Name: Konstruktion homozygoter Mutanten der Wanderheuschrecke mittels CRISPR/Cas9-Technologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Lernen Sie die CRISPR/Cas9-Konstruktion homozygoter Mutanten bei Locusta migratoria mit Kryokonservierung von Embryonen. Diese Methode ermöglicht effiziente Genomeditierung und Langzeitlagerung genetischer Materialien für die Schädlingsbekämpfung.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (32070502, 31601697, 32072419 und der China Postdoctoral Science Foundation (2020M672205) unterstützt.

1. Auswahl der Zielstelle und sgRNA-Design
<ol><li>Sammeln Sie so viele Sequenzinformationen wie möglich für das interessierende Gen durch Literaturrecherche und/oder Suche nach der mRNA oder kodierenden DNA-Sequenz (CDS) des Gens bei NCBI und Heuschreckendatenbank24.</li>
	<li>Vergleichen Sie die Sequenz des interessierenden Gens mit seiner genomischen DNA-Sequenz, um die Exon- und Intron-Regionen zu unterscheiden.</li>
	<li>Wählen Sie eine Kandidatenregion für die Gestaltung der Zielwebsite basierend auf dem Forschungszweck aus. Entwerfen Sie Primerpaare, um das Fragment der Kandidatenregion zu amplifizieren und seine Wildtyp-Sequenz durch Sequenzierungsanalyse des PCR-Produkts zu verifizieren. HINWEIS: Es gibt verschiedene Strategien für die Auswahl der Kandidatenzielregion. Zum Beispiel wird in den meisten Gen-/Proteinfunktionsforschungen das Exon-Fragment in der Nähe seines Startcodons als Kandidatenregion verwendet, um sicherzustellen, dass die gesamte Protein-/RNA-Funktion nach der Genom-Editierung (d. h. Gen-Knock-out) verloren geht. Wählen Sie für die Funktionsanalyse einer bestimmten Domäne die Kandidatenregion am Anfang (oder an beiden Enden) der Domäne aus.</li>
	<li>Nutzen Sie Online-Ressourcen wie das E-CRISP Design25 , um nach potenziellen Zielstandorten in der potenziellen Zielregion zu suchen.<ol><li>Wählen Sie "Drosophila melanogaster BDGP6" (oder ein anderes Insekt) in der Dropdown-Liste der Referenzgenome aus und wählen Sie "Eingabe ist FASTA-Sequenz" und fügen Sie anschließend die Sequenz der Zielregion in das Textfeld ein (im FASTA-Format).</li>
		<li>Starten Sie die Anwendung, indem Sie auf "sgRNA-Suche starten" mit "medium" und "single design" klicken, um die möglichen Zielstellen zu erhalten. Wählen Sie 1-3 potenzielle Ziele aus den Ergebnissen basierend auf ihren prognostizierten Werten aus und entwerfen Sie die entsprechenden sgRNAs entsprechend. HINWEIS: Es gibt viele weitere Online-Plattformen für CRISPR-Design, wie z. B. CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT usw. (siehe Materialtabelle). Einige von ihnen haben die Funktion der Spezifitätsprüfung für die Arten, deren genomische Sequenzdaten in ihren Datenbanken enthalten sind. Die genomische Sequenz der Heuschrecken wurde jedoch auf keiner Online-Website gefunden. Es ist besser, mehr als ein Online-Tool für das CRISPR-Design bei Heuschrecken zu verwenden. Betrachten Sie umfassend die Ergebnisse von verschiedenen Websites und wählen Sie die sgRNA aus den Ergebnissen nach dem Prinzip der höchsten Spezifität, der höchsten Effizienz und der geringsten Mismatch-Rate aus (Abbildung 1A,B).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Synthese und Verifizierung der sgRNA in vitro
<ol><li>Synthetisieren Sie die sgRNA mit sgRNA-Synthesekits gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers (Materialtabelle). Dieses Verfahren umfasst in der Regel drei Schritte: DNA-Template-Amplifikation, In-vitro-Transkription und sgRNA-Aufreinigung21. Verdünnen Sie die synthetisierte sgRNA mit nukleasefreiem Wasser auf eine Speicherkonzentration von 300 ng/μL für die weitere Verwendung.</li>
	<li>Amplifizieren und reinigen Sie das Zielgenfragment, um es als Substrat für den In-vitro-Spaltungsassay des CRISPR/Cas9-Systems zu verwenden. Führen Sie diese Schritte gemäß den Anweisungen des Herstellers aus.</li>
	<li>Verdünnen Sie das gekaufte Cas9-Protein mit nukleasefreiem Wasser auf 300 ng/μl. Inkubieren Sie 1 μl sgRNA (300 ng/μl) und 1 μl Cas9-Protein (300 ng/μl) mit 200 ng gereinigtem Zielfragment im Spaltpuffer bei 37 °C für 1 h (10 μl Gesamtvolumen; siehe Tabelle 1). Abschätzung der Effizienz der sgRNA-induzierten Cas9-Spaltung durch Agarose-Gelelektrophorese (Abbildung 1C). Wählen Sie die sgRNAs mit hoher Aktivität für die folgende Mikroinjektion aus. HINWEIS: Die Ergebnisse der Agarose-Gelelektrophorese können mit Bildverarbeitungssoftware in Graustufenbilder umgewandelt werden, und die Spalteffizienz wird anhand der Graustufen der Banden spekulierter Größen geschätzt.</li>
</ol>3. Mikroinjektion und Kultivierung der Eizellen
<ol><li>Bereiten Sie die Injektionsnadeln vor, indem Sie Glaskapillaren mit einem Mikropipettenabzieher ziehen (Materialtabelle). Stellen Sie die Parameter wie folgt ein: Heat auf 588, Pull auf 90, Velocity auf 60 und Time auf 40. Schleifen Sie die Spitze der Injektionsnadel mit einem Mikroschleifer (Materialtabelle). HINWEIS: Ideale Nadelspitzen sind offen und scharfkantig (Abbildung 2A). Es wird dringend empfohlen, zusätzliche Nadeln für die Experimente vorzubereiten, da die Nadeln bei Injektionen manchmal blockiert oder versehentlich gebrochen werden.</li>
	<li>Mischen Sie 1 μl Cas9-Protein (300 ng/μl) mit 1 μl der verifizierten sgRNA (300 ng/μl) zusammen, um die RNPs für die Injektion zu erhalten. Fügen Sie 8 μl RNase-freies steriles Wasser hinzu, um das endgültige Volumen der Mischung auf 10 μl zu erhöhen. Mischen Sie die Lösung gründlich und bewahren Sie sie auf Eis auf. HINWEIS: Die endgültigen Konzentrationen des Cas9-Proteins und der sgRNAs können entsprechend den Editierergebnissen optimiert werden. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen der vorbereiteten RNP-Lösung und es wird empfohlen, sie sofort zu verwenden.</li>
