Name: Anwendung von RNA-Interferenz im Kiefernnematoden, Bursaphelenchus xylophilus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Lernen Sie eine RNAi-Einweichmethode zur Genfunktionsanalyse beim Kiefernnematoden Bursaphelenchus xylophilus. Diese Technik ermöglicht die effektive Hemmung von Zielgenen und die Beobachtung phänotypischer Veränderungen.

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Diese Forschung wurde von der National Natural Science Foundation of China (31870637, 31200487) finanziert und gemeinsam durch den Zhejiang Key Research Plan (2019C02024, LGN22C160004) finanziert.

Die Studie wurde vom Rat für Tierversuche der Zhejiang Agricultural & Forestry University genehmigt. Das B. xylophilus-Isolat NXY61 wurde ursprünglich aus einem erkrankten Pinus massoniana in der Region Ningbo in der Provinz Zhejiang, Chinaextrahiert 11.
1. Klonen von Genen
HINWEIS: Weitere Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Grundierungen finden Sie in der Materialtabelle .
<ol><li>Sammle Nematoden.<ol><li>Kultur des B. xylophilus-Stammes auf den Myzelien von Botrytis cinerea auf Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA)-Platten bei 25 °C für 3-5 Tage.</li>
		<li>Sammeln Sie die Nematoden mit der Bellman-Trichtermethode14.<ol><li>Legen Sie einen eingespannten Gummischlauch unter einen Trichter und legen Sie zwei Schichten Filterpapier in den Mund des Trichters. Die Pilzkulturen in den Trichter geben und Wasser hinzufügen, um die Pilzmatte einzutauchen. Warten Sie 2 Stunden und sammeln Sie dann die Nematoden.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Extrahieren Sie die gesamte RNA aus den Nematoden mit einem Gesamt-RNA-Extraktionsreagenz (siehe Materialtabelle)11 gemäß den folgenden Schritten.<ol><li>Geben Sie 500 μL Extraktionsreagenz und 100 μL Magnetperlen in ein 2 ml Zentrifugenröhrchen. 20 μL der Nematoden aspirieren und die Probe zum Mahlen bei 9.000 × g für 30 s in ein Mahlwerk geben. 5 min inkubieren und dann 10 min bei 12.000 × g und 4 °C zentrifugieren.</li>
		<li>Den Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen überführen. Fügen Sie 100 μL Chloroform hinzu, verschließen Sie das Röhrchen und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. 3 min inkubieren und dann 10 min bei 12.000 × g bei 4 °C zentrifugieren.</li>
		<li>Den Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen überführen. Fügen Sie 250 μL Isopropylalkohol hinzu und wirbeln Sie kräftig. Zentrifugieren bei 12.000 × g für 10 min.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand. Fügen Sie 500 μL 75% Ethanol hinzu, um die RNA zu waschen und dann die Probe zu wirbeln. Zentrifugieren Sie es für 5 min bei 12.000 × g und 4 °C.</li>
		<li>Trocknen Sie das RNA-Pellet 5 min an der Luft.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 30 μL RNase-freiem Wasser.</li>
		<li>Berechnen Sie die RNA-Konzentration mit der Formel: A260 × Verdünnung × 40 = μg RNA/ml. Berechnen Sie das A260/A280-Verhältnis. HINWEIS: Ein Verhältnis von ~2 gilt als rein.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie eine umgekehrte Transkription von RNA guter Qualität durch, um die cDNA-Vorlage zu erhalten.<ol><li>Entwerfen und verwenden Sie ein Paar spezifischer Primer, ppm-1-F/R (siehe Materialtabelle), um die teilweise kodierende Sequenz des Bx-ppm-1-Gens in B. xylophilus (GenBank-Zugangsnummer QTZ96795) zu amplifizieren. </li>
		<li>Klonen Sie die ppm-1-Gensequenzen in den pGEM-Teasy-Vektor, der den T7-Promotor enthält, nach einem Standard-Klonierungsprotokoll11.<ol><li>Stellen Sie die PCR-Reaktionen wie folgt ein: 2 μL cDNA, 25 μL 2x Ex Taq Polymerase Premix, 2 μL jedes Primers (10 pmol/l) und steriles destilliertes Wasser auf ein Endvolumen von 50 μL.</li>
