Name: Beurteilung der offenen Wahrscheinlichkeit der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore im Setting des Coenzym-Q-Überschusses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Erfahren Sie eine neue Methode zur Messung der Öffnungswahrscheinlichkeit der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore in Abhängigkeit vom Membranpotential. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Mitochondrien aus verschiedenen Organsystemen und Spezies.

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Diese Arbeit wird durch die folgenden Zuschüsse unterstützt: NIH/NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia University Irving Medical Center Target of Opportunity Provost award an die Abteilung für Anästhesiologie (K.K.G.), Society of Pediatric Anesthesia Young Investigator Research Award (K.K.G.) und NIH/NINDS R01NS112706 (R.J.L.)

Das Institutional Animal Care and Use Committee des Columbia University Medical Center erhielt die Zulassung für alle beschriebenen Methoden. FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyr c-ch Fmr1 tm1Cgr/J) und Kontrollmäuse (FVB) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ), die als Modellsysteme für diese Studie verwendet wurden, wurden kommerziell erworben (siehe Materialtabelle). In jeder Versuchsgruppe wurden fünf bis elf Tiere eingesetzt. Postnatale Tag 10 (P10) Mäuse wurden verwendet, um für einen Zeitpunkt in der menschlichen Kindheit zu modellieren.
1. Mitochondriale Isolierung vom Mausherzen
<ol><li>Bereiten Sie Puffer für mitochondriale Isolierungs- und Atmungsexperimente vor, wie in Tabelle 1 beschrieben. Bei 4 °C lagern, wenn dies im Voraus erfolgt.<ol>
<li>Bereiten Sie ein Dichtegradientenmedium mit 15 % vor: Verdünnen Sie das handelsübliche Dichtegradientenmedium auf 80 % Volumen/Volumen (v/v) mit einem Dichtegradientenverdünnungsmittel. Weiter verdünnen Sie 80% Dichtegradient medium 15% v/v durch Zugabe von mitochondrialem Isolationspuffer (MI)/Rinderserumalbumin (BSA).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolieren Sie Mitochondrien aus frischem, nicht gefrorenem Gewebe für diese Experimente und verwenden Sie es am Tag der Vorbereitung, typischerweise innerhalb von fünf Stunden26. Führen Sie alle Isolationsschritte auf Eis durch.<ol>
<li>Enthaupten Sie die Maus und entfernen Sie das Herz. Sofort 1-2 mal in einer Petrischale mit eiskaltem MI/BSA waschen. Schneiden Sie den Vorhof ab und zerkleinern Sie das Gewebe.</li>
		<li>Überführen Sie das gehackte Herzgewebe in einen Glas-Glas-Homogenisator, der 1 ml MI/BSA enthält. Homogenisieren Sie mit einem lockereren (A) Stößel (10 Schläge), dann mit einem engeren (B) Stößel (10 Schläge).</li>
		<li>Zentrifen Sie das Homogenat bei 1.100 × g für 2 min bei 4 °C, um nukleare und zelluläre Ablagerungen zu entfernen.</li>
		<li>Nehmen Sie den Überstand vorsichtig, ohne ein flauschiges Pellet zu berühren, und schichten Sie ihn vorsichtig auf 700 μL 15% Dichtegradientenmedium in einem Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 18.500 × g für 15 min bei 4 °C.</li>
		<li>Resuspendiert das Pellet in 1 ml Saccharosepuffer (SB)/BSA und zentrifugiert bei 10.000 × g für 10 min bei 4 °C.</li>
		<li>Entfernen und verwerfen Sie den Überstand vollständig. Resuspendiert das Pellet in SB/BSA auf ein Endvolumen von 55 μL.</li>
		<li>Quantifizieren Sie den mitochondrialen Proteingehalt mit einem Standardassay wie dem Bicinchoninsäure (BCA) Protein-Assay.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Mitochondrialer Sauerstoffverbrauch (O2) und ΔΨ
<ol><li>Montage und Kalibrierung von Sauerstoffelektroden<ol>
<li>Richten Sie die Sauerstoffelektrode (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und kalibrieren Sie sie.<ol>
<li>Geben Sie einen Tropfen 50% Kaliumchlorid (KCl) -Elektrolytlösung auf die Kuppel der Elektrodenscheibe.</li>
			<li>Legen Sie ein kleines Stück ~ 2 cm2 Zigarettenpapier Abstandshalter, der mit einem etwas größeren Stück der mitgelieferten Polytetrafluorethylen (PTFE) -Membran bedeckt ist, über den Elektrolyttropfen.</li>
			<li>Schieben Sie mit dem mitgelieferten Applikatorwerkzeug den O-Ring der kleinen Elektrodenscheibe über die Kuppel der Elektrode. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind und dass die Membran glatt ist.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Füllen Sie das Reservoir gut mit der Elektrolytlösung auf.</li>
