Name: Größenausschlusschromatographie zur Trennung extrazellulärer Vesikel aus konditionierten Zellkulturmedien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Lernen Sie die Größenausschlusschromatographie zur effizienten Isolierung extrazellulärer Vesikel aus konditionierten Zellkulturmedien. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Vesikelinhalt und die Untersuchung zellulärer Kommunikationsmechanismen.

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Die Autoren danken Penn State Behrend und der Hamot Health Foundation für die Finanzierung sowie der Penn State Microscopy Facility in University Park, PA.

<ol><li>Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+evidence+for+externalization+of+the+transferrin+receptor+in+vesicular+form+in+sheep+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).</li>
<li>Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+transferrin+and+recycling+of+the+transferrin+receptor+in+rat+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Rontogianni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+extracellular+vesicles+allows+for+human+breast+cancer+subtyping%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping.</a> Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).</li>
<li>Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+circulating+cancer+biomarkers%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14(2018).</li>
<li>Thompson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+neurodegenerative+disease-pathogenesis+to+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).</li>
<li>O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake%2C+functionality%2C+and+re-release+of+extracellular+vesicle-encapsulated+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo.</a> Cell Reports. 39 (2), 110651(2022).</li>
<li>Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+extracellular+vesicles+and+release+of+their+cargo+from+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).</li>
<li>Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+heterogeneity%3A+Subpopulations%2C+isolation+techniques%2C+and+diverse+functions+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 738(2018).</li>
<li>Tzaridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+separation+techniques+impact+results+from+human+blood+samples%3A+Considerations+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211(2021).</li>
<li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> Journal of Chromatography A. 1636, 461773(2021).</li>
<li>Gámez-Valero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography-based+isolation+minimally+alters+extracellular+vesicles%27+characteristics+compared+to+precipitating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+functionality+of+extracellular+vesicles+isolated+using+size-exclusion+chromatography+compared+to+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).</li>
<li>Campos-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+detection+of+extracellular+vesicles+immune-captured+from+urine+by+conventional+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2042(2019).</li>
<li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1CAM+is+not+associated+with+extracellular+vesicles+in+human+cerebrospinal+fluid+or+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma.</a> Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Mathieu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+exosome+versus+small+ectosome+secretion+revealed+by+live+intracellular+tracking+of+CD63+and+CD9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+simplified+dichotomic+size-exclusion+chromatography+for+isolating+extracellular+vesicles+toward+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145(2021).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).</li>
<li>Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+macromolecular+complexes+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3239(2007).</li>
<li>Williams, R. L., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+shape+of+the+ESCRT+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The emerging shape of the ESCRT machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).</li>
<li>Willms, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+release+subpopulations+of+exosomes+with+distinct+molecular+and+biological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).</li>
<li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).</li>
<li>Böing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
<li>Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three+step+protocol+to+isolate+extracellular+vesicles+from+plasma+or+cell+culture+medium+with+both+high+yield+and+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450(2020).</li>
<li>Guerreiro, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+extracellular+vesicle+isolation+by+combining+cell+media+modifications%2C+ultrafiltration%2C+and+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography.</a> PLoS ONE. 13 (9), 02024276(2018).</li>
<li>Onódi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-purity+extracellular+vesicles+by+the+combination+of+iodixanol+density+gradient+ultracentrifugation+and+bind-elute+chromatography+from+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1479(2018).</li>
<li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

SEC ist eine benutzerfreundliche Methode zur adäquaten Trennung von Elektrofahrzeugen von konditioniertem CCM. Um zellabgeleitete EVs spezifisch zu isolieren, muss eine sorgfältige Berücksichtigung der Art des CCM und seiner Ergänzungen berücksichtigt werden. Viele Zellkulturmedien müssen mit FBS ergänzt werden, das EVs enthält, die von dem Tier stammen, bei dem das Serum geerntet wurde. Diese Serum-EVs können jedes Signal sättigen und maskieren, das von EVs erzeugt wird, die von Zellen in Kultur26</sup...