			<li>Führen Sie den Verstärkungsvorgang wie folgt durch: 5 min bei 94 °C; gefolgt von 35 Zyklen von 30 s bei 94 °C, 30 s bei 55 °C und 1 min bei 72 °C; und eine letzte Verlängerungsstufe bei 72 °C für 5 min.</li>
			<li>Klonen Sie die amplifizierten Produkte in einen pGEM-T Easy Vektor für die Sequenzierung.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Synthese von dsRNA
<ol><li>Bereiten Sie die DNA-Vorlage für die dsRNA-Synthese unter Verwendung der PCR mit Primern vor, die entwickelt wurden, um T7-Promotorstellen an beiden Enden hinzuzufügen. Fügen Sie die T7-Promotorsequenz zum 5'-Ende der Primer hinzu.</li>
	<li>Verwenden Sie das Plasmid, das das ppm-1-Genfragment (894 bp) enthält, als Vorlage für die PCR und gewinnen Sie das Fragment, das den T7-Promotor11 enthält. Verwenden Sie das oben beschriebene PCR-Verfahren und -System.</li>
	<li>Verwenden Sie ein In-vitro-Transkriptionskit , um dsRNA11 zu synthetisieren.<ol><li>Die gefrorenen Reagenzien auf Eis auftauen.</li>
		<li>Geben Sie 2 μL 10x Reaktionspuffer, 2 μL Enzymmischung und 1 μg DNA in ein Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie nukleasefreies Wasser hinzu, um eine Standardreaktion von 4 μL zu erzeugen. Dann mischen Sie gleiche Volumina der vier Ribonukleotidlösungen (ATP, CTP, GTP und UTP) zusammen und geben 8 μL der Mischung in das Röhrchen. Gründlich mischen und 4 h bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>1 μL DNase zugeben, gut mischen und 15 min bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Stoppen Sie die Reaktion und fügen Sie 30 μL nukleasefreies Wasser und 30 μL LiCl-Fällungslösung hinzu, um die RNA auszufällen. Gründlich mischen. Über Nacht bei -20 °C inkubieren.</li>
		<li>15 min bei 12.000 × g und 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml 75% Ethanol hinzu, um die RNA zu waschen. Wirbeln Sie die Probe und zentrifugieren Sie sie für 10 min bei 12.000 × g und 4 °C.</li>
		<li>Trocknen Sie das RNA-Pellet 3 min an der Luft.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 30 μL RNase-freiem Wasser.</li>
		<li>Analysieren Sie die Qualität der dsRNA mit einem Spektralphotometer. Pipettieren Sie 1 μL der dsRNA-Probe auf den Messsockel und stellen Sie die Wellenlänge auf 340 nm ein. Visualisieren Sie die Produkte auf einem 1,0% igen Agarose-Gel.</li>
	</ol></li>
</ol>3. RNAi durch Einweichen
<ol><li>Mischen Sie 4 μL 5x Einweichpuffer (0,05% Gelatine, 5,5 mM KH 2 PO 4, 2,1 mM NaCl, 4,7 mM NH4 Cl, 3 mM Spermidin) mit der dsRNA und ddH2O, um ein Gesamtvolumen von 20 μL undeine endgültige RNA-Konzentration von 0,8 μg / ml zu erhalten.</li>
	<li>Erwerben Sie J2-Larven.<ol><li>Sammeln Sie die Nematoden aus den Pilzkulturen und geben Sie sie in eine Glas-Petrischale von 6 cm Durchmesser. Fügen Sie der Schale 10 ml Wasser hinzu, damit die Nematoden frei schwimmen können. Halten Sie die Nematoden 30 Minuten in der Schale und warten Sie, bis die Eier am Boden haften.</li>
		<li>Entfernen Sie das Wasser und die Nematoden vorsichtig und achten Sie darauf, die Eier nicht zu stören. Wiederholen Sie die Schritte, bis alle Larven und Erwachsenen entfernt sind und nur die Eier in der Schale bleiben.</li>
		<li>Die gesammelten Eier 24 h im Dunkeln bei 25 °C ausbrüten, um J2-Larven zu erhalten. Sammeln Sie die J2-Larven, legen Sie sie in ein Röhrchen und waschen Sie sie dreimal mitddH2Ofür das RNAi-Experiment15.</li>
		<li>Die J2-Larven werden in das 2-ml-Röhrchen mit der dsRNA-Lösung überführt und Resorcinlösung (in Alufolie eingewickelt und in Wasser gelöst) hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 1,0% zu erhalten. Die Larven mit Zentrifugation bei 15 × g auf einem Schütteltisch für 24 h bei 25 °C inkubieren, um sicherzustellen, dass die Larven die dsRNA effektiv aufnehmen.</li>