		<li>Platzieren Sie den größeren O-Ring in der Aussparung um die Elektrodenscheibe.</li>
		<li>Installieren Sie die Disc in der Elektrodenkammer und schließen Sie sie an die Steuereinheit an.</li>
		<li>Geben Sie 2 ml luftgesättigtes deionisiertes Wasser in die Reaktionskammer und den PTFE-beschichteten Magneten in die Kammer.</li>
		<li>Verbinden Sie die Kammer mit der Rückseite der Steuereinheit.</li>
		<li>Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C und die Rührgeschwindigkeit auf 100 ein.</li>
		<li>Es kann 10 Minuten dauern, bis sich die Systemtemperatur ausgleicht, bevor mit der Kalibrierung begonnen wird.</li>
		<li>Wählen Sie auf der Registerkarte Kalibrierung die Option Flüssigphasenkalibrierung aus, um eine Flüssigphasenkalibrierung durchzuführen. Vergewissern Sie sich, dass die Temperatur auf 37 °C, die Rührgeschwindigkeit 100 und der Druck auf den atmosphärischen Druck (101,32 kPa) eingestellt ist.</li>
		<li>Drücken Sie OK und warten Sie , bis das Signal ein Plateau erreicht hat.</li>
		<li>Wenn ein Plateau erreicht ist, drücken Sie OK.</li>
		<li>Etablieren Sie Null O2 in der Kammer, indem Sie eine kleine Menge (~ 20 mg)Natriumdithionit hinzufügen.</li>
		<li>Drücken Sie OK und warten Sie , bis das Signal ein Plateau erreicht hat.</li>
		<li>Wenn ein Plateau erreicht ist, drücken Sie Speichern , um die Kalibrierung zu akzeptieren.</li>
	</ol></li>
	<li>TPP+-selektive Elektrodenmontage<ol>
<li>Füllen Sie die TPP+- selektive Elektrodenspitze mit 10 mM TPP-Lösung unter Verwendung der mitgelieferten Spritze und flexiblen Nadel und achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden.</li>
		<li>Montieren Sie die TPP+-selektive Elektrodenvorrichtung einschließlich der Referenzelektrode und des Elektrodenhalters (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Lösen Sie kurz die Elektrodenhalterkappe und setzen Sie die interne Referenzelektrode in die TPP+-Spitze ein. Ziehen Sie die Kappe fest, um die Spitze zu sichern. Schließen Sie das mitgelieferte Kabel an den Elektrodenhalter und den Hilfsanschluss der Steuerbox an.</li>
		<li>Setzen Sie die TPP+-selektive Elektrode und Referenzelektroden in die angepasste Kolbenbaugruppe für ionenselektive Elektroden ein. Schließen Sie die Referenzelektrode an den Referenzport der Steuerbox an.</li>
		<li>Setzen Sie die TPP+-selektiven und Referenzelektroden in die angepasste Kolbenbaugruppe für ionenselektive Elektroden ein.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung der Reaktionskammer<ol>
<li>Geben Sie das Reaktionsgemisch in die Reaktionskammer: 10 mM Succinat (Komplex-II-Substrat), 5 μM Rotenon (Komplex-I-Hemmer), 80 ng ml−1 Nigericin (um den pH-Gradienten über IMM zu kollabieren), 2,5 μg mL-1 Oligomycin (um die Atmung im Zustand 4 zu induzieren) und den Atmungspuffer (RB) / BSA-Reaktionspuffer zu einem Endvolumen von 1 ml. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in die Kammer gelangen.</li>
		<li>Schließen Sie die Kammer mit der angepassten Kolbenbaugruppe mit der TPP+-selektiven und der Referenzelektrode an Ort und Stelle. Wählen Sie GO aus, um die Aufnahme zu starten. Sobald die Kammer geschlossen ist, führen Sie zusätzliche Reagenzien direkt in die Reaktionslösung ein, indem Sie separate Mikrospritzen verwenden, die mit Kunststoffschläuchen modifiziert wurden, um die Nadellänge einzustellen.</li>
	</ol></li>
	<li>TPP+ Kalibrierung<ol>
<li>Sobald ein stabiles Spannungssignal erhalten wurde, kalibrieren Sie die TPP+-selektive Elektrode, indem Sie 1 μM-Schritte einer 0,1 mM TPP-Lösung zu einer Endkonzentration von 3 μM hinzufügen. Beachten Sie, dass das TPP+ -Spannungssignal mit jedem Zusatz logarithmisch abnimmt. HINWEIS: Kalibrieren Sie die TPP+-selektive Elektrode zu Beginn jedes Experiments.</li>
	</ol></li>
	<li>Datenerfassung<ol>
<li>Lassen Sie dieO2- und TPP+-Spuren stabilisieren und fügen Sie 100 μg frisch zubereitete Kardiomyozytenmitochondrien in die Reaktionskammer zu einer Endkonzentration von 0,1 mg ml-1 über den Reagenzzugabeanschluss in der Kolbenbaugruppe hinzu. Beobachten Sie die Abnahme der O2-Spiegel in der Kammer, wenn die Mitochondrien unter Strom gesetzt werden undO2 verbrauchen, und den abrupten Anstieg des TPP+-Spannungssignals, wenn die Mitochondrien ein Membranpotential erzeugen und TPP+ aus der Lösung aufnehmen.</li>