Die Explosion des Interesses an der Untersuchung extrazellulärer Vesikel (EVs) wurde von großen Fortschritten in den Technologien und Techniken begleitet, die zur Trennung und Untersuchung dieser nanogroßen, heterogenen Partikel verwendet werden. In der Zeit seit ihrer Entdeckung vor fast vier Jahrzehnten1,2 wurde festgestellt, dass diese kleinen membranösen Strukturen bioaktive Lipide, Nukleinsäuren und Proteine enthalten und eine wichtige Rolle in der interzellulären Kommunikation spielen 3,4. EVs werden von allen Zelltypen freigesetzt und sind daher in allen biologischen Flüssigkeiten vorhanden, einschließlich Blutplasma und Serum, Speichel und Urin. EVs in diesen Flüssigkeiten sind vielversprechend, um als nicht-invasive Biomarker für verschiedene Krankheiten zu dienen, einschließlich neuroinflammatorischer und neurodegenerativer Erkrankungen, Krebs und Autoimmunerkrankungen 5,6,7. Ferner können mechanistische In-vitro-Studien durch Zellkulturtechniken durchgeführt werden, indem in das Kulturmedium 3,8,9 freigesetzte EVs getrennt werden.
Um die Rolle von EVs in der Krankheitspathophysiologie zu verstehen, ist eine angemessene Trennung von der Flüssigkeit, in der sie gefunden werden, von größter Bedeutung. Der Goldstandard für die EV-Trennung ist seit langem die differentielle Ultrazentrifugation (dUC)10, jedoch sind ausgefeiltere Techniken entstanden, um eine bessere Trennung von EVs von anderen extrazellulären Komponenten zu erreichen. Einige dieser Techniken umfassen Dichtegradienten, asymmetrische Flussfeldflussfraktion (A4F), Durchflusszytometrie, Immuneinfang, Polyethylenglykolfällung und Größenausschlusschromatographie (SEC) 11,12,13. Jede Technik hat ihre eigenen Vor- und Nachteile; Es wurde jedoch gezeigt, dass insbesondere SEC EVs sowohl von biologischen Flüssigkeiten als auch von Zellkulturüberständen recht effektiv trennt 8,14,15. SEC hat auch den zusätzlichen Vorteil, relativ einfach und benutzerfreundlich zu sein.
SEC ist eine Methode, die Komponenten einer Flüssigkeit basierend auf der Größe trennt. Bei dieser Technik wird eine Harzsäule (entweder intern hergestellt oder kommerziell gekauft) verwendet, um eine Probe zu fraktionieren. Kleine Partikel in der Probe werden zwischen den Perlen im Harz eingeschlossen, während größere Partikel das Harz freier passieren und somit früher im Prozess eluieren können. Da EVs größer sind als viele extrazelluläre Proteine und Proteinaggregate, passieren EVs die Säule schneller und eluieren in früheren Fraktionen als extrazelluläre Proteine14.
In diesem Methodenpapier wird die Verwendung von SEC zur Trennung von EVs aus Zellkulturmedien (CCM) aus menschlichen Oligodendrozyten sowohl unter Kontroll- als auch unter endoplasmatischem Retikulum (ER) Stressbedingungen skizziert. Unter Verwendung dieses Protokolls wird gezeigt, dass EVs, die mit dieser Technik getrennt werden, in bestimmten Fraktionen gefunden werden, die für die nachgeschaltete Charakterisierung zusammengefasst und konzentriert werden können, und dass die getrennten EVs aus Zellen stammen und nicht aus einer exogenen Quelle wie fetalem Rinderserum (FBS), das zur Ergänzung des CCM verwendet wird. Das Vorhandensein der kanonischen EV-Marker CD63, CD81 und CD916,17,18,19 in den EV-Fraktionen und ihre Abwesenheit in den Proteinfraktionen wird mit Western Blotting nachgewiesen. Mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) werden EVs sichtbar gemacht und zeigen die erwartete Morphologie und werden nur in der EV-Fraktion beobachtet. Partikel werden auch in den EV- und Proteinfraktionen sowohl der Kontroll- als auch der ER-Stressbedingungen gezählt, und eine große Anzahl von Partikeln innerhalb des erwarteten Größenbereichs von 50-200 nm Durchmesser wird in den EV-Proben beobachtet. Zusammen unterstützen diese Daten die Vorstellung, dass SEC eine effiziente und effektive Methode zur Trennung von EVs aus Zellkulturmedien ist.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>VWR</td><td>97064-588</td><td></td></tr><tr><td>4X Laemmli Probenpuffer</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit, Ultracel, 3 KDa, 15 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC900308</td><td>3 kDa Cutoff-Amicon</td></tr><tr><td>Ultra-2 Zentrifugalfiltereinheit mit Ultracel-3 Membran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC200324</td><td>3 kDa</td></tr><tr><td>Cutoff Ammonium Persulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gebundene</td><td>Antikörper-Zellsignaltechnologie</td><td>7074V</td><td>1:1000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-Calnexin-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>&nbsp; ab22595</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-CD9 Maus Monoklonaler Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>312102</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-GM130 Antikörper [EP892Y] - cis-Golgi Marker</td><td>Abcam</td><td>ab52649</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-Maus IgG, HRP-linked Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7076V</td><td>1:1000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Automatischer Fraktionssammler</td><td>Izon Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA Assay Kit</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD Kamera</td><td>Gatan Orius SC200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cd63 Maus anti Human</td><td>BD</td><td>556019</td><td>1:1000 Verdünnung</td></tr><tr><td>CD81 Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-23962</td><td>1:1000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Cellstar Filter Cap Zellkulturflaschen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Imager</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrat</td><td>BioRad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>Desoxycholat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-10G</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>3483-12-3</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Hohe Glukose mit L-Glutamin; ohne Natrium</td><td>Cytiva</td><td>SH300022. </td><td></td>FS</tr><tr><td>Fötales Kälberserum Premium-Qualität</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum, Exosomen-abgereichert</td><td>Thermo Scientific A2720801</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>BioRad</td><td>1610718</td><td></td></tr><tr><td>Hochwertige fettfreie Trockenmilch</td><td>Amazon</td><td>B076NRD2TZ</td><td></td></tr><tr><td>HOG Humane Oligodendrogliom-Zelllinie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC163</td><td></td></tr><tr><td>Izon Science Usa Ltd qev Größenausschlusssäulen 5pk</td><td>Izon Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol >99,8% ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Glasplatten</td><td>BioRad</td><td>1653310</td><td>mit 0,75mm Abstandshaltern</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Kurzplatten</td><td>BioRad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin, Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP66150</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kits und Reagenzien</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Pierce PVDF Transfermembranen</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Western Blotting Filterpapier</td><td>Thermo Scientific</td><td>84783</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylen-20 (TWEEN 20), 500 ml</td><td>Bio Basic</td><td>TB0560</td><td></td></tr><tr><td>Protease/Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (100X)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>5872S</td> Rekombinanter <td></td></tr><tr><td>Anti-TSG101-Antikörper [EPR7130(B)]</td><td>ABCam</td><td>ab125011</td><td>1:1000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Slodiumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SX0603</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat,&ge; 99,0% (GC), staubfreie Pellets</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylendiamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>TGX Stain-Free FastCast Acrylamid Kit, 10%</td><td>BioRad</td><td>1610183</td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop</td><td>FEI Tecnai 12 Biotwin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioRad</td><td>1610716</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0,25% Protease mit Schweinetrypsin, HBSS, EDTA; ohne Calcium, Magnesium</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Tunicamycin</td><td>Tocris</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Zeta Software anzeigen</td><td>Analytik</td><td></td><td>NTA Software</td></tr></tbody></table>