		<li>Weichen Sie die gleiche Menge Nematoden im Einweichpuffer ohne die dsRNA-Sonde oder mit einer GFP-dsRNA-Sonde als Kontrolle ein. Verwenden Sie das GFP-Gen (gfp, M62653.1) als nicht-endogene Kontrolle und synthetisieren Sie die dsRNA von gfp mit genspezifischen Primern T7-GFP-F/R.</li>
	</ol></li>
</ol>4. qPCR-Nachweis
<ol><li>Reinigen Sie die J2-Larven mitddH2O, einschließlich derjenigen mit Zielgeninterferenz, GFP-Geninterferenz und der ungestörten Kontrollgruppe. Extrahieren Sie die gesamten RNAs aus jeder Gruppe mit der oben beschriebenen Methode.</li>
	<li>Starten Sie die qPCR.<ol><li>Entwerfen Sie die q-ppm-1-F/R-Primer mit der gewünschten Software (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Die qPCR-Reaktion wird in 12 μL mit 1 μL cDNA, 6 μL fluoreszierender Vormischung, 0,4 μL jedes Primers (10 pmol/l) und sterilem destilliertem Wasser eingerichtet.</li>
		<li>Führen Sie die qPCR wie folgt durch: 2 min bei 95 °C; gefolgt von 40 Zyklen von 10 s bei 95 °C, 30 s bei 55 °C und 1 min bei 72 °C.</li>
		<li>Verwenden Sie das actb-Gen (GenBank-Zugangsnummer EU100952) und das tbb-2-Gen (GenBank-Zugangsnummer MT769316) oder andere Gene als interne Referenzgene, um die Veränderungen des Genexpressionsniveaus nach RNAi15 zu bewerten.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwenden Sie entsprechend dem Zyklusschwellenwert (Ct) und der Auflösungskurve die 2-ΔΔCt-Methode , um das relative Expressionsniveau des Zielgens abzuschätzen und die Interferenzeffizienz zu überprüfen.<ol><li>Subtrahieren Sie den Ct-Wert des internen Referenzgens jeder Probe vom Ct-Wert des Zielgens, um den ΔCt-Wert zu erhalten. Subtrahieren Sie dann den ΔCt-Wert der Interferenzgruppe vom ΔCt-Wert der Kontrollgruppe, um den ΔΔCt-Wert zu erhalten. HINWEIS: Ein ΔΔCt-Wert größer als 0 zeigt an, dass die Störung wirksam ist.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Bewerten Sie die Körperlänge von Nematoden, die RNAi folgen
<ol><li>Nach RNAi kultivieren Sie die J2-Larven bis ins Erwachsenenalter auf B. cinerea-Rasenflächen in PDA-Platten für 60 h bei 25 °C15.</li>
	<li>Sammeln Sie die Erwachsenen mit der Bellman-Trichtermethode (siehe Schritt 1.1.2.1)14.</li>
	<li>Nehmen Sie Bilder der erwachsenen Nematoden unter einem Mikroskop auf und verwenden Sie die ImageJ-Software (oder eine andere Messsoftware), um die Körperlängen zu messen.<ol><li>Messen Sie die Länge mit ImageJ, indem Sie Analyze | Legen Sie die Skalierung fest. Wenn der Abstand bekannt ist, geben Sie den Längenwert der gezeichneten geraden Linie ein. Geben Sie die Längeneinheit ein.</li>
		<li>Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Global (verwenden Sie diesen Standard für alle Bilder), und klicken Sie auf OK , um die zu messende Länge mit einer geraden Linie auf dem zu messenden Bild auszuwählen.</li>
		<li>Verwenden Sie den Befehl Strg+M (Messung), um die Ergebnisse anzuzeigen und im Ergebnisfenster festzuhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Nehmen Sie Messungen von 50 männlichen und 50 weiblichen Nematoden für statistische Analysenvor 12.</li>
	<li>Analysieren Sie die Daten, indem Sie den Mittelwert und die Standardabweichung für jede Stichprobe berechnen. Vergleichen Sie die Mittelwerte der Stichproben aus den verschiedenen Gruppen mit dem t-Test des Schülers.</li>
</ol>

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<li>Dulovic, A., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+knockdown+of+daf-12+in+the+model+parasitic+nematode+Strongyloides+ratti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti.</a> PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705(2019).</li>