	<li>Ziehen Sie die männlichen und weiblichen adulten Heuschrecken zusammen bei 30 °C mit einer Photoperiode von 16 (hell):8 (dunkel) auf und versorgen Sie sie mit ausreichend frischen Weizensämlingen als Nahrung. Beobachten Sie diese Heuschrecken täglich und stellen Sie einen Eiablagetopf (einen Blumentopf oder Becher aus Plastik, der mit nassem, sterilem Sand gefüllt ist) in den Aufzuchtkäfig zur Eiablage, sobald sich die Heuschrecken gepaart haben. HINWEIS: Normalerweise reichen 100 Paare erwachsener Heuschrecken, die in einem Aufzuchtkäfig (40 cm x 40 cm x 40 cm) aufgezogen werden, aus, um Eier zu erzeugen, um ein einzelnes Gen auszuschalten. Züchten Sie zusätzliche Heuschreckenpaare, wenn mehr Eier benötigt werden.</li>
	<li>Sammeln Sie die frisch gelegten Eierschoten aus dem Eiablagetopf und warten Sie ca. 30 Minuten, bis die Eier gegerbt sind. Isolieren Sie die Eier vorsichtig mit einer feinen Bürste in Wasser und waschen Sie sie dreimal mit sterilem Wasser. Bewahren Sie die Eier in einer Petrischale auf und fügen Sie steriles Wasser hinzu, um sie feucht zu halten. HINWEIS: Die Gerbung der neu gelegten Eier kann die Mutanteneffizienz erheblich verbessern21.</li>
	<li>Füllen Sie eine Injektionsnadel mit der vorbereiteten RNP-Lösung und laden Sie sie in den Mikromanipulator (Materialtabelle).<ol><li>Stellen Sie die Mikroinjektionsparameter wie folgt ein: 300 hPa des Einspritzdrucks (pi), 0,5 s der Einspritzzeit (ti) und 25 hPa des Ausgleichsdrucks (pc).</li>
		<li>Drücken Sie das Pedal, um das Volumen der injizierten Lösung zu bewerten. Stellen Sie den Einspritzdruck und die Einspritzzeit so ein, dass das Einspritzvolumen etwa 50-100 nL beträgt. Anmerkungen: Lassen Sie die Restluft in der Nadel ab, um die Injektionslösung so kontinuierlich und kontrollierbar wie möglich zu machen. Die Verbindung zwischen der Nadel und dem Mikromanipulator muss dicht sein.</li>
	</ol></li>
	<li>Ordnen Sie die sterilen Eizellen regelmäßig auf dem Injektionskissen an (Abbildung 2B, C) und legen Sie das Pad auf den Objekttisch des Mikroskops (Abbildung 3A). Stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops ein, bis die Eier zu sehen sind. Stellen Sie die Mikroinjektionsnadel unter dem Mikroskop ein, bis die Injektionsspitze zu sehen ist, und positionieren Sie sie in der Nähe der zu injizierenden Eizelle.</li>
	<li>Beginnen Sie die Injektion in einer geeigneten Höhe und einem Winkel von 30-45 Grad. Führen Sie die Spitze vorsichtig in der Nähe der Mikropylen des Eies in das Ei ein (Abbildung 3B) und drücken Sie das Pedal, um die Injektion durchzuführen. Ziehen Sie die Nadel schnell zurück und bewegen Sie das Injektionskissen für die Injektion der nächsten Eizelle. HINWEIS: Eine leichte Ausdehnung der Eizelle während der Mikroinjektion sollte beobachtet werden. Eine geringe zytoplasmatische Leckage an der Lochblende ist akzeptabel. Ersetzen Sie die Injektionsnadel durch eine neue oder passen Sie den Injektionswinkel an, wenn der Flüssigkeitsausfluss zu groß ist.</li>
	<li>Übertragen Sie die injizierten Eier in eine Kulturschale (eine Petrischale mit einem Stück feuchtem Filterpapier) und legen Sie sie in einen Inkubator bei 30 °C. ANMERKUNG: Es dauert etwa 13-14 Tage, bis aus diesen injizierten Eiern Nymphen schlüpfen (unter der Voraussetzung, dass die Mutation des Zielgens die Entwicklung der Embryonen nicht beeinträchtigt) (Abbildung 3C). Injizieren Sie mindestens 100 Eier, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Schlupf- und Eklosionsmenge vorhanden ist, um ein bestimmtes Gen auszuschalten.</li>
</ol>4. Schätzung der Mutationsrate und das Screening von Mutanten
<ol><li>Überprüfen Sie die Entwicklung der injizierten Eizellen jeden Tag nach der Injektion. Übertragen Sie die injizierten Eizellen in den ersten 5 Tagen alle 24 Stunden in eine neue Kulturschale.</li>
	<li>Am 6. Tag (oder später) nach der Injektion 10 Eizellen nach dem Zufallsprinzip in ein Röhrchen geben und die Eizellen mit zwei Stahlkugeln bei 60 Hz 6 Minuten lang mit einem Mahlwerk ausreichend zerkleinern (siehe Materialtabelle). Resuspendieren Sie den Schmutz mit 1 ml PBS. 5 μl des Gemisches in 45 μl 50 mM NaOH überführen und 5 min bei 95 °C lysieren. Geben Sie 5 μL 1 M Tris-HCl (pH=8,0) in das Lysesystem, um die alkalische Lysereaktion zu beenden. HINWEIS: Eizellen können an jedem Tag nach dem letzten Transfer für die alkalische Lyse entnommen werden, und je nach Entwicklungssituation können mehrere Eizellen als eine Probe verwendet werden (z. B. können fünf 6 Tage alte Embryonen als eine Probe und zwei 10 Tage alte Embryonen als eine Probe verwendet werden). Manchmal ist es nicht möglich, die genomische DNA von Eiern mit der alkalischen Lysemethode zu gewinnen. Kommerzielle genomische DNA-Extraktionskits können als alternative Methode zur Isolierung der genomischen DNA aus den Eiern verwendet werden.</li>
	<li>Nehmen Sie 1 μl des Lyseprodukts als PCR-Template, um das Zielgenfragment zu amplifizieren (Tabelle 2 und Tabelle 3) und senden Sie die PCR-Produkte zur Sequenzierung. Vergleichen Sie die Sequenzierungsergebnisse mit der Wildtyp-Sequenz, um vorläufig zu beurteilen, ob das CRISPR/Cas9-System das Zielgen in vivo gespalten hat (Abbildung 4A). Lassen Sie den Rest der Eizellen für die spätere Entwicklung bereiten, vorausgesetzt, dass Indels im Embryonalstadium nachgewiesen werden. HINWEIS: Auf diese Weise kann die Mutationsrate im Embryonalstadium vorläufig abgeschätzt werden. Wenn in diesem Schritt keine Indels gefunden werden, stellen Sie einige neue sgRNAs für das Zielgen her und wiederholen Sie das Knock-out-Protokoll aus Schritt 2.1.</li>