		<li>Fügen Sie 2,5 μg mL-1 Oligomycin hinzu, um die Atmung des Zustands 4 zu induzieren. HINWEIS: DieO2-Verbrauchsraten stellen nun die Rate der Protonenleckatmung dar. Oligomycin kann alternativ vor TPP+ in die Reaktionskammer gegeben werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Beurteilung der offenen Wahrscheinlichkeit des mPTP<ol>
<li>Beachten Sie, dass ΔΨ im Laufe der Zeit während der Leckatmung abnimmt. Sobald das gewünschte ΔΨ erreicht ist, fügen Sie 1 μM CsA (mPTP-Inhibitor) in die Reaktionskammer hinzu, um die offene Wahrscheinlichkeit des mPTP bei diesem spezifischen ΔΨ zu bewerten.</li>
		<li>Messung der Wirkung von CsA auf denO2-Verbrauch und ΔΨ vor und nach der CsA-Addition</li>
		<li>Bestimmen Sie die Spannungsabhängigkeit der mPTP-Öffnung, indem Sie die ΔΨ variieren, bei der CsA in aufeinanderfolgenden Experimenten hinzugefügt wird.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+mitochondrial+cyclosporin+A-sensitive+permeability+transition+pore+by+the+proton+electrochemical+gradient.+Evidence+that+the+pore+can+be+opened+by+membrane+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).</li>
<li>Petronilli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+voltage+sensor+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+is+tuned+by+the+oxidation-reduction+state+of+vicinal+thiols.+Increase+of+the+gating+potential+by+oxidants+and+its+reversal+by+reducing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).</li>
<li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+binding+to+F-ATP+synthase+beta+subunit+triggers+the+mitochondrial+permeability+transition%5BTitle%5D)+AND+%22European+Molecular+Biology+Organization+Reports%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition.</a> European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).</li>
<li>Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+thiol+reagents%2C+and+membrane+potential+modulate+the+mitochondrial+permeability+transition+by+affecting+nucleotide+binding+to+the+adenine+nucleotide+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).</li>
<li>Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+mitochondrial+megachannel+by+divalent+cations+and+protons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).</li>
<li>Karch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+permeability+transition+by+deletion+of+the+ANT+family+and+CypD%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD.</a> Science Advances. 5 (8), (2019).</li>
<li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li>
<li>Antoniel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+histidine+in+OSCP+subunit+of+F-ATP+synthase+mediates+inhibition+of+the+permeability+transition+pore+by+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22European+Molecular+Biology+Organization+Reports%22%5BJournal%5D)">The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH.</a> European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).</li>
<li>Haworth, R. A., Hunter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ca2%2B-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+II.+Nature+of+the+Ca2%2B+trigger+site%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).</li>
<li>Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin+A+binding+to+mitochondrial+cyclophilin+inhibits+the+permeability+transition+pore+and+protects+hearts+from+ischaemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).</li>
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<li>Petronilli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+long-lasting+openings+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+can+be+monitored+directly+in+intact+cells+by+changes+in+mitochondrial+calcein+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence.</a> Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Dieses Papier beschreibt eine Methode zur Beurteilung der offenen Wahrscheinlichkeit des mPTP. Insbesondere wurde die Spannungsschwelle für die mPTP-Öffnung mit niedriger Leitfähigkeit bestimmt, indem die Wirkung der CsA-Hemmung auf das Protonenleck über einen Bereich von ΔΨs bewertet wurde. Mit dieser Technik konnten wir Unterschiede im Spannungs-Gating des mPTP zwischen FXS-Mäusen und FVB-Kontrollen identifizieren, die mit ihren Unterschieden im gewebespezifischen CoQ-Gehalt übereinstimmen. Entscheidend für den Erfolg ...