<li>Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+of+gene+editing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Research%22%5BJournal%5D)">Research progress of gene editing technology.</a> Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).</li>
<li>Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-generated+double+stranded+RNA+induces+RNAi+in+plant-parasitic+nematodes+and+protects+the+host+from+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).</li>
<li>Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+insect-resistant+plants%3A+RNAi-mediated+crop+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection.</a> Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).</li>
</ol>

Interessenkonflikte wurden nicht erklärt.

Obwohl sich die Lebensgeschichte und die parasitäre Umgebung von B. xylophilus von denen anderer Nematoden unterscheiden, gibt es nur begrenzte Forschung über die molekulare Pathogenese dieses Pflanzenpathogens. Trotz großer Fortschritte bei der Anwendung der CRISPR/Cas9-Genom-Editing-Technologie bei C. elegans und anderen Nematoden wurde bisher nur die RNAi-Technologie veröffentlicht, die auf B. xylophilus angewendet wurde17. RNAi ist eines der leistungsfähigsten verfüg...

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Erratum: Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Pflanzenparasitäre Nematoden (PPNs) sind eine anhaltende Bedrohung für die Ernährungssicherheit und die Waldökosysteme. Sie verursachen jedes Jahr schätzungsweise 100 Milliarden USD an wirtschaftlichen Verlusten1, von denen die problematischsten vor allem Wurzelknotennematoden, Zystennematoden und Kiefernnematoden sind. Der Kiefernfadenwurm, Bursaphelenchus xylophilus, ist ein wandernder, endoparasitischer Fadenwurm, der der ursächliche Erreger der Kiefernwelkeist 2. Es hat den Kiefernwäldern weltweit großen Schaden zugefügt3. Nach der Terminologie von Van Megen et al.4 ist B. xylophilus ein Mitglied der Parasitaphelenchidae und gehört zur Klade 10, während die meisten anderen wichtigen Pflanzenparasiten zur Klade 12 gehören.
Als eigenständiger und neu entwickelter Pflanzenparasit ist B. xylophilus ein attraktives Modell für vergleichende Studien. Bis heute gibt es umfangreiche Forschungen über Wurzelknotennematoden und Zystennematoden der Klade 12, die obligate, sitzende Endoparasiten sind und zu den am intensivsten untersuchten Nematoden gehören. Die weitere Forschung auf diesem wichtigen Gebiet ist jedoch mit einer großen Herausforderung verbunden: Die Funktion von Parasitengenen ist ein Forschungsengpass. Funktionelle Studien umfassen im Allgemeinen ektopische Expressions- und Knockdown- / Out-Experimente, stützen sich jedoch auf effektive genetische Transformationsprotokolle für den Nematoden. Infolgedessen beruht die umgekehrte Genetik in PPNs fast ausschließlich auf Gen-Silencing durch RNAi.
RNAi, ein Mechanismus, der in eukaryotischen Zellen weit verbreitet ist, bringt die Genexpression zum Schweigen, indem er doppelsträngige RNA (dsRNA) einführt5. Bis heute wurde der durch dsRNA induzierte posttranskriptionelle Gen-Silencing-Mechanismus in allen untersuchten Eukaryoten gefunden, und die RNAi-Technologie als Werkzeug der funktionellen Genomforschung und anderer Anwendungen hat sich in vielen Organismen schnell entwickelt. Seit der Entdeckung der RNAi-Maschinerie in Caenorhabditis elegans im Jahr 19986 haben sich RNAi-Techniken zu wirksamen Methoden zur Identifizierung der Genfunktion von Nematoden entwickelt und werden als neuer Weg zur wirksamen Kontrolle pathogener Nematoden vorgeschlagen7.