größenausschlusschromatographie zur trennung extrazellulärer vesikel aus konditionierten zellkulturmedien

Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind lipidmembrangebundene Strukturen in Nanogröße, die von allen Zellen freigesetzt werden, in allen Bioflüssigkeiten vorhanden sind und Proteine, Nukleinsäuren und Lipide enthalten, die die Mutterzelle widerspiegeln, von der sie abgeleitet sind. Die richtige Trennung von EVs von anderen Komponenten in einer Probe ermöglicht die Charakterisierung ihrer zugehörigen Fracht und gibt Einblick in ihr Potenzial als interzelluläre Kommunikatoren und nicht-invasive Biomarker für zahlreiche Krankheiten. In der aktuellen Studie wurden aus Oligodendrozyten gewonnene EVs aus Zellkulturmedien isoliert, wobei eine Kombination modernster Techniken, einschließlich Ultrafiltration und Größenausschlusschromatographie (SEC), verwendet wurde, um EVs von anderen extrazellulären Proteinen und Proteinkomplexen zu trennen. Unter Verwendung kommerziell erhältlicher SEC-Säulen wurden EVs von extrazellulären Proteinen getrennt, die aus menschlichen Oligodendrogliom-Zellen sowohl unter Kontroll- als auch unter endoplasmatischem Retikulum (ER) -Stressbedingungen freigesetzt wurden. Die kanonischen EV-Marker CD9, CD63 und CD81 wurden in den Fraktionen 1-4 beobachtet, nicht jedoch in den Fraktionen 5-8. GM130, ein Protein des Golgi-Apparates, und Calnexin, ein integrales Protein des ER, wurden als negative EV-Marker verwendet und in keiner Fraktion beobachtet. Ferner wurde beim Pooling und der Konzentration der Fraktionen 1-4 als EV-Fraktion und der Fraktionen 5-8 als Proteinfraktion die Expression von CD63, CD81 und CD9 in der EV-Fraktion beobachtet. Die Expression von GM130 oder Calnexin wurde bei keinem der Fraktionstypen beobachtet. Die gepoolten Fraktionen sowohl aus Kontroll- als auch aus ER-Stressbedingungen wurden mit Transmissionselektronenmikroskopie visualisiert und Vesikel wurden in den EV-Fraktionen, aber nicht in den Proteinfraktionen beobachtet. Partikel in den EV- und Proteinfraktionen aus beiden Bedingungen wurden ebenfalls mit einer Nanopartikel-Tracking-Analyse quantifiziert. Zusammen zeigen diese Daten, dass SEC eine effektive Methode zur Trennung von EVs aus konditionierten Zellkulturmedien ist.

Western Blotting zeigt ausreichende Trennung von Elektrofahrzeugen von CCM Um die Wirksamkeit von SEC bei der Trennung von EVs aus Zellkulturmedien zu bewerten, wurde ein Western Blot unter Verwendung jeder einzelnen Fraktion aus den Kontrollproben durchgeführt, um die Expression der drei kanonischen EV-Marker CD9, CD63 und CD81 sowie GM130 und Calnexin18 zu untersuchen, die als Negativkontrollen verwendet wurden (Abbildung 3). Die Albuminexpressio...

Das Protokoll zeigt hier, dass extrazelluläre Vesikel mittels Größenausschlusschromatographie adäquat von konditionierten Zellkulturmedien getrennt werden können.

Größenausschlusschromatographie zur Trennung extrazellulärer Vesikel aus konditionierten Zellkulturmedien

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid-membrane bound structures that are released from all cells, are present in all biofluids, and contain ...