	<li>Setzen Sie die geschlüpften Nymphen in einen Aufzuchtkäfig um und kultivieren Sie sie wie in Schritt 3.3 beschrieben. Wenn sich die Nymphen bis zum fünften Stadium entwickelt haben, trennen Sie sie mit Plastikkulturbechern (1 Nymphe/Becher). HINWEIS: Normalerweise dauert es etwa 25-35 Tage, bis sich die Nymphen zu ihrem fünften Stadium entwickelt haben, und der offensichtlichste Phänotyp ist, dass sich die Flügelknospen bis zum vierten oder fünften Bauchsegment erstrecken. Darüber hinaus wird empfohlen, die Phänotypen toter Nymphen aufzuzeichnen, um die Beziehung zwischen dem Zielgen und den Phänotypen in der weiteren Forschung vorherzusagen.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer Präparierschere ca. 2 mm Länge der Fühler ab und lysieren Sie sie mit der alkalischen Lysemethode (Schritt 4.2). Analysieren Sie die Zielgenfragmentsequenz dieser Nymphen wie oben beschrieben (Schritt 4.3), um dieG0-Mutanten zu identifizieren (Abbildung 4B). HINWEIS: Der Antennenschnitt für die Lyse kann etwas länger sein und das Schleifen oder Zerkleinern der Antennen ist für die Lyse hilfreich, obwohl die Antennen direkt verdaut werden können. Individuen mit mehreren Peaks in der Nähe des Zielortes im Sequenzierungsergebnis werden als positive Mutanten identifiziert und können sich anschließend entwickeln und paaren.</li>
</ol>5. Etablierung und Weitergabe von Mutantenlinien
<ol><li>Kreuzung mitG0-Mutanten und Wildtyp-Heuschrecken (Abbildung 4B). Sammeln Sie die Oozysten und inkubieren Sie diese Oozysten separat bei 30 °C. Verwenden Sie 3-6 entwickelte Eizellen in jeder Oozyste, um Mutationen zu erkennen, wie in den Schritten 4.2 und 4.3 beschrieben. Bewahren Sie mutationspositive Oozysten für die spätere Entwicklung auf und geben Sie die mutationsnegativen Oozysten auf. HINWEIS: Die Schätzung der Mutationsrate im Embryonalstadium kann das Screening vonG1-Mutanten erheblich beschleunigen. In der Regel können 3-6 entwickelte Eizellen wie oben beschrieben als eine Probe für die PCR-vermittelte Genotypisierung gemischt werden.</li>
	<li>Ziehen Sie die G1 Nymphen wie in Schritt 4.4 beschrieben auf. Schneiden Sie etwa 2 mm Länge der Antennen ab, um eine PCR-basierte Genotypisierung durchzuführen, wie in Schritt 4.5 zum Nachweis von G1-Heterozygoten beschrieben. Führen Sie die TA-Klonierung gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle) durch, um ihre Mutationen zu identifizieren. Führen Sie eine Kreuzung mit G1-Heterozygoten mit den gleichen Mutationen durch, umG2-Nymphen zu erhalten. HINWEIS: Die Sanger-Sequenzierung der PCR-Produkte kann nur Informationen liefern, um die Heterozygoten herauszufinden, aber nicht genügend Informationen, um die genauen Mutationen zu identifizieren. Daher ist eine TA-Klonierung mit den PCR-Produkten erforderlich, um die Mutationen eindeutig zu identifizieren und kann die Etablierung stabiler Mutantenlinien fördern.</li>
	<li>Ziehen Sie die G2 Nymphen bis zu ihrem fünften Stadium auf. Verwenden Sie die in Schritt 5.2 beschriebene PCR-basierte Genotypisierung, um die Homozygoten und/oder Heterozygoten zu identifizieren, die für weitere Forschung und eine stabile Passage geeignet sind (Abbildung 4B). HINWEIS: Achten Sie darauf, eine Vermischung von Homozygoten und Heterozygoten zu vermeiden. Es wird empfohlen, in jeder Generation eine PCR-basierte Genotypisierung durchzuführen, um die Homozygotie und/oder Heterozygotie jeder Population zu bestätigen. Die Anzahl der Heuschrecken, die für diese Kontrolle verwendet werden, hängt von der Populationsgröße ab. Darüber hinaus kann die Population der Heuschrecken durch die In-Cross-Strategie erweitert werden.</li>
</ol>6. Kryokonservierung und Wiederbelebung von Eizellen
<ol><li>Waschen Sie die zu konservierenden Eier mit sterilem Wasser und inkubieren Sie sie wie oben beschrieben (Schritt 3.8) in einer Kulturschale für 5-6 Tage. Sammeln Sie diese Eier in der Kulturschale und bedecken Sie sie mit Filterpapierfragmenten. Wickeln Sie die gesamte Kulturschale mit einer Paraffinfolie ein.</li>
	<li>Bewahren Sie das Gericht 2 Tage lang bei 25 °C auf, gefolgt von weiteren 2 Tagen bei einer relativ niedrigeren Temperatur (13-16 °C). Dann die Schüssel in einen 6 °C kalten Kühlschrank stellen. Fügen Sie alle 2 Wochen Wasser hinzu, um eine feuchte Umgebung für die Eier zu schaffen (Abbildung 5A). ANMERKUNG: Es wird spekuliert, dass sich die Embryonen im Katatrepsis-Stadium befinden, nachdem sie 5-6 Tage lang bei 30 °C entwickelt wurden26. Die Gradientenkühlung ist hilfreich für die Kryokonservierung von Eizellen (Tabelle 5).</li>
	<li>Um die kryokonservierten Eier wiederzubeleben, nehmen Sie die Petrischale aus dem Kühlschrank und bewahren Sie sie 2 Tage lang bei 25 °C auf. Legen Sie diese Eier in einen 30 °C heißen Inkubator, bis die Nymphen schlüpfen (Abbildung 5B). HINWEIS: Es ist notwendig, die kryokonservierten Eier bei 25 °C zu lagern, bevor sie in einen 30 °C-Inkubator überführt werden. Die Embryonen können mindestens fünf Monate lang kryokonserviert werden, obwohl die Schlupfrate und die Eklosionsrate aufgrund der Kryokonservierung abnehmen können (Tabelle 5).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Heuschrecken gehören seit der Zivilisation der Menschheit zu den verheerendsten Schädlingen in der Landwirtschaft23. Die CRISPR/Cas9-basierte Genom-Editing-Technologie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die biologischen Mechanismen von Heuschrecken besser zu verstehen und eine vielversprechende Schädlingsbekämpfungsstrategie zu entwickeln. Daher ist es von großem Nutzen, eine effiziente und einfach anzuwendende Methode zur CRISPR/Cas9-vermittelten Konstruktion homozygoter Heuschreckenmutanten z...