Das mPTP vermittelt den Permeabilitätsübergang (PT), wobei das IMM abrupt durchlässig für kleine Moleküle und gelösteStoffe 1,2 wird. Dieses auffällige Phänomen ist eine deutliche Abkehr von der charakteristischen Undurchlässigkeit des IMM, die für die Bestimmung des für die oxidative Phosphorylierung notwendigen elektrochemischen Gradienten von grundlegender Bedeutung ist3. PT ist im Gegensatz zu anderen mitochondrialen Transportmechanismen ein unspezifisches und nichtselektives Verfahren mit hoher Leitfähigkeit, das die Passage einer Reihe von Molekülen bis zu 1,5 kDa 4,5 ermöglicht. Der mPTP ist ein spannungsgesteuerter Kanal innerhalb des IMM, dessen Öffnung ΔΨ, ATP-Produktion, Calciumhomöostase, Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und Zelllebensfähigkeit4 verändert.
Im pathologischen Extrem führt die unkontrollierte und verlängerte Öffnung von mPTP mit hoher Leitfähigkeit zum Kollaps des elektrochemischen Gradienten, zur Matrixschwellung, zum Abbau der Matrixpyridinnukleotide, zum äußeren Membranbruch, zur Freisetzung von Intermembranproteinen (einschließlich Cytochrom c) und schließlich zum Zelltod 4,6. Eine solche pathologische mPTP-Öffnung wurde mit Herzischämie-Reperfusionsverletzung, Herzinsuffizienz, traumatischer Hirnverletzung, verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen und Diabetes 1,7 in Verbindung gebracht. Die mPTP-Öffnung mit niedrigem Leitwert ist jedoch physiologischer Natur und führt im Gegensatz zur Öffnung mit hoher Leitfähigkeit nicht zu einer tiefgreifenden Depolarisation oder mitochondrialen Schwellung4.
Die geringe Leitfähigkeitsöffnung der Pore schränkt die Permeabilität auf ~ 300 Da ein, ermöglicht die Passage von Protonen unabhängig von der ATP-Synthese und ist eine potenzielle Quelle für physiologisches Protonenleck5. Die physiologische mPTP-Öffnung verursacht einen kontrollierten Rückgang von ΔΨ, erhöht den Elektronenfluss durch die Atemtransportkette und führt zu einem kurzen Ausbruch oder Blitz von Superoxid, was zur ROS-Signalgebung8 beiträgt. Die Regulation einer solchen vorübergehenden mPTP-Öffnung ist wichtig für die Calciumhomöostase und die normale Zellentwicklung und -reifung 4,9,10,11. Die vorübergehende Porenöffnung in sich entwickelnden Neuronen löst beispielsweise eine Differenzierung aus, während der Verschluss des mPTP die Reifung in unreifen Kardiomyozyteninduziert 4,5.
Obwohl die funktionelle Bedeutung des mPTP für Gesundheit und Krankheit gut etabliert ist, bleibt seine genaue molekulare Identität umstritten. Die Fortschritte bei der molekularen Struktur und Funktion des mPTP wurden an anderer Stelleumfassend überprüft 12. Kurz gesagt, derzeit wurde angenommen, dass Hoch- und Niedrigleitfähigkeitszustände des mPTP durch verschiedene Entitätenvermittelt werden sollen 12. Die führenden Kandidaten sind die F1/F0-ATP-Synthase (ATP-Synthase) und der Adenin-Nukleotidtransporter (ANT) für Hoch- bzw. Low-Conductance-Modi12.
Trotz des fehlenden Konsenses über die genaue Identität der porenbildenden Komponente des mPTP wurden bestimmte Schlüsselmerkmale detailliert beschrieben. Ein etabliertes Merkmal des mPTP ist, dass es durch den elektrochemischen Gradienten so reguliert wird, dass die Depolarisation des IMM zur Porenöffnung13 führt. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass der Redoxzustand von vizinalen Thiolgruppen das Spannungsgating des mPTP so verändert, dass die Oxidation die Pore bei relativ höheren ΔΨs öffnet und die Reduktion der Thiolgruppe zu einer geschlossenen mPTP-Wahrscheinlichkeitvon 14 führt. Die Identität des proteinhaltigen Spannungssensors ist jedoch unbekannt.