RNAi ist technisch das Einweichen der Jungtiere in dsRNA kann ausreichen; Die Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit dieses Ansatzes variiert jedoch stark mit der Nematodenspezies und dem Zielgen8. Die Stummschaltung von 20 Genen, die an den RNAi-Signalwegen des Wurzelknotennematoden, Meloidogyne incognita, beteiligt sind, wurde unter Verwendung langer dsRNAs als Auslöser untersucht, was zu verschiedenen Reaktionen führte, einschließlich einer Zunahme und keiner Veränderung der Expression einiger Gene9. Diese Ergebnisse zeigen, dass Zielgene unterschiedlich auf RNAi-Knockdown reagieren können, was eine umfassende Bewertung ihrer Eignung als Ziele für die Nematodenkontrolle über RNAi erfordert. Derzeit gibt es jedoch einen Mangel an Forschung zur Entwicklungs- und Fortpflanzungsbiologie von B. xylophilus.
Als Fortsetzung der früheren Arbeit10,11,12,13 beschreiben wir hier ein Protokoll zur Anwendung von RNAi zur Untersuchung der Funktion des ppm-1-Gens von B. xylophilus, einschließlich der Synthese von dsRNA, des Einweichens synthetischer Neurostimulanzien und des quantitativen Polymerase-Kettenreaktionsnachweises (qPCR). Die Erkenntnisse aus diesem experimentellen Ansatz werden wahrscheinlich deutlich zum Verständnis grundlegender biologischer Systeme und zur Vorbeugung von Kiefernwelke beitragen.

<table><tbody><tr><td>Baermann-Schornstein</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>um Nematoden zu isolieren</td></tr><tr><td>Beacon Designer 7.9</td><td>Shanghai Kangyusheng Information Technology Co.</td><td>n/a</td><td>um qPCR-Primer zu entwerfen</td></tr><tr><td>Botrytis cinerea</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>als Nahrung für Nematoden</td></tr><tr><td>Bursaphelenchus xylophilus</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>ihre Nummer war NXY61 und sie wurde ursprünglich aus der Krankheit Pinus massoniana in Ningbo, Provinz Zhejiang, China, gewonnen.</td></tr><tr><td>Inkubator bei konstanter Temperatur</td><td>Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.</td><td>H1703544</td><td>um Nematoden zu kultivieren</td></tr><tr><td>Elektrophoreseapparat</td><td>Bio-Rad Labore</td><td>1704466</td><td>zur Erreichung der elektrophoretischen Analyse</td></tr><tr><td>Ethanol, 75 %</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>80176961</td><td>RNA zu extrahieren</td></tr><tr><td>Ex Taq Polymerase-Vormischung</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR030A</td><td>für PCR</td></tr><tr><td>Ex Taq Polymerase-Vormischung</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR390A</td><td>für PCR</td></tr><tr><td>Gel-Bildgeber</td><td>LongGene Scientific Instruments Co.</td><td>LG2020</td><td>um Nukleinsäurebänder sichtbar zu machen</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad-Prisma</td><td>n/a</td><td>um die Daten zu analysieren und Figuren zu erstellen</td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeitszentrifuge</td><td>Hangzhou Allsheng Instruments Co.</td><td>AS0813000</td><td>Zentrifuge</td></tr><tr><td>Hochfluss-Gewebeschleifer</td><td>Bertin</td><td></td><td>RNA zu extrahieren</td></tr><tr><td>ImageJ-Software</td><td>Nationale Gesundheitsinstitute</td><td>n/a</td><td>um die Körperlängen zu messen</td></tr><tr><td>Isopropylalkohol</td><td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.</td><td>L1909022</td><td>RNA zu extrahieren</td></tr><tr><td>Leica DM4B-Mikroskop</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td>Nematoden zu beobachten</td></tr><tr><td>Magnetperlen</td><td>Aoran Science Technology Co.</td><td>150010C</td><td>RNA zu extrahieren</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Hochleistungs-Transkriptionskit</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>AM1333</td><td>um dsRNA in vitro zu synthetisieren</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-2000 Spektrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>NanoDrop 2000/2000C</td><td>um die Qualität der dsRNA zu analysieren</td></tr><tr><td>PCR-Verstärker</td><td>Bio-Rad Life Medical Products Co.