Die Trennung extrazellulärer Vesikel von Flüssigkeiten wie Zustandszellkulturmedien kann es Forschern ermöglichen, vestikuläre Fracht zu charakterisieren und ihre intrazellulären Kommunikationsmechanismen zu erforschen. Diese Technik ermöglicht eine ausreichende Trennung von EVs und extrazellulären Proteinen aus konditionierten Zellkulturmedien, die einfach und benutzerfreundlich ist. Um zu beginnen, legen Sie PBS in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad.Beobachten Sie die Kontroll- und Tunicamycin-behandelten Zellkulturkolben unter einem zusammengesetzten Mikroskop mit einer 10-fachen und 100-fach-Objektivlinse. Notieren Sie sich eventuelle Unterschiede zwischen den Flaschen. Das Medium aus dem Kolben nehmen und in ein 50-Milliliter-Röhrchen geben.Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und übertragen Sie den Supernatant in ein neues Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 2000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Supernatant in eine neue Röhre und legen Sie die Röhre auf Eis.Nehmen Sie vier 15 Milliliter drei Kilodalton Cutoff-Ultrafiltrationseinheiten und fügen Sie fünf Milliliter PBS zu jedem Röhrchen hinzu. Saugen Sie die Filter an, indem Sie die Einheiten bei 4.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach dem Entfernen von PBS aus den Einheiten teilen Sie den Überstand aus Kontroll- und behandelten Bedingungen in zwei Ultrafiltrationseinheiten mit jeweils etwa 12,5 Milliliter Medien auf.Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4.000 G für eine Stunde 45 Minuten bei vier Grad Celsius oder bis das konzentrierte Medium oder Retentat in jeder Einheit auf 250 Mikroliter oder weniger konzentriert ist. Das Retentat von beiden Steuergeräten in ein markiertes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und von behandelten Einheiten in ein anderes Röhrchen überführen. Messen Sie das Gesamtvolumen des Retentats in jedem Mikrozentrifugenröhrchen.Wenn das Volumen weniger als 500 Mikroliter beträgt, fügen Sie 0,22 Mikron gefiltertes PBS hinzu, bis das endgültige Volumen 500 Mikroliter beträgt. Legen Sie die Röhrchen in einen minus 80 Grad Celsius warmen Gefrierschrank. Schalten Sie den automatischen Fraktionssammler oder AFC ein.Entfernen Sie die Säule von vier Grad Celsius und lassen Sie die Säule auf Raumtemperatur erwärmen. Nehmen Sie Retentatproben aus dem minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank und legen Sie sie zum Auftauen auf Eis, während Sie warten, legen Sie acht beschriftete 1,5-Milliliter-Röhrchen mit Deckeln nach innen in das AFC-Karussell. Fügen Sie die Spalte mit dem Barcode zum Lesegerät in den AFC ein und passen Sie die Einstellungen an, um acht Bruchteile von jeweils 500 Mikrolitern und das Puffervolumen auf die Standardeinstellung zu sammeln.Überprüfen Sie dann die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Sammlung zu starten. Danach wird der Speicherpuffer vollständig in den oberen Teil der Säulenmatrix absorbiert. Beginnen Sie mit dem Spülen der Säule, indem Sie der Säule 15 Milliliter PBS hinzufügen.Fügen Sie PBS nicht zu früh hinzu, da dies den Speicherpuffer verdünnt und eine ausreichende Spülung verhindert. Kurz bevor alle 15 Milliliter PBS von der Matrix absorbiert werden, klicken Sie auf OK, um die Spülung zu stoppen und alle verbleibenden PBS von der Oberseite der Säulenmatrix mit einer Mikropipette zu entfernen. Berühren Sie die Matrix nicht.Fügen Sie 500 Mikroliter Probe in die Mitte der Spalte hinzu und klicken Sie auf OK, um den Lauf zu starten. Nachdem die Probe vollständig in die Matrix aufgenommen wurde, fügen Sie sofort acht Milliliter PBS in die Säule ein. AFC vertreibt das Hohlraumvolumen automatisch in die Mitte des Karussells, bevor alle acht Fraktionen von jeweils 500 Mikrolitern gesammelt werden.Entfernen Sie nach dem Lauf Fraktionen aus dem Karussell und legen Sie sie auf Eis. Entfernen Sie dann das Leerraumvolumen aus der Mitte des Karussells. Als nächstes fügen Sie der Säule 10 Milliliter PBS hinzu, um die Restprobe aus der Säule zu waschen.Und sobald die reuige Probe vollständig gespült