Beurteilung der offenen Wahrscheinlichkeit der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore im Setting des Coenzym-Q-Überschusses
1. Juni 2022
Diese Methode nutzt den Beitrag der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore zum Protonenleck mit niedriger Leitfähigkeit, um die Spannungsschwelle für die Porenöffnung bei neonatalen Fragile-X-Syndrom-Mäusen mit erhöhtem mitochondrialem Coenzym-Q-Gehalt im Vergleich zur Wildtypkontrolle zu bestimmen.
Dieses Protokoll bietet eine neue Möglichkeit, die niedrige Leitfähigkeitsöffnung der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine einfache Möglichkeit bietet, die offene Wahrscheinlichkeit der Pore als Funktion des mitochondrialen Membranpotentials zu messen. Diese Technik kann leicht auf Mitochondrien angewendet werden, die aus jedem Organsystem und jeder Spezies isoliert sind.
Beginnen Sie mit der Kalibrierung der Sauerstoffelektrode, indem Sie einen Tropfen von 50% Kaliumchlorid-Elektrolytlösung auf die Kuppel der Elektrodenscheibe legen. Legen Sie ein kleines Stück von zwei Quadratzentimetern Zigarettenpapier-Abstandshalter, der mit einem etwas größeren Stück Polytetrafluorethylenmembran bedeckt ist, über den Elektrolyttropfen. Verwenden Sie dann das Applikatorwerkzeug, um den kleinen Elektrodenscheiben-O-Ring über die Kuppel der Elektrode zu schieben.
Als nächstes füllen Sie das Reservoir gut mit der Elektrolytlösung auf. Platzieren Sie den größeren O-Ring in der Aussparung um die Elektrodenscheibe. Installieren Sie dann die Disc in der Elektrodenkammer und schließen Sie sie an die Steuereinheit an.
Geben Sie zwei Milliliter luftgesättigtes entionisiertes Wasser und den mit Polytetrafluorethylen beschichteten Magneten in die Reaktionskammer. Wenn Sie fertig sind, schließen Sie die Kammer an die Rückseite der Steuereinheit an. Stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius und die Rührgeschwindigkeit auf 100 Grad ein.
Lassen Sie die Systemtemperatur vor der Kalibrierung 10 Minuten lang ausgleichen. Nachdem Sie die richtige Temperatur, Rührgeschwindigkeit und den richtigen Druck sichergestellt haben, wählen Sie auf der Registerkarte Kalibrierung die Option Flüssigkeitsphasenkalibrierung aus, um eine Flüssigphasenkalibrierung durchzuführen. Drücken Sie dann OK und warten Sie, bis das Signal ein Plateau erreicht hat.
Sobald das Plateau erreicht ist, drücken Sie OK. Dann fügen Sie etwa 20 Milligramm Natriumdithionit hinzu, um Null Sauerstoff in der Kammer zu etablieren. Drücken Sie erneut OK und warten Sie, bis das Signal ein Plateau erreicht hat, bevor Sie auf die Schaltfläche Speichern klicken, um die Kalibrierung zu akzeptieren. Um die tetraphenylphosphonium- oder TPP-selektive Elektrodenanordnung herzustellen, füllen Sie die TPP-selektive Elektrodenspitze mit einer 10-millimolaren TPP-Lösung unter Verwendung einer Spritze und einer flexiblen Nadel.
Vermeiden Sie Luftblasen beim Befüllen der Elektrodenspitze. Lösen Sie die Elektrodenhalterkappe, um die interne Referenzelektrode in die TPP-Spitze einzuführen. Wenn Sie fertig sind, montieren Sie die TPP-selektive Elektrodenvorrichtung, einschließlich der Referenzelektrode und des Elektrodenhalters.
Ziehen Sie die Kappe fest, um die Spitze zu sichern. Schließen Sie dann das Kabel an den AUX-Port der Steuerbox und den TPP-Elektrodenhalter an. Setzen Sie die TPP-selektiven und Referenzelektroden in die angepasste Kolbenbaugruppe für ionenselektive Elektroden ein.
Schließen Sie die Referenzelektrode an den Referenzport der Steuerbox an. Als nächstes, um die Reaktionskammer vorzubereiten, fügen Sie einen Milliliter des Reaktionsgemisches in die Reaktionskammer hinzu, ohne Luftblasen zu erzeugen. Schließen Sie die Kammer mit der angepassten Kolbenbaugruppe mit den TPP-selektiven und Referenzelektroden.