Gen-Editing-Technologien könnten verwendet werden, um Insertionen oder Deletionen in einen bestimmten Genomlocus einzuführen, um das Zielgen absichtlich künstlich zu modifizieren1. In den letzten Jahren hat sich die CRISPR/Cas9-Technologie rasant weiterentwickelt und hat ein wachsendes Anwendungsspektrum in verschiedenen Bereichen der Lebenswissenschaften 2,3,4,5,6. Das CRISPR/Cas9-System wurde bereits 1987 entdeckt 7 und ist in Bakterien und Archaeen weit verbreitet. Weitere Untersuchungen deuteten darauf hin, dass es sich um ein prokaryotisches adaptives Immunsystem handelt, das auf die RNA-gesteuerte Nuklease Cas9 angewiesen ist, um Phagen zu bekämpfen8. Das künstlich modifizierte CRISPR/Cas9-System besteht im Wesentlichen aus zwei Komponenten, einer einzelnen Leit-RNA (sgRNA) und dem Cas9-Protein. Die sgRNA besteht aus einer zur Zielsequenz komplementären CRISPR-RNA (crRNA) und einer relativ konservierten trans-aktivierenden crRNA (tracrRNA). Wenn das CRISPR/Cas9-System aktiviert wird, bildet die sgRNA mit dem Cas9-Protein ein Ribonukleoprotein (RNP) und leitet Cas9 über die Basenpaarung von RNA-DNA-Interaktionen an seinen Zielort. Dann kann die doppelsträngige DNA durch das Cas9-Protein gespalten werden und als Ergebnis entsteht der Doppelstrangbruch (DSB) in der Nähe des Protospacer-Nachbarmotivs (PAM) der Zielstelle 9,10,11,12. Um die durch die DSBs verursachten Schäden zu mindern, würden Zellen umfassende DNA-Schadensantworten aktivieren, um die genomischen Schäden effizient zu erkennen und den Reparaturprozess einzuleiten. Es gibt zwei unterschiedliche Reparaturmechanismen in der Zelle: die nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und die homologiegesteuerte Reparatur (HDR). NHEJ ist der häufigste Reparaturweg, der DNA-Doppelstrangbrüche schnell reparieren kann und Zellapoptose verhindert. Es ist jedoch fehleranfällig, da kleine Fragmente von Insertionen und Deletionen (Indels) in der Nähe der DSBs verbleiben, was in der Regel zu einer Verschiebung des offenen Leserasters führt und somit zu einem Gen-Knock-out führen kann. Im Gegensatz dazu ist eine homologiste Reparatur ein recht seltenes Ereignis. Unter der Voraussetzung, dass es eine Reparaturschablone mit Sequenzen gibt, die homolog zum Kontext der DSB sind, würden Zellen gelegentlich den genomischen Bruch gemäß der nahe gelegenen Schablone reparieren. Das Ergebnis von HDR ist, dass die DSB präzise repariert wird. Insbesondere, wenn es eine zusätzliche Sequenz zwischen den homologen Sequenzen in der Vorlage gibt, würden diese durch HDR in das Genom integriert werden, und auf diese Weise könnten die spezifischen Geninsertionen realisiert werden13.
Mit der Optimierung und Entwicklung der sgRNA-Strukturen und Cas9-Proteinvarianten wurde das CRISPR/Cas9-basierte genetische Editierungssystem auch erfolgreich in der Erforschung von Insekten eingesetzt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella und Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ,19. Nach bestem Wissen der Autoren wurden zwar RNPs, die aus dem Cas9-Protein und in vitro transkribierter sgRNA bestehen, für die Editierung des Heuschreckengenomsverwendet 20,21,22, aber ein systematisches und detailliertes Protokoll für die CRISPR/Cas9-Ribonuklease-vermittelte Konstruktion homozygoter Mutanten der wandernden Heuschrecke fehlt noch.
Die Wanderheuschrecke ist ein wichtiger landwirtschaftlicher Schädling, der weltweit verbreitet ist und eine erhebliche Bedrohung für die Nahrungsmittelproduktion darstellt, da sie besonders für Getreidepflanzen wie Weizen, Mais, Reis und Hirse schädlich ist23. Genfunktionsanalysen, die auf Genom-Editing-Technologien basieren, können neue Angriffspunkte und neue Strategien zur Bekämpfung von Wanderheuschrecken liefern. Diese Studie schlägt eine detaillierte Methode vor, um wandernde Heuschreckengene über das CRISPR/Cas9-System auszuschalten, einschließlich der Auswahl von Zielorten und des Designs von sgRNAs, der In-vitro-Synthese und Verifizierung der sgRNAs, der Mikroinjektion und Kultur von Eizellen, der Abschätzung der Mutationsrate im Embryonalstadium, dem Nachweis von Mutanten sowie der Passage und Konservierung der Mutanten. Dieses Protokoll könnte als basale Referenz für die Manipulation der überwiegenden Mehrheit der Heuschreckengene verwendet werden und kann wertvolle Referenzen für die Genom-Editierung anderer Insekten liefern.