</td><td>1851148</td><td>zur Amplifizierung der Nukleinsäuresequenz</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>um Nematoden zu kultivieren</td></tr><tr><td>pGEM-T Easy-Vektor</td><td>Promega Corporation</td><td>A1360</td><td>Für das Klonen</td></tr><tr><td>Kartoffel-Dextrose-Agar (Medium)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>um Botrytis cinerea</td></tr><tr><td>Prime Script RT Reagenz-Kit mit gDNA-Radiergummi</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR047B</td><td>um synthetische cDNA zu synthetisieren</td></tr><tr><td>Primer Premier 5.0</td><td>PREMIER Biosoft</td><td>n/a</td><td>um PCR-Primer zu entwerfen</td></tr><tr><td>Grundbücher:ppm-1-F/R</td><td>Tsingke Biotechnology Co.</td><td>n/a</td><td>F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3</td></tr><tr><td>q-ppm-1-F/R</td><td>Tsingke Biotechnology Co.</td><td>n/a</td><td>F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3'</td></tr><tr><td>Echtzeit-Thermalzykler&nbsp; qTOWER 2.2</td><td>Analytique Jena Instruments (Peking) Co.</td><td></td><td>für qPCR</td></tr><tr><td>Zitternder Tisch</td><td>Shanghai Zhicheng Analyseinstrumentenherstellung GmbH.</td><td></td><td>um Nematoden einzuweichen</td></tr><tr><td>Stereoskopisches Mikroskop</td><td>Chongqing Optec Instrument Co.</td><td>1814120</td><td>Nematoden zu beobachten</td></tr><tr><td>T7-GFP-F/R</td><td>Tsingke Biotechnology Co.</td><td>n/a</td><td>F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3'</td></tr><tr><td>&nbsp; T7-Veranstalter</td><td>Tsingke Biotechnology Co.</td><td>n/a</td><td>TAATACGACTCACTATAGGG</td></tr><tr><td>Takara MiniBEST Agarose Gel DNA-Extraktionsset</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>9762</td><td>um DNA zu gewinnen</td></tr><tr><td>TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR820A</td><td>für qPCR</td></tr><tr><td>Trichlorethan</td><td>Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co.</td><td></td><td>RNA zu extrahieren</td></tr><tr><td>TRIzol-Reagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>15596026</td><td>gesamte RNA-Extraktionsreagenz, um RNA zu extrahieren</td></tr></tbody></table>

anwendung von rna-interferenz im kiefernnematoden, bursaphelenchus xylophilus

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Der Kiefernfadenwurm, Bursaphelenchus xylophilus, ist eine der zerstörerischsten invasiven Arten weltweit, die das Welken und schließlich das Absterben von Kiefern verursacht. Trotz der Anerkennung ihrer ökonomischen und ökologischen Bedeutung war es bisher unmöglich, die detaillierten Genfunktionen von pflanzenparasitischen Nematoden (PPNs) mit konventioneller Vorwärtsgenetik und transgenen Methoden zu untersuchen. Als umgekehrte genetische Technologie erleichtert die RNA-Interferenz (RNAi) jedoch die Untersuchung der funktionellen Gene von Nematoden, einschließlich B. xylophilus. 
Dieser Artikel skizziert ein neues Protokoll für RNAi des ppm-1-Gens in B. xylophilus, von dem berichtet wurde, dass es eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Reproduktion anderer pathogener Nematoden spielt. Für RNAi wurde der T7-Promotor durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit dem 5′-Terminal des Zielfragments verknüpft, und doppelsträngige RNA (dsRNA) wurde durch In-vitro-Transkription synthetisiert. Anschließend wurde die dsRNA-Abgabe erreicht, indem die Nematoden in einer dsRNA-Lösung mit synthetischen Neurostimulanzien eingeweicht wurden. Synchronisierte Jungtiere von B. xylophilus (ca. 20.000 Individuen) wurden gewaschen und im Einweichpuffer für 24 h im Dunkeln bei 25 °C in dsRNA (0,8 μg/ml) eingeweicht.