Sobald die Kammer geschlossen ist, führen Sie zusätzliche Reagenzien direkt in die Reaktionskammer ein, indem Sie separate Mikrospritzen verwenden, die mit Kunststoffschläuchen modifiziert sind. Wenn die Einrichtung abgeschlossen ist, wählen Sie Gehe zu, um die Aufnahme zu starten. Sobald ein stabiles Spannungssignal erhalten wurde, kalibrieren Sie die TPP-selektive Elektrode, indem Sie ein Mikromolar-Inkrement einer 0,1-millimolaren TPP-Lösung hinzufügen, um eine Endkonzentration von drei Mikromolaren zu erreichen.
Beobachten Sie den logarithmischen Rückgang des TPP-Spannungssignals bei jeder Addition. Nach der Stabilisierung der Sauerstoff- und TPP-Spuren werden 100 Mikrogramm frisch zubereitete Kardiomyozytenmitochondrien über den Reagenzzugabeanschluss in der Kolbenanordnung in die Reaktionskammer gegeben, bis zu einer Endkonzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter. Beobachten Sie die Abnahme des Sauerstoffgehalts in der Kammer, wenn die Mitochondrien energetisiert werden und Sauerstoff verbrauchen.
Sehen Sie auch den abrupten Anstieg des TPP-Spannungssignals, da die Mitochondrien ein Membranpotential erzeugen und TPP aus der Lösung aufnehmen. Dann fügen Sie 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Oligomycin hinzu, um die Atmung des Zustands 4 zu induzieren. Um die offene Wahrscheinlichkeit der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore (mPTP) zu beurteilen, beobachten Sie den Rückgang des Membranpotentials im Laufe der Zeit während der Leckrespiration.
Sobald das gewünschte Membranpotential erreicht ist, fügen Sie ein mikromolares Cyclosporin A als mPTP-Inhibitor in die Reaktionskammer ein, um die offene Wahrscheinlichkeit des mPTP bei diesem spezifischen Membranpotential zu bewerten. Messen Sie dann die Wirkung von Cyclosporin A auf den Sauerstoffverbrauch und das Membranpotential vor und nach der Cyclosporin-A-Addition. In den repräsentativen Kurven des gleichzeitigen Sauerstoffverbrauchs und des Membranpotentials wurde das hohe Membranpotential auf Null, das mittlere auf fünf und das niedrige auf 10 Millivolt relativ zum zweimikromolaren TPP-Kalibrierniveau festgelegt.
Die Mitochondrien bei null Millivolt zeigten eine geschlossene Wahrscheinlichkeit von 100% mPTP und bei 10 Millivolt eine offene Wahrscheinlichkeit von 100%. Nach der Oligomycin-Addition wurde kein signifikanter Unterschied im Sauerstoffverbrauch beobachtet, was darauf hindeutet, dass Adenosintriphosphat oder ATP-Synthase minimal zur Atmung von Zustand 2 beiträgt. Weiterhin wurden die Sauerstoffverbrauchsrate und das Membranpotential vor und nach der Cyclosporin-A-Zugabe verglichen.
Eine Abnahme des Sauerstoffverbrauchs und eine Erhöhung der Stabilisierung des Membranpotentials deuteten auf den Verschluss eines offenen mPTP hin. Wenn das mPTP geschlossen ist, gab es keine Abnahme der Sauerstoffverbrauchsrate und das Membranpotential sank weiter. Die Ergebnisse zeigten ähnliche geschlossene und offene mPTP-Wahrscheinlichkeiten bei hohen und niedrigen Membranpotentialen in den FVB-Kontroll- und Fmr1-Knockout-Herzmitochondrien.
Am intermediären Membranpotential zeigten die Fmr1-Knockout-Herzmitochondrien eine erhöhte geschlossene mPTP-Wahrscheinlichkeit im Vergleich zu den FVB-Kontrollen. Es dürfen keine Luftblasen in die Kammer eingeführt werden, da dies zu instabilen Sauerstoffverbrauchswerten führt und die Interpretation erschwert. Nach diesem Verfahren kann die Calciumbeladungskapazität gemessen werden.