<table><tbody><tr><td>10 mal; NEBuffer r3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7030S</td><td>Der Puffer von &nbsp; in vitro Cas9-Spaltassays</td></tr><tr><td>2xEs Taq MasterMix (Farbstoff)</td><td>Cwbio</td><td>CW0690</td><td>Für die Genamplifikation</td></tr><tr><td>2xPfu MasterMix (Farbstoff)</td><td>Cwbio</td><td>CW0686</td><td>Für die Genamplifikation</td></tr><tr><td>CHOPCHOP</td><td></td><td></td><td>Online-Website zum Entwerfen von sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/.</td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td></td><td></td><td>Online-Website zum Entwerfen von sgRNAs, http://crispor.org.</td></tr><tr><td>CRISPRdirect</td><td></td><td></td><td>Online-Website zum Entwerfen von sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/.</td></tr><tr><td>Elektrophorese-Stromversorgung</td><td>LIUYI BIOLOGY</td><td>DYY-6D</td><td>Trennung von Nukleinsäuremolekülen unterschiedlicher Größe</td></tr><tr><td>Eppendorf Tube</td><td>Eppendorf</td><td>30125177</td><td>Zur Probenentnahme, etc.</td></tr><tr><td>Feine Bürsten</td><td>Annigoni</td><td>1235</td><td>Zum Reinigen und Isolieren von Eiern. Online gekauft.</td></tr><tr><td>Flammender/brauner Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P97</td><td>Zur Herstellung der Mikroinjektionsnadeln</td></tr><tr><td>Gel-Extraktionskit</td><td>Cwbio</td><td>CW2302</td><td>DNA-Rückgewinnung und -Reinigung</td></tr><tr><td>Gel-Imaging-Analysesystem</td><td>OLYMPUS</td><td>Gel Doc XR</td><td>Beobachten Sie die Elektrophorese-Ergebnisse</td></tr><tr><td>GeneTouch Plus</td><td>Bioer</td><td>B-48DA</td><td>Für die Genamplifikation</td></tr><tr><td>Glas Elektroden-Kapillare</td><td>Gairdner</td><td>GD-102</td><td>Für die Herstellung&nbsp; Injektionsnadeln mit&nbsp; a&nbsp; Mikropipette Abzieher</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>MEMMERT</td><td>INplus55</td><td>Für die Kultur von wandernden Heuschreckenembryonen</td></tr><tr><td>Metallbad</td><td>TIANGEN</td><td>AJ-800</td><td>Zum Erhitzen der Probe</td></tr><tr><td>Mikro-Autoinjektor</td><td>Eppendorf</td><td>5253000068</td><td>Mikroinjektion von Embryonen in einem frühen Entwicklungsstadium</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Allsheng</td><td>MTV-1</td><td>Wird zum Mischen von Reagenzien</td></tr><tr><td>verwendet Mikromühle</td><td>NARISHIGE</td><td>EG-401</td><td>Zum Schleifen der Spitze der Injektionsnadel</td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf 5242956003</td><td></td><td>Zum Laden von Lösungen in die Injektionsnadeln.</td></tr><tr><td>Mikromanipulationssystem</td><td>Eppendorf</td><td>TransferMan 4r</td><td>Ein alternatives Manipulationssystem für die Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>cnoptec</td><td>SZ780</td><td>Für die Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Manipulator mit Motorantrieb</td><td>NARISHIGE</td><td>MM-94</td><td>Zur Kontrolle der Position der Mikropipette während des Mikroinjektionsprozesses</td></tr><tr><td>Multi-Sample Tissue Grinder</td><td>Jingxin</td><td>Tissuelyser-64</td><td>Mahlen und homogenisieren Sie die Eier</td></tr><tr><td>Eiablagetopf</td><td>ChangShengYuanYi</td><td>CS-11</td><td>Gefüllt mit nassem sterilem Sand für die Eiablage von Heuschrecken. Aus diesem Behälter werden die Oozysten gesammelt. Online gekauft.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>ParafilmM</td><td>PM996</td><td>Zum Einwickeln der Petrischale.</td></tr><tr><td>pEASY-T3 Klonierungskit</td><td>TransGen Biotech</td><td>CT301-01</td><td>Für die TA-Klonierung</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>NEST</td><td>752001</td><td>Für die Kultivierung und Konservierung von Eizellen.</td></tr><tr><td>Pipettierer</td><td>Eppendorf</td><td>Research plus</td><td>Zum Laden von Proben</td></tr><tr><td>Kulturbecher</td><td></td><td></td><td>aus Kunststoff Für die getrennte Aufzucht von Heuschrecken und jeder Plastikbecher, der groß genug ist (nicht weniger als 1000 ml Volumen), ist geeignet. Online gekauft.</td></tr><tr><td>Präzisions-gRNA-Synthese-Kit</td><td>Thermo</td><td>A29377</td><td>Für die sgRNA-Synthese</td></tr><tr><td>Primer Premier</td><td>PREMIER Biosoft</td><td>Primer Premier 5.00</td><td>Für das Primer-Design</td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>Insightful Science</td><td>SnapGene&reg; 4.2.4</td><td>Zum Analysieren von Sequenzen</td></tr><tr><td>Stahlkugeln</td><td>HuaXinGangQiu</td><td>HXGQ60</td><td>Zum Schleifen von Proben. Online gekauft.</td></tr><tr><td>Tipps</td><td>bioleaf</td><td>D781349</td><td>Zum Laden von Proben</td></tr><tr><td>Trans DNA Marker II</td><td>TransGen Biotech</td><td>BM411-01</td><td>Zur Bestimmung der Gengröße</td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 Protein v2</td><td>Thermo</td><td>A36496</td><td>Cas9 Protein</td></tr><tr><td>UniversalGen DNA Kit</td><td>Cwbio</td><td>CWY004</td><td>Für die genomische DNA-Extraktion</td></tr><tr><td>VANNAS Schere</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72932-01</td><td>Zum Abschneiden der</td></tr><tr><td>Antennen Weizen</td><td></td><td></td><td>Zur Erzeugung von Weizensetzlingen als Nahrung für Heuschrecken. Gekauft von lokalen Bauern.</td></tr><tr><td>ZiFiT</td><td></td><td></td><td>Online-Website zum Entwerfen von sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx.</td></tr></tbody></table>