Verschiedene kleine Moleküle, die die offene Wahrscheinlichkeit der Pore modulieren, wurden identifiziert. Zum Beispiel kann das mPTP stimuliert werden, sich mit Kalzium, anorganischem Phosphat, Fettsäuren und ROS zu öffnen und kann durch Adeninnukleotide (insbesondere ADP), Magnesium, Protonen und CsA 5,12 gehemmt werden. Die Wirkmechanismen einiger dieser Regulierungsbehörden wurden aufgeklärt. Mitochondriales Calcium löst die mPTP-Öffnung zumindest teilweise aus, indem es an die β-Untereinheit derATP-Synthase 15 bindet. ROS kann das mPTP aktivieren, indem es seine Affinität für ADP verringert und seine Affinität für Cyclophilin D (CypD), den am besten untersuchten proteinhaltigen mPTP-Aktivator16, erhöht. Der Mechanismus der Aktivierung des mPTP durch anorganisches Phosphat und Fettsäuren ist weniger klar. Bei endogenen Inhibitoren wird angenommen, dass ADP das mPTP durch Bindung an die ANT- oder ATP-Synthase hemmt, während Magnesium seine hemmende Wirkung ausübt, indem es Kalzium von seiner Bindungsstelle verdrängt15,17,18,19.
Ein niedriger pH-Wert hemmt die mPTP-Öffnung durch Protonierung von Histidin 112 der regulatorischen OSCP-Untereinheit (Oligomycin Sensitivity-Conferring Protein) der ATP-Synthase 12,20,21. Der prototypische pharmakologische Inhibitor des mPTP, CsA, wirkt, indem er CypD bindet und seine Assoziation mit OSCP22,23 verhindert. Frühere Arbeiten haben auch gezeigt, dass eine Vielzahl von CoQ-Analoga mit dem mPTP interagieren, es hemmen oder aktivieren24. In neueren Arbeiten fanden wir Hinweise auf ein pathologisch offenes mPTP, ein übermäßiges Protonenleck und eine ineffiziente oxidative Phosphorylierung aufgrund eines CoQ-Mangels in den Mitochondrien des Vorderhirns von neugeborenen FXS-Mauswelpen25.
Der Verschluss der Pore mit exogenem CoQ blockierte das pathologische Protonenleck und induzierte die morphologische Reife der dendritischen Stacheln25. Interessanterweise wiesen FXS-Kardiomyozyten bei denselben Tieren im Vergleich zu Wildtypkontrollen übermäßige CoQ-Spiegel und eine geschlossene mPTP-Wahrscheinlichkeit auf26. Obwohl die Ursache für diese gewebespezifischen Unterschiede in den CoQ-Spiegeln unbekannt ist, unterstreichen die Ergebnisse das Konzept, dass endogenes CoQ wahrscheinlich ein Schlüsselregulator des mPTP ist. Es gibt jedoch eine große Lücke in unserem Wissen, da der Mechanismus der CoQ-vermittelten Hemmung des mPTP unbekannt bleibt.
Die Regulation des mPTP ist eine kritische Determinante der Zellsignalisierung und des Überlebens4. Daher ist der Nachweis der mPTP-Öffnung in den Mitochondrien der Schlüssel zur Berücksichtigung spezifischer pathophysiologischer Mechanismen. Typischerweise wird der Schwellenwert für die Porenöffnung mit hoher Leitfähigkeit unter Verwendung von Kalzium bestimmt, um den Permeabilitätsübergang auszulösen. Eine solche Kalziumbelastung führt zum Kollaps des Membranpotentials, zur schnellen Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung und zur mitochondrialen Schwellung27,28. Wir haben versucht, eine Methode zu entwickeln, um die mPTP-Öffnung mit niedrigem Leitwert in situ nachzuweisen, ohne sie per se zu induzieren.
Der Ansatz nutzt die Rolle des mPTP als Protonenleckkanal aus. Zu diesem Zweck wurden Ionenselektivelektroden vom Clark-Typ und TPP+ verwendet, um gleichzeitig den Sauerstoffverbrauch bzw. das Membranpotential in isolierten Mitochondrien während der Leckatmung zu messen29. Der Schwellenwert für die mPTP-Öffnung wurde durch den Beginn der CsA-vermittelten Hemmung des Protonenlecks bei spezifischen Membranpotentialen bestimmt. Mit diesem Ansatz wurden Unterschiede im Spannungs-Gating des mPTP im Kontext des CoQ-Überschusses genau definiert.