Diese Methode bewertet die hohe Leitfähigkeitsöffnung der Pore und ergänzt die Ergebnisse unserer Technik.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Öffnung mit niedriger Leitfähigkeit der mitochondrialen Permeabilitäts-Übergangspore (mPTP) bei neonatalen fragilen X-Syndrom-Mäusen und hebt die Spannungsschwelle für die Porenöffnung hervor. Die Ergebnisse vergleichen den mitochondrialen Coenzym-Q-Gehalt in Kardiomyozyten in Modellorganismen mit Wildtyp-Kontrollen und etablieren einen neuen Ansatz zur Messung des mPTP-Verhaltens als Funktion des mitochondrialen Membranpotenzials.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Mitochondriale Physiologie
- Fragiles X-Syndrom
- Funktion der Kardiomyozyten
Hintergrund
- Die mitochondriale Permeabilitäts-Übergangspore (mPTP) spielt eine entscheidende Rolle im zellulären Energiestoffwechsel.
- Es ist bekannt, dass das fragile X-Syndrom die zelluläre Funktion und den Stoffwechsel beeinflusst.
- Die Studie zielt darauf ab, die Beziehung zwischen mPTP-Verhalten und mitochondrialem Potenzial in Herzzellen zu klären.
Verwendete Methoden
- Kalibrierung einer Sauerstoffelektrode zur Messung der mitochondrialen Aktivität
- Kardiomyozyten-Mitochondrien von neonatalen fragilen X-Syndrom-Mäusen und Wildtyp-Kontrollen
- Anwendung von mPTP-Inhibitoren wie Cyclosporin A zur Beurteilung der Porenöffnungswahrscheinlichkeit
Hauptergebnisse
- Identifizierung der Spannungsschwelle für die mPTP-Öffnung in kardialen Mitochondrien.
- Demonstration unterschiedlicher mPTP-Öffnungswahrscheinlichkeiten zwischen fragilem X-Syndrom und Wildtyp-Kontrollmitochondrien.
- Validierung, dass die Schließ- und Öffnungswahrscheinlichkeiten von mPTP vom Membranpotenzial beeinflusst werden.
Schlussfolgerungen
- Die Studie etabliert eine neue Methodik zur Analyse der mPTP-Dynamik und deren Auswirkungen in Krankheitsmodellen.
- Diese Ergebnisse erweitern unser Verständnis der mitochondrialen Dysfunktion beim fragilen X-Syndrom und verwandten Erkrankungen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mitochondrial permeability transition pore (mPTP) open probability as a function of membrane potential enables mechanistic de-risking in early discovery and target validation for mitochondrial dysfunction. This approach provides predictive confidence for evaluating mitochondrial liabilities and supports portfolio triage in disease-relevant models. The method's adaptability across organ systems and species enhances its enterprise value for translational research and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of mPTP gating mechanisms under defined voltage thresholds.
- Supports functional target validation by quantifying pore open probability in response to modulators like cyclosporine A.
- Facilitates mechanistic de-risking of mitochondrial targets in disease-relevant systems.
- Provides a platform for comparative studies across genetic backgrounds and tissue types.
Screening & Assay Development
- Establishes standardized, quantitative readouts for mPTP activity using simultaneous oxygen consumption and membrane potential measurements.
- Enables reproducible assessment of compound effects on mitochondrial function in isolated organelles.
- Supports assay scalability and cross-laboratory standardization through robust electrode-based protocols.
- Prepares validated biological systems for downstream screening of mitochondrial modulators.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial functional readouts with disease-relevant phenotypes in genetic models.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of mitochondrial targets.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying functional mitochondrial liabilities.
- Facilitates biomarker alignment for translational research in mitochondrial pathologies.
Pipeline & Workflow Integration
This technique integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, mechanistic de-risking, and quantitative assessment of mitochondrial function in isolated systems.
- Discovery Biology: Provides voltage-dependent mPTP open probability data for pathway clarification and target validation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in mitochondrial assays.
- Analytics: Generates simultaneous oxygen consumption and membrane potential measurements for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to preclinical models by supporting disease-relevant system interrogation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable protocol for diverse organ systems and species in mitochondrial research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales mitochondrial functional assays for cross-team reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking mitochondrial liabilities early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of mitochondrial-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial isolation and electrode-based measurement techniques.
- Demands access to polarography and TPP-selective electrode instrumentation.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility of quantitative outputs.
- Adaptable to various organ systems and species with protocol optimization.
- Careful handling is needed to avoid air bubbles and ensure stable oxygen consumption readings.