wurde, fügen Sie 15 Milliliter PBS in die Säule ein. Wenn das endgültige PBS von der Matrix absorbiert wird, fügen Sie 500 Mikroliter 0,5 molare Natriumhydroxid in die Mitte der Säulenmatrix hinzu. Dann, wenn das Natriumhydroxid absorbiert wird, fügen Sie 30 Milliliter PBS in die Säule und lassen Sie sie durchspülen.Sobald alle Proben fertig sind, bewahren Sie die Säule für die spätere Verwendung auf, indem Sie der Säule 15 Milliliter 0,05% Natriumazid hinzufügen. Lassen Sie ungefähr fünf Milliliter Natriumazid auf der Oberseite der Säulenmatrix. Entfernen Sie die Säule aus dem AFC und bringen Sie die obere und untere Kappe an, bevor Sie die Säule zur Lagerung bei vier Grad Celsius platzieren.Konstruieren Sie die Ultrafiltrationseinheit. Erhalten Sie zwei Milliliter, drei Kilodalton Cutoff-Ultrafiltrationseinheiten pro Probe. Jede Einheit besteht aus drei Teilen, Kegel, Filter und Durchflusszylinder.Beschriften Sie jedes Teil richtig. Fügen Sie einen Milliliter PBS in den Filterteil und verschließen Sie ihn mit dem Kegelstück. Zentrifugieren Sie die Konusseite der Ultrafiltrationseinheit bei 3, 500 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie das gefilterte PBS aus dem Durchflusszylinder.Drehen Sie die Ultrafiltrationseinheit auf den Kopf und zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei 1000 G bei vier Grad Celsius, um das restliche PBS zu entfernen. Kombinieren Sie vier 500 Mikroliter jeder Fraktion und fügen Sie sie der Ultrafiltrationseinheit hinzu. Dann fallen Zentrifugenkolonnen für eine Stunde, 45 Minuten bei 3.500 G bei vier Grad Celsius oder bis der Retentatspiegel bei 100 Mikrolitern liegt.Entfernen Sie den Durchflusszylinder, und verwerfen Sie den Durchfluss. Drehen Sie die Ultrafiltrationseinheit auf den Kopf und zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei 1000 XG bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie das Retentat im Kegel in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und machen Sie das Probenvolumen auf 150 Mikroliter mit 0,22 Mikron gefiltertem PBS, bevor Sie die Röhrchen in minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank legen.Ein repräsentativer westlicher Block einzelner Fraktionen zeigte eine starke Expression von CD9, CD63 und CD81. Verstöße eins bis vier mit wenig oder keinem Ausdruck Verstöße fünf bis acht. In keiner Fraktion wurde eine Expression von GM130 oder Calnexin beobachtet.Albumin war nur in den Bruchteilen sechs bis acht vorhanden. Die Wirksamkeit der Konzentration der EV- und Proteinfraktionen wurde ebenfalls bewertet. Die Expression von CD9 und CD63 wurde in den Zelllysaten beobachtet.Alle drei CD-Proteine waren in EV-Fraktionen von Kontroll- und Tunicamycin-behandelten Proben vorhanden, aber nicht in den Proteinfraktionen. Das Tumorempfindlichkeitsgen 101 war in Zelllysaten vorhanden, nicht jedoch in EV- oder Proteinfraktionen. GM130 und Calnexin wurden nur in den Zelllysaten beobachtet.Im westlichen Blot von Exosomen-depletierten Zellkulturmedien waren die EV-Marker in den Zelllysaten vorhanden, aber nicht in den Medienproben. Die Albuminexpression wurde in den Proteinfraktionen und eine minimale Expression in den Zelllysaten beobachtet. TEM-Beobachtungen zeigten sphärische Strukturen in den EV-Fraktionen von Kontroll- und Tunicamycin-behandelten Proben.Diese Strukturen wurden in beiden Proteinfraktionen des Probentyps nicht beobachtet. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse zeigt Unterschiede in den Partikelkonzentrationen der Kontroll- und behandelten Fraktionen in EV-Fraktionen im Vergleich zur Kontrolle, etwas mehr Partikel waren in der Tunicamycin-Behandlung vorhanden. In den Proteinfraktionen wurden jedoch weniger Partikel im Vergleich zu EVs nachgewiesen.Es ist wichtig, das gleiche Probenvolumen für die Kontroll- und behandelten Bedingungen zu haben, um einen einfachen Vergleich der EVs aus den verschiedenen Behandlungen zu ermöglichen. Nach der Trennung von EVs aus den Zustandszellkulturmedien können wir den Protein-, RNA- und Lipidgehalt der Vesikel mit Proteomics-RNA-Sequenzierung und Lipidomik charakterisieren.