<table><tbody><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Angepasste Kolbenbaugruppe für pH- oder ionenselektive Elektroden zur Verwendung mit OXYT1</td><td>PP-Systemen</td><td>941039</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic PE-Schläuchen, PE 50, 0,023 Zoll 10 Fuß.</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-11B</td><td>, um die Länge der Hamilton-Spritze nach Bedarf zu modifizieren</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA). Fettsäurefrei</td><td>Sigma</td><td>A7030-10G</td><td></td></tr><tr><td>Dri-Ref Referenzelektrode, 2 mm</td><td>World Precision Inst. LLC</td><td>DRIREF-2</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenhalter für KWIK-Tips</td><td>World Precision Inst. LLC</td><td>KWIK-2</td><td>&nbsp; ionenselektiver Elektrodenhalter</td></tr><tr><td>Ethylenglykol-bis(&beta;-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraessigsäure&nbsp; (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J</td><td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td><td></td><td>FXS-Mäuse, Fmr1 KO&nbsp;</td></tr><tr><td>FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ</td><td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td><td></td><td>FVB-Mäuse</td></tr><tr><td>Hamilton 80366 Standardspritzen, 10 μl, zementierte Nadel, 6/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07938-30</td><td>Mikrospritze</td></tr><tr><td>Hamilton 80500 Standard-Mikroliterspritzen, 50 μl,</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07938-02</td><td>Mikrospritze</td></tr> <tr><td>mit zementierter NadelHansatech Instruments Oxytherm+ System (Atmung) Komplette</td><td>PP-Systeme</td><td>OXYTHERM+R</td><td>Sauerstoffelektrode und Software</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>1374248</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td></td><td>Sigma M9546-250G</td><td></td></tr><tr><td>P1,P5-diadenosin-5&prime; Pentaphosphat Pentasodium (AP5A)</td><td>Sigma</td><td>D4022-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P1644</td><td>Medium für die Trennung von Dichtegradienten</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)</td><td>Sigma</td><td>5.43841</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>TPP+ Elektrodenspitzen (3)</td><td>World Precision Inst. LLC</td><td>TIPTPP</td><td></td></tr></tbody></table>

beurteilung der offenen wahrscheinlichkeit der mitochondrialen permeabilitätsübergangspore im setting des coenzym-q-Überschusses

Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess

Die mitochondriale Permeabilitätsübergangspore (mPTP) ist ein spannungsgesteuerter, nicht selektiver, innerer mitochondrialer Membran (IMM) Megakanal, der für Gesundheit und Krankheit wichtig ist. Das mPTP vermittelt das Austreten von Protonen über das IMM während der Öffnung mit niedriger Leitfähigkeit und wird spezifisch durch Cyclosporin A (CsA) gehemmt. Coenzym Q (CoQ) ist ein Regulator des mPTP, und gewebespezifische Unterschiede wurden im CoQ-Gehalt und in der offenen Wahrscheinlichkeit des mPTP in Vorderhirn- und Herzmitochondrien in einem neugeborenen Mausmodell des fragilen X-Syndroms (FXS, Fmr1-Knockout ) gefunden. Wir haben eine Technik entwickelt, um die Spannungsschwelle für die mPTP-Öffnung in diesem mutierten Stamm zu bestimmen, wobei wir die Rolle des mPTP als Protonenleckkanal ausnutzen.
Dazu wurden Sauerstoffverbrauch und Membranpotential (ΔΨ) gleichzeitig in isolierten Mitochondrien mittels Polarographie und einer Tetraphenylphosphonium (TPP+) ionenselektiven Elektrode während der Leckatmung gemessen. Der Schwellenwert für die mPTP-Öffnung wurde durch den Beginn der CsA-vermittelten Hemmung des Protonenlecks bei spezifischen Membranpotentialen bestimmt. Mit diesem Ansatz wurden Unterschiede im Spannungs-Gating des mPTP im Kontext des CoQ-Exzesses genau definiert. Diese neuartige Technik wird zukünftige Untersuchungen ermöglichen, um das Verständnis der physiologischen und pathologischen Regulation der Öffnung des mPTP mit niedriger Leitfähigkeit zu verbessern.

TypischeO2-Verbrauchs- und ΔΨ-Kurven, die in diesen Experimenten erzeugt wurden, sind dargestellt (Abbildung 1A,B). Der logarithmische Rückgang des Spannungssignals mit TPP+-Kalibrierung wird zu Beginn jedes Experiments angezeigt. Das Fehlen dieses logarithmischen Musters kann auf ein Problem mit der selektiven TPP+-Elektrode hindeuten. Mitochondrien erzeugen typischerweise ΔΨ unmittelbar nach Zugabe zum Atmungspuffer. ΔΨ kann aus Änderungen ...