konstruktion homozygoter mutanten der wanderheuschrecke mittels crispr/cas9-technologie

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

Die Wanderheuschrecke Locusta migratoria ist nicht nur eine der weltweiten Pestheuschrecken, die dem Menschen enorme wirtschaftliche Verluste zugefügt hat, sondern auch ein wichtiges Forschungsmodell für die Metamorphose von Insekten. Das CRISPR/Cas9-System ist in der Lage, einen bestimmten DNA-Locus genau zu lokalisieren und innerhalb des Zielorts zu spalten, wodurch Doppelstrangbrüche effizient eingeführt werden, um einen Knockout des Zielgens zu induzieren oder neue Genfragmente in den spezifischen Locus zu integrieren. Die CRISPR/Cas9-vermittelte Genom-Editierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Beantwortung von Fragen der Heuschreckenforschung sowie eine vielversprechende Technologie zur Heuschreckenbekämpfung. Diese Studie liefert ein systematisches Protokoll für CRISPR/Cas9-vermittelten Gen-Knockout mit dem Komplex aus Cas9-Protein und Single Guide RNAs (sgRNAs) in wandernden Heuschrecken. Die Auswahl der Zielstellen und das Design der sgRNA werden detailliert beschrieben, gefolgt von der in vitro Synthese und Verifizierung der sgRNAs. Zu den nachfolgenden Verfahren gehören die Entnahme von Eierfloßen und die Trennung von gegerbten Eiern, um eine erfolgreiche Mikroinjektion mit niedriger Sterblichkeitsrate zu erreichen, die Eikultur, die vorläufige Abschätzung der Mutationsrate, die Heuschreckenzucht sowie der Nachweis, die Konservierung und die Passage der Mutanten, um die Populationsstabilität der editierten Heuschrecken zu gewährleisten. Diese Methode kann als Referenz für CRISPR/Cas9-basierte Genom-Editing-Anwendungen sowohl bei Wanderheuschrecken als auch bei anderen Insekten verwendet werden.

Dieses Protokoll enthält die detaillierten Schritte zur Erzeugung homozygoter Mutanten der wandernden Heuschrecken mit dem RNP, das aus Cas9-Protein und in vitro synthetisierter sgRNA besteht. Im Folgenden sind einige repräsentative Ergebnisse des CRISPR/Cas9-vermittelten Zielgen-Knockouts in Heuschrecken aufgeführt, einschließlich der Zielauswahl, der sgRNA-Synthese und -Verifizierung (Abbildung 1A), der Eizellentnahme und -injektion, des Mutantenscreenings und der Weiterbildung, d...

Diese Arbeit liefert ein systematisch optimiertes Verfahren zur CRISPR/Cas9-Ribonuklease-basierten Konstruktion homozygoter Heuschreckenmutanten sowie eine detaillierte Methode zur Kryokonservierung und Reanimation der Heuschreckeneier.