Die gleiche Menge an Nematoden wurde in einen Einweichpuffer ohne dsRNA als Kontrolle gegeben. In der Zwischenzeit wurde eine weitere identische Menge von Nematoden in einen Einweichpuffer mit dem grün fluoreszierenden Protein (gfp) -Gen dsRNA als Kontrolle gegeben. Nach dem Einweichen wurde das Expressionsniveau der Zieltranskripte mittels quantitativer real-time PCR bestimmt. Die Wirkung von RNAi wurde dann durch mikroskopische Beobachtung der Phänotypen und einen Vergleich der Körpergröße der Erwachsenen unter den Gruppen bestätigt. Das aktuelle Protokoll kann dazu beitragen, die Forschung voranzutreiben, um die Funktionen der Gene von B. xylophilus und anderen parasitären Nematoden besser zu verstehen, um Kontrollstrategien durch Gentechnik zu entwickeln.

Analyse der ppm-1-Expression von B. xylophilus nach RNAi Das relative Expressionsniveau des ppm-1-Gens von B. xylophilus, das mit GFP dsRNA getränkt und mit Zielgen dsRNA getränkt war, betrug 0,92 bzw. 0,52 (das ppm-1-Genexpressionsniveau der ddH2 O-behandelten Kontrollgruppe wurde auf 1 festgelegt) (Abbildung 1). Daher hat exogene dsRNA keinen Einfl...

Hier stellen wir eine detaillierte Einweichmethode der RNA-Interferenz in Bursaphelenchus xylophilus vor, um die Untersuchung von Genfunktionen zu erleichtern.

Anwendung von RNA-Interferenz im Kiefernnematoden, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

RNAi hat sich zu einer effektiven Methode zur Identifizierung der Funktion von Genen in Nematoden entwickelt und wird als neuer Weg zur effektiven Kontrolle pathogener Nematoden vorgeschlagen. RNAi ist das Einweichen von Nematoden in dsRNA kann für das Verfahren ausreichen. Sammeln Sie zunächst die Nematoden mit der Baermann-Trichtermethode.Legen Sie dazu einen klemmten Gummischlauch unter einen Trichter und legen Sie zwei Schichten Filterpapier in den Mund des Trichters. Die Botrytis cinerea-Pilzkulturen in den Trichter geben und Wasser hinzufügen, um die Pilzmatte einzutauchen. Wenn Nematoden gesammelt werden, fügen Sie 500 Mikroliter Extraktionsreagenz und 100 Mikroliter Magnetperlen zu einem Zentrifugenröhrchen mit zwei Millilitern hinzu.20 Mikroliter der Nematoden absaugen und die Proben bei 9.000 x g 30 Sekunden lang mahlen. Fünf Minuten inkubieren und bei 12.000 x g 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Den Überstand in ein frisches Zentrifugenröhrchen überführen.Fügen Sie 100 Mikroliter Chloroform hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. Drei Minuten inkubieren und dann bei 12.000 x g 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Übertragen Sie den Überstand erneut in ein frisches Zentrifugenröhrchen.Fügen Sie 250 Mikroliter Isopropylalkohol hinzu und wirbeln Sie kräftig. Zentrifugieren bei 12.000 x g für 10 Minuten und Wirbel. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 500 Mikroliter 75% Ethanol hinzu, um die RNA zu waschen.Wirbeln Sie die Probe an, gefolgt von einer Zentrifugation bei 12.000 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Trocknen Sie das RNA-Pellet fünf Minuten an der Luft und resuspendieren Sie es in 30 Mikrolitern RNase-freiem Wasser. Berechnen Sie die RNA-Konzentration mit dieser Formel und berechnen Sie das Verhältnis von A260 zu A280.Als nächstes verwenden Sie ein Paar Primer, um die teilweise kodierende Sequenz des BX ppm-1-Gens aus dem B.xylophilus zu