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Quelle: Watson, D. C., et al. Skalierbare Isolierung und Reinigung von extrazellulären Vesikeln aus Escherichia coli und anderen Bakterien. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Verwendung der Größenausschlusschromatographie mit porösen Harzkügelchen zur Isolierung bakterieller extrazellulärer Vesikel (EVs) aus einem Bakterienkulturfiltrat. Größere EVs eluieren früh, indem sie die Harzporen umgehen, während kleinere Proteine in die Poren eindringen und später eluieren.

Isolierung bakterieller extrazellulärer Vesikel mittels Größenausschlusschromatographie 

Dieses Video beschreibt eine Methode, die auf Größenausschlusschromatographie (SEC) basiert, um extrazelluläre Vesikel oder EVs zu isolieren, die aus den Immunzellen des Gehirns – den Mikroglia – stammen. Die EVs fungieren als molekulare Fracht, um Mediatoren zu liefern, die eine Immunantwort regulieren. Daher können die isolierten EVs als in vitro Modell verwendet werden, um die Mikroglia-Neuronen-Wechselwirkung während einer neuronalen Immunantwort zu untersuchen.

SEC-basierte Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus Mikroglia: Eine Technik zur Isolierung extrazellulärer Vesikel aus Mikroglia-konditionierten Kulturmedien

Dieses Video demonstriert die auf Dichtegradienten-Ultrazentrifugation basierende Aufreinigungsmethode zur Isolierung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel, die für Charakterisierungsstudien geeignet sind.