Konstruktion homozygoter Mutanten der Wanderheuschrecke mittels CRISPR/Cas9-Technologie

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

Die Wanderheuschrecke ist ein wichtiger landwirtschaftlicher Test. Es handelt sich um eine systematische und detaillierte Methode der CRISPR/CAS9-Konstruktion homozygoter Heuschreckenmutanten, einschließlich der Eizellentnahme, des Mutantenscreenings und der homozygoten Erhaltung. Bereiten Sie zunächst die Injektionsnadeln vor, indem Sie die Glaskapillaren mit einem Mikropipettenzieher ziehen.Stellen Sie die Parameter wie im Textmanuskript beschrieben ein und schleifen Sie dann die Spitze der Injektionsnadel mit einem Mikroschleifer. Bereiten Sie das Ribonukleoprotein für die Injektion vor, indem Sie einen Mikroliter Cas9-Protein mit einem Mikroliter der verifizierten Einzelleit-RNA mischen. Fügen Sie dann acht Mikroliter des kostenlosen sterilen Wassers der RNA hinzu, um das endgültige Volumen der Mischung zu erhalten, 10 Mikroliter.Mischen Sie die Lösung gründlich und legen Sie sie auf Eis. Sammeln Sie als Nächstes die frisch gelegten Eikapseln aus der Eiablagekapsel und warten Sie, bis die Eier gegerbt sind. Isolieren Sie die Eier nach 30 Minuten mit einer feinen Bürste von den Eierschoten in Wasser und waschen Sie die Eier dreimal mit sterilem Wasser.Legen Sie dann die Eier in eine Petrischale und fügen Sie steriles Wasser hinzu, um sie feucht zu halten. Füllen Sie die Injektionsnadel mit der vorbereiteten Ribonukleoproteinlösung und laden Sie die Injektion in den Mikromanipulator. Stellen Sie die Mikroinjektionsparameter auf 300 Hektopascal Einspritzdruck, 0,5 Sekunden Einspritzzeit und 25 Hektopascal Ausgleichsdruck ein.Wenn die Parameter eingestellt sind, drücken Sie das Pedal, um das Volumen der injizierten Lösung zu bewerten. Stellen Sie den Einspritzdruck und die Einspritzzeit so ein, dass das Einspritzvolumen etwa 50 bis 100 Nanoliter beträgt. Nachdem Sie die sterilen Eizellen regelmäßig auf dem Injektionskissen angeordnet haben, legen Sie das Pad auf den Objekttisch des Mikroskops und stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops ein, bis die Eier beobachtet werden.Stellen Sie dann die Mikroinjektionsnadel unter dem Mikroskop ein, bis die Injektionsspitze zu sehen ist, und positionieren Sie die Spitze in der Nähe der zu injizierenden Eizelle. Beginnen Sie die Injektion in einer geeigneten Höhe und einem Winkel von 30 bis 45 Grad. Führen Sie die Spitze in der Nähe der Mikrohaufen des Eies in das Ei ein und drücken Sie das Pedal, um die Injektion durchzuführen.Ziehen Sie dann die Nadel schnell zurück und bewegen Sie das Injektionskissen für die Injektion der nächsten Eizelle. Übertragen Sie die injizierten Eier in eine Kulturschale mit einem Stück feuchtem Filterpapier. Legen Sie sie in einen Inkubator bei 30 Grad Celsius.Kontrollieren Sie nach der Injektion täglich die Entwicklung der injizierten Eizellen. Übertragen Sie die injizierten Eizellen in den ersten fünf Tagen alle 24 Stunden in eine neue Kulturschale. Am sechsten Tag nach der Injektion werden nach dem Zufallsprinzip 10 Eizellen entnommen und in ein Röhrchen übertragen und die Eizellen mit zwei Stahlkugeln bei 60 Hertz sechs Minuten lang mit einer Mühle ausreichend zerkleinert.Nach dem Mahlen resuspendieren Sie den Schmutz in einem Milliliter PBS. Dann werden fünf Mikroliter des resuspendierten Gemisches in 45 Mikroliter 50 millimolare Natronlauge überführt, um fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius zu lysieren. Um die alkalische Lysereaktion zu beenden, werden fünf Mikroliter einer molaren Trishydrochloridlösung in das Lysesystem gegeben.Nehmen Sie einen Mikroliter des Lyseprodukts als PCR-Template, um das Zielgenfragment zu amplifizieren. Vergleichen Sie nach der PCR und Sequenzierung die Sequenzierungsergebnisse mit der Wildtyp-Sequenz, um zu beurteilen, ob das CRISPR/Cas9-System das Zielgen in vivo gespalten hat. Lassen Sie den Rest der Eizellen für die spätere Entwicklung stehen, da Indels im Embryonalstadium nachgewiesen werden.Nach der Entwicklung, dem Transfer und der Kultivierung der geschlüpften Nymphen in einen Aufzuchtkäfig, wie im Manuskript beschrieben. Wenn sich die Nymphen bis zum fünften Stadium entwickeln, trennen Sie sie mit Plastikkulturbechern. Führen Sie eine Kreuzung mit den G0-Mutanten und Wildtyp-Heuschrecken durch.Verwenden Sie nach der Entnahme von Oassists drei bis sechs entwickelte Eizellen in jedem Oassist, um Mutationen wie zuvor beschrieben zu erkennen. Bewahren Sie mutationspositive Oassists für die spätere Entwicklung auf und geben Sie die mutationsnegativen Oassists auf. Für die Kryokonservierung waschen Sie die Eier mit sterilem Wasser und inkubieren Sie sie wie zuvor beschrieben in einer Kulturschale.Nach fünf bis sechs Tagen sammeln Sie die Eier in der Kulturschale und decken sie mit Filterpapierfragmenten ab. Wickeln Sie dann die gesamte Kulturschale mit einer Paraffinfolie ein. Stellen Sie das Gericht zwei Tage lang auf 25 Grad Celsius, gefolgt von weiteren zwei Tagen bei einer niedrigeren Temperatur von 13 bis 16 Grad Celsius.Dann das Gericht in einen Kühlschrank mit sechs Grad Celsius stellen. Geben Sie alle zwei Wochen Wasser in die Schüssel, um eine feuchte Umgebung für die Eier zu schaffen. Um die kryokonservierten Eier wiederzubeleben, stellen Sie die Petrischale schließlich zwei Tage lang auf 25 Grad Celsius.Legen Sie die Eier später in einen 30 Grad Celsius heißen Brutkasten, bis die Nymphen schlüpfen. In dieser Studie befand sich die Zielstelle für das CRISPR/Cas9-System im ersten Exon. Im Cas9-Spaltungsassay konnte das CRISPR/Cas9-Ribonukleoprotein das PCR-Fragment, das die Zielstelle enthielt, mit einer Spaltrate von etwa 55 % verdauen.Die Editiereffizienz führte zu einer Schlupfrate von 52,73 % der Nymphen und 66,67 % der erwachsenen G0-Tiere waren Mosaikmutanten. Die Passagenstrategie der Mutantenlinien wird hier gezeigt. Die überschüssigen homozygoten Eizellen wurden kryokonserviert, um die Verwertungsrate der Homozygoten zu verbessern.Obwohl die Schlupfrate der kryokonservierten Eier mit der Verlängerung der Kryokonservierungszeit verringert wurde, waren die Abhilfemaßnahmen wie das Auftragen von Filterpapierfragmenten und die Gewinnung dieser konservierten Eier mit einem Gradienten steigender Temperatur hilfreich für die Wiederbelebung. Das Wichtigste ist, zu versuchen, die mechanischen Schäden durch die Mikroinjektion zu begrenzen. Dieses Verfahren kann als Referenz für das Erreichen anderer Insekten verwendet werden.Einige Details wie die Methoden der Eizellentnahme, der Injektion und der Ernte sollten geändert werden. Diese Technik kann auch hilfreich sein, um die Metamorphose und die Umweltanpassung der Insekten zu untersuchen, und die Konstruktion homozygoter Heuschreckenmutanten beschleunigte die Forschung auf diesem Gebiet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Gene überlebensnotwendig stellen technische Hürden für die Erstellung von mutierter Linien. Leap Frogging umgeht Letalität durch die Kombination von Genom-Bearbeitung mit Keim Urzelle Transplantation Wildtyp Tiere Keimbahn-Mutationen zu erstellen. Leap Frogging erlaubt auch die effiziente Erzeugung von homozygot null Mutanten in der F-1 -Generation. Hier wird die Transplantation Schritt demonstriert.

Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

Hier präsentieren wir eine Methode, um das Genom von C. Elegans Ingenieur CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins und Homologie abhängigen Reparatur Vorlagen.

Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 wird zunehmend zur Charakterisierung der Genfunktion in Nicht-Modellorganismen eingesetzt. Dieses Protokoll beschreibt, wie Man Knock-out-Linien von Culex pipienserzeugt, von der Vorbereitung von Injektionsmischungen über die Gewinnung und Injektion von Moskitoembryonen bis hin zur Aufzucht, Kreuzung und dem Screening injizierter Moskitos und ihrer Nachkommen auf gewünschte Mutationen.

Vorbereitung und Injektion von Embryonen von Culex-Moskitos zur Erzeugung von Nullmutationen mit CRISPR/Cas9

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht, Mikroinjektion von Eiern und für eine effiziente Paarung des Feuerbres Thermobia domestica zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme nach der Genombearbeitung.

Ei-Mikroinjektion und effiziente Mating für die Genombearbeitung im Firebrat Thermobia domestica

Hier beschreiben wir Methoden für effiziente Puppen- und Erwachseneninjektionen in Nasonia vitripennis als zugängliche Alternativen zur Embryo-Mikroinjektion, die eine funktionelle Analyse von Genen von Interesse entweder mit RNA-Silencing über RNA-Interferenz (RNAi) oder Gen-Knockout durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing ermöglichen.

Puppen- und Erwachseneninjektionen zur RNAi- und CRISPR-Genbearbeitung bei Nasonia vitripennis

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte der gezielten Mutagenese von CRISPR/Cas9 bei Sandfliegen: Embryoentnahme, Injektion, Insektenzucht und -identifikation sowie Auswahl von Mutationen von Interesse.

Sandfliege (Phlebotomus papatasi) Embryo Mikroinjektion für CRISPR/Cas9 Mutagenese

Viele Merkmale der Insekten-Eusozialität beruhen auf der Kommunikation innerhalb der Kolonie und der Arbeitsteilung. Die genetische Manipulation wichtiger regulatorischer Gene in Ameisenembryonen durch Mikroinjektion und CRISPR-vermittelte Mutagenese liefert Einblicke in die Natur altruistischen Verhaltens bei eusozialen Insekten.

Embryo-Injektionen für CRISPR-vermittelte Mutagenese im Ant Harpegnathos saltator

Hier wird ein Protokoll der Helicoverpa armigera (Hübner) Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutantenidentifizierung vorgestellt, das durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing erstellt wurde. Mutierte Insekten ermöglichen die weitere Erforschung der Genfunktion und Interaktion zwischen verschiedenen Genen in vivo.

Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutanten-Identifizierung von CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Hierin werden Protokolle zur Entnahme und Mikroinjektion von präzellulären Maiszikadenembryonen zum Zwecke der Modifikation ihres Genoms durch CRISPR/Cas9-basierte Genom-Editierung oder zur Zugabe markierter transponierbarer Elemente durch Keimbahntransformation vorgestellt.

Mikroinjektion von Maiszikade, Peregrinus maidis, Embryonen für die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung

Dieser Artikel stellt die Schritt-für-Schritt-Protokolle für die CRISPR/Cas9-Mutagenese der orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis vor. Detaillierte Schritte, die von diesem standardisierten Protokoll bereitgestellt werden, werden als nützlicher Leitfaden für die Erzeugung mutierter Fliegen für funktionelle Genstudien in B. dorsalis dienen.

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Lernen Sie die CRISPR/Cas9-Konstruktion homozygoter Mutanten bei Locusta migratoria mit Kryokonservierung von Embryonen. Diese Methode ermöglicht effiziente Genomeditierung und Langzeitlagerung genetischer Materialien für die Schädlingsbekämpfung.

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