Diese Methode nutzt den Beitrag der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore zum Protonenleck mit niedriger Leitfähigkeit, um die Spannungsschwelle für die Porenöffnung bei neonatalen Fragile-X-Syndrom-Mäusen mit erhöhtem mitochondrialem Coenzym-Q-Gehalt im Vergleich zur Wildtypkontrolle zu bestimmen.

Beurteilung der offenen Wahrscheinlichkeit der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore im Setting des Coenzym-Q-Überschusses

The mitochondrial permeability transition pore (mPTP) is a voltage-gated, nonselective, inner mitochondrial membrane (IMM) mega-channel important in ...

Dieses Protokoll bietet eine neue Möglichkeit, die niedrige Leitfähigkeitsöffnung der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine einfache Möglichkeit bietet, die offene Wahrscheinlichkeit der Pore als Funktion des mitochondrialen Membranpotentials zu messen. Diese Technik kann leicht auf Mitochondrien angewendet werden, die aus jedem Organsystem und jeder Spezies isoliert sind.Beginnen Sie mit der Kalibrierung der Sauerstoffelektrode, indem Sie einen Tropfen von 50% Kaliumchlorid-Elektrolytlösung auf die Kuppel der Elektrodenscheibe legen. Legen Sie ein kleines Stück von zwei Quadratzentimetern Zigarettenpapier-Abstandshalter, der mit einem etwas größeren Stück Polytetrafluorethylenmembran bedeckt ist, über den Elektrolyttropfen. Verwenden Sie dann das Applikatorwerkzeug, um den kleinen Elektrodenscheiben-O-Ring über die Kuppel der Elektrode zu schieben.Als nächstes füllen Sie das Reservoir gut mit der Elektrolytlösung auf. Platzieren Sie den größeren O-Ring in der Aussparung um die Elektrodenscheibe. Installieren Sie dann die Disc in der Elektrodenkammer und schließen Sie sie an die Steuereinheit an.Geben Sie zwei Milliliter luftgesättigtes entionisiertes Wasser und den mit Polytetrafluorethylen beschichteten Magneten in die Reaktionskammer. Wenn Sie fertig sind, schließen Sie die Kammer an die Rückseite der Steuereinheit an. Stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius und die Rührgeschwindigkeit auf 100 Grad ein.Lassen Sie die Systemtemperatur vor der Kalibrierung 10 Minuten lang ausgleichen. Nachdem Sie die richtige Temperatur, Rührgeschwindigkeit und den richtigen Druck sichergestellt haben, wählen Sie auf der Registerkarte Kalibrierung die Option Flüssigkeitsphasenkalibrierung aus, um eine Flüssigphasenkalibrierung durchzuführen. Drücken Sie dann OK und warten Sie, bis das Signal ein Plateau erreicht hat.Sobald das Plateau erreicht ist, drücken Sie OK. Dann fügen Sie etwa 20 Milligramm Natriumdithionit hinzu, um Null Sauerstoff in der Kammer zu etablieren. Drücken Sie erneut OK und warten Sie, bis das Signal ein Plateau erreicht hat, bevor Sie auf die Schaltfläche Speichern klicken, um die Kalibrierung zu akzeptieren. Um die tetraphenylphosphonium- oder TPP-selektive Elektrodenanordnung herzustellen, füllen Sie die TPP-selektive Elektrodenspitze mit einer 10-millimolaren TPP-Lösung unter Verwendung einer Spritze und einer flexiblen Nadel.Vermeiden Sie Luftblasen beim Befüllen der Elektrodenspitze. Lösen Sie die Elektrodenhalterkappe, um die interne Referenzelektrode in die TPP-Spitze einzuführen. Wenn Sie fertig sind, montieren Sie die TPP-selektive Elektrodenvorrichtung, einschließlich der Referenzelektrode und des Elektrodenhalters.Ziehen Sie die Kappe fest, um die Spitze zu sichern. Schließen Sie dann das Kabel an den AUX-Port der Steuerbox und den TPP-Elektrodenhalter an. Setzen Sie die TPP-selektiven und Referenzelektroden in die angepasste Kolbenbaugruppe für ionenselektive Elektroden ein.Schließen Sie die Referenzelektrode an den Referenzport der Steuerbox an. Als nächstes, um die Reaktionskammer vorzubereiten, fügen Sie einen Milliliter des Reaktionsgemisches in die Reaktionskammer hinzu, ohne