Reinigung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel: Eine Technik zur Aufreinigung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation

In diesem Video demonstrieren wir eine Technik – Größenausschlusschromatographie – um eine heterogene Population von äußeren Membranvesikeln oder OMVs zu trennen, die von Bakterien abstammen. Diese Vesikel sind kugelförmige Strukturen in Nanogröße und werden durch Size Exclusion Chromatography in große und kleine Subpopulationen unterteilt, die auf ihrer Größe basieren.

Größenausschlusschromatographie-basierte Trennung bakterieller extrazellulärer Vesikel: Eine Technik zur Trennung heterogener Populationen gramnegativer bakterieller Vesikel der äußeren Membran anhand ihrer Größe

Dieses Video zeigt die Größenausschlusschromatographie (SEC) Technik zur Reinigung bakterieller extrazellulärer Vesikel (EVs) aus dem Kulturfiltrat von Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Bei der Technik wird eine poröse, mit Harz gefüllte Säule verwendet, um gereinigte Fraktionen von EVs zu erhalten. Die porösen Partikel lassen selektiv kleinere Proteine in die Poren eindringen, was zu einer langsameren Elution führt. Gleichzeitig werden EVs aufgrund ihrer größeren Größe vom Eindringen in die...

Eine Größenausschlusschromatographie-Technik zur Reinigung mykobakterieller extrazellulärer Vesikel

Dieser Artikel stellt Methoden zur Erzeugung, Reinigung und Quantifizierung von Caenorhabditis elegans extrazellulären Vesikeln vor.

Reinigung und Analyse von Caenorhabditis elegans Extrazelluläre Vesikel

Bakterielle Vesikel spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese und haben vielversprechende biotechnologische Anwendungen. Die Heterogenität der Vesikel erschwert die Analyse und Verwendung; Daher ist eine einfache, reproduzierbare Methode zur Trennung unterschiedlicher Größen von Vesikeln erforderlich. Hier demonstrieren wir die Verwendung der Größenausschlusschromatographie zur Trennung heterogener Vesikel, die von Aggregatibacter actinomycetemcomitansproduziert werden.

Größenausschlusschromatographie zur Analyse der Heterogenität bakterieller äußerer Membranvesikel

Bakterien sezernieren nanometergroße extrazelluläre Vesikel (EVs), die bioaktive biologische Moleküle tragen. Die EV-Forschung konzentriert sich auf das Verständnis ihrer Biogenese, ihrer Rolle bei Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Interaktionen und Krankheiten sowie ihrer potenziellen therapeutischen Anwendungen. Ein Workflow für die skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterien wird vorgestellt, um die Standardisierung der EV-Forschung zu erleichtern.

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Extrazelluläre Vesikel sind für biomedizinische Anwendungen sehr vielversprechend, aber die derzeitigen Isolierungsmethoden sind zeitaufwändig und für den klinischen Einsatz unpraktisch. In dieser Studie stellen wir ein mikrofluidisches Gerät vor, das die direkte Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großen Mengen von Bioflüssigkeiten in einer kontinuierlichen Weise mit minimalen Schritten ermöglicht.

Einstufige Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großvolumigen Proben mit einem gegabelten mikrofluidischen A4F-Gerät

Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Sortierung extrazellulärer Vesikel (EVs), die von mesenchymalen Stromazellen freigesetzt werden. Dabei geht es insbesondere um die Geräteeinstellung und die Optimierung der Sortierbedingungen. Ziel ist es, extrazelluläre Vesikel zu sortieren und dabei ihre Eigenschaften zu erhalten.

Festlegen einer erfolgreichen Sortierung für die Isolierung extrazellulärer Vesikel

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskeln und Knochenmark mittels enzymatischer Verdauung und Größenausschlusschromatographie, wodurch reproproduzierbare Rückgewinnung von vesikelangereicherten Fraktionen aus strukturell komplexen, leistungsarmen Geweben für die nachgelagerte molekulare Analyse ermöglicht wird.

Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskulatur und Knochenmark mittels Größenausschlusschromatographie

Lernen Sie die Größenausschlusschromatographie zur effizienten Isolierung extrazellulärer Vesikel aus konditionierten Zellkulturmedien. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Vesikelinhalt und die Untersuchung zellulärer Kommunikationsmechanismen.

Größenausschlusschromatographie zur Trennung extrazellulärer Vesikel aus konditionierten Zellkulturmedien

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