amplifizieren. Dann klonen Sie die ppm-1 one-Gensequenzen in einen pGEM-T Easy-Vektor, der den T7-Promotor enthält. Wiederherstellung des 894 Basenpaares langes ppm-1-Genfragment, indem das klonierte Plasmid als Vorlage für pcr verwendet wird.Verwenden Sie dann ein In-vitro-Transkriptionskit, um die dsRNA zu synthetisieren. Analysieren Sie die Qualität der dsRNA mit einem Spektralphotometer und visualisieren Sie die Produkte auf einem 1%Agarose-Gel. Fügen Sie vier Mikroliter 5X Einweichpuffer hinzu und füllen Sie das Volumen auf 20 Mikroliter mit doppelt destilliertem Wasser, um eine endgültige RNA-Konzentration von 0,8 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten.Dann legen Sie die Nematoden für 30 Minuten in die Schale und warten Sie, bis die Eier am Boden haften. Entfernen Sie vorsichtig das Wasser und die Nematoden, ohne die Eier zu stören, bis nur noch die Eier in der Schale verbleiben. Die gesammelten Eier im Dunkeln bei 25 Grad Celsius für 24 Stunden ausbrüten, um J2-Larven zu erhalten.Sammeln Sie die Larven in einem Röhrchen und waschen Sie sie dreimal mit doppelt destilliertem Wasser. Dann werden die Larven in das Röhrchen mit der dsRNA-Lösung überführt. Fügen Sie dazu Resorcin hinzu, um eine 1% ige Lösung zu erhalten.Legen Sie die Larven auf einen Schütteltisch, um eine ausreichende Aufnahme von dsRNA in die Larven zu gewährleisten. Für Kontrollen ist die gleiche Menge Nematoden ohne die dsRNA-Sonde oder mit einer GFP-dsRNA-Sonde in den Einweichpuffer eingeweicht. Führen Sie eine qPCR mit den actB- und tbb-2-Genen als interne Referenzen durch, um die Veränderungen des Genexpressionsniveaus zu bewerten.Verwenden Sie die delta-delta-Ct-Methode, um das relative Genexpressionsniveau aus der Auflösungskurve und dem Ct-Wert zu schätzen. Nach RNAi kultivieren Sie die J2-Larven bis ins Erwachsenenalter auf Botrytis cinerea-Rasenflächen auf PDA-Platten. Sammeln Sie die Erwachsenen mit der Baermann Trichtermethode, wie in Abschnitt eins gezeigt.Nehmen Sie Bilder der erwachsenen Nematoden unter einem Mikroskop auf und verwenden Sie die ImageJ-Software, um die Körperlänge von 50 männlichen und 50 weiblichen Nematoden zu messen. Analysieren Sie die Daten, indem Sie den Mittelwert und die Standardabweichung für jede Stichprobe berechnen. Wenden Sie den Student's t-Test an, um die Mittelwerte der Stichproben aus den verschiedenen Gruppen zu vergleichen.Die Analyse der relativen Genexpression nach RNAi zeigte, dass die ppm-1 dsRNA die Expression des ppm-1 one-Gens von B.Xylophilus wirksam hemmen kann. Während exogene GFP dsRNA keinen Einfluss auf die ppm-1-Expression hatte. Nach RNAi nahm die Größe der Erwachsenen trotz Erreichen der Geschlechtsreife deutlich ab, was zu dem kleinen mutierten Phänotyp der Körpergröße führte.Die mittlere Körperlänge der mutierten Weibchen und Männchen betrug 544 und 526 Mikrometer im Vergleich zu 971 und 912 Mikrometer für die Kontrollgruppe. Das Wichtigste ist, die Nematoden in die Doppelstrang-RNA-Lösung zu übertragen und ein weiteres Reagenz hinzuzufügen, um die Nematoden zum Fressen anzuregen. Diese Methode eignet sich für großflächige Genscreens und wird häufig in der Zellforschung eingesetzt. Die Untersuchung der Genfunktion von B.Xylophilus mit dieser Methode hat Leitwert für die biologische Kontrolle von B.Xylophilus.

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