Luftblasen zu erzeugen. Schließen Sie die Kammer mit der angepassten Kolbenbaugruppe mit den TPP-selektiven und Referenzelektroden.Sobald die Kammer geschlossen ist, führen Sie zusätzliche Reagenzien direkt in die Reaktionskammer ein, indem Sie separate Mikrospritzen verwenden, die mit Kunststoffschläuchen modifiziert sind. Wenn die Einrichtung abgeschlossen ist, wählen Sie Gehe zu, um die Aufnahme zu starten. Sobald ein stabiles Spannungssignal erhalten wurde, kalibrieren Sie die TPP-selektive Elektrode, indem Sie ein Mikromolar-Inkrement einer 0,1-millimolaren TPP-Lösung hinzufügen, um eine Endkonzentration von drei Mikromolaren zu erreichen.Beobachten Sie den logarithmischen Rückgang des TPP-Spannungssignals bei jeder Addition. Nach der Stabilisierung der Sauerstoff- und TPP-Spuren werden 100 Mikrogramm frisch zubereitete Kardiomyozytenmitochondrien über den Reagenzzugabeanschluss in der Kolbenanordnung in die Reaktionskammer gegeben, bis zu einer Endkonzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter. Beobachten Sie die Abnahme des Sauerstoffgehalts in der Kammer, wenn die Mitochondrien energetisiert werden und Sauerstoff verbrauchen.Sehen Sie auch den abrupten Anstieg des TPP-Spannungssignals, da die Mitochondrien ein Membranpotential erzeugen und TPP aus der Lösung aufnehmen. Dann fügen Sie 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Oligomycin hinzu, um die Atmung des Zustands 4 zu induzieren. Um die offene Wahrscheinlichkeit der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore (mPTP) zu beurteilen, beobachten Sie den Rückgang des Membranpotentials im Laufe der Zeit während der Leckrespiration.Sobald das gewünschte Membranpotential erreicht ist, fügen Sie ein mikromolares Cyclosporin A als mPTP-Inhibitor in die Reaktionskammer ein, um die offene Wahrscheinlichkeit des mPTP bei diesem spezifischen Membranpotential zu bewerten. Messen Sie dann die Wirkung von Cyclosporin A auf den Sauerstoffverbrauch und das Membranpotential vor und nach der Cyclosporin-A-Addition. In den repräsentativen Kurven des gleichzeitigen Sauerstoffverbrauchs und des Membranpotentials wurde das hohe Membranpotential auf Null, das mittlere auf fünf und das niedrige auf 10 Millivolt relativ zum zweimikromolaren TPP-Kalibrierniveau festgelegt.Die Mitochondrien bei null Millivolt zeigten eine geschlossene Wahrscheinlichkeit von 100% mPTP und bei 10 Millivolt eine offene Wahrscheinlichkeit von 100%. Nach der Oligomycin-Addition wurde kein signifikanter Unterschied im Sauerstoffverbrauch beobachtet, was darauf hindeutet, dass Adenosintriphosphat oder ATP-Synthase minimal zur Atmung von Zustand 2 beiträgt. Weiterhin wurden die Sauerstoffverbrauchsrate und das Membranpotential vor und nach der Cyclosporin-A-Zugabe verglichen.Eine Abnahme des Sauerstoffverbrauchs und eine Erhöhung der Stabilisierung des Membranpotentials deuteten auf den Verschluss eines offenen mPTP hin. Wenn das mPTP geschlossen ist, gab es keine Abnahme der Sauerstoffverbrauchsrate und das Membranpotential sank weiter. Die Ergebnisse zeigten ähnliche geschlossene und offene mPTP-Wahrscheinlichkeiten bei hohen und niedrigen Membranpotentialen in den FVB-Kontroll- und Fmr1-Knockout-Herzmitochondrien.Am intermediären Membranpotential zeigten die Fmr1-Knockout-Herzmitochondrien eine erhöhte geschlossene mPTP-Wahrscheinlichkeit im Vergleich zu den FVB-Kontrollen. Es dürfen keine Luftblasen in die Kammer eingeführt werden, da dies zu instabilen Sauerstoffverbrauchswerten führt und die Interpretation erschwert. Nach diesem Verfahren kann die Calciumbeladungskapazität gemessen werden.Diese Methode bewertet die hohe Leitfähigkeitsöffnung der Pore und ergänzt die Ergebnisse unserer Technik.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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