Proben stammen. Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar, robust und übertrifft die veröffentlichten Methoden in Bezug auf den Grad der Tiefe der Ubiquitinom-Analyse.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

Ubiquitination ist eine post-translationale Modifikation, die eine wichtige Rolle in zellulären Prozessen spielt und durch Deubiquitination eng koordiniert wird. Defekte in beiden Reaktionen liegen den menschlichen Pathologien zugrunde. Wir bieten Protokolle zur Durchführung von Ubiquitination und Deubiquitination Reaktion in vitro mit gereinigten Komponenten.

In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-Likes (Ubls) spezifische Proteome zu etablieren, um Änderungen dieser Art von post-translationalen Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, die mit einer bestimmten Erkrankung wie einer Behandlung oder einem Phänotyp verbunden sind.

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Diese Methode beschreibt die Bewertung globaler Veränderungen in der Ubiquitin-Kettentopologie. Die Bewertung erfolgt durch die Anwendung eines auf Massenspektrometrie basierenden zielgerichteten Proteomik-Ansatzes.

Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für einen Ubiquitylierungsassay eines spezifischen Substrats und einer E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzellen. HEK293T-Zelllinien wurden zur Proteinüberexpression verwendet, das polyubiquitylierte Substrat wurde durch Immunpräzipitation von Zelllysaten gereinigt und in SDS-PAGE aufgelöst. Immunoblotting wurde verwendet, um diese posttranslationale Modifikation zu visualisieren.

Evaluierung der Substratubiquitylierung mittels E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzelllysaten

Ubiquitination ist ein entscheidender Regulator der intrazellulären Proteinfunktionen. Hier beschreiben wir zwei Zelllysemethoden zur Erkennung der Substratprotein-Ubiquitinationswerte in Säugetierzellen und vergleichen deren Wirksamkeit bei der Analyse von Ubiquitinationsniveaus. Die Proteinüberexpression in HEK293T Zellen wurde durch vorübergehende Transfektion induziert, und ubiquitinierte Proteine wurden durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen.

Vergleichende Strategien zur Nachweisung der Uquitination in Säugetierzelllysaten unter Verwendung von SMAD2/SMURF2 als Modell

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Ubiquitinierung von Streptococcus pneumoniae mit Säugetierzelllysat oder einem reinen Ubiquitin-Enzymkomplex, gefolgt von einer Behandlung mit gereinigtem VCP/p97-UFD1-NPLOC4-Proteinkomplex, um dessen bakteriolytische Aktivität zu bewerten, was die Untersuchung ubiquitinabhängiger Immuneffektoren ermöglicht.

In-vitro Rekonstitution der bakteriellen Ubiquitination und VCP/p97-vermittelte Elimination

Erfahren Sie die Aufreinigung ubiquitinierter p53-Proteine aus Säugetierzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Ubiquitinierung in der Proteinfunktionsregulation.

Aufreinigung ubiquitinierter p53-Proteine aus Säugetierzellen

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