Name: Nachweis des Wolbachia-Stammes wAlbB in Aedes albopictus-Zelllinien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Lernen Sie vier komplementäre Methoden zum Nachweis intrazellulärer Wolbachia in Aedes albopictus-Zelllinien. Dieses Protokoll verbessert die Nachweisgenauigkeit und unterstützt die Erforschung von Wolbachia-Wirt-Interaktionen in der Mikrobiologie.

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Wir danken Dr. Xin-Ru Wang von der University of Minnesota für aufschlussreiche Anregungen und Anleitungen. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Natural Science Foundation of China (No.81760374) unterstützt.

1. Materialien und Reagenzien
<ol><li>Verwenden Sie pyrogenfreie Lösungen und Medien für die Zellkultur (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Verwenden Sie Reinstwasser, um alle Lösungen vorzubereiten.</li>
	<li>Seien Sie vorsichtig bei der Auswahl von fetalem Rinderserum (FBS) für die Zellkultur nach einem Lot-Check-Prozess. HINWEIS: Da FBS-Chargen regelmäßigen Änderungen unterliegen, ist es unmöglich, den entsprechenden Katalog und die Chargennummern in diesem Protokoll anzugeben.</li>
	<li>Wählen Sie Aa23-Zellstämme, die aus A. albopictus-Eiern stammen und dem Wolbachia-freien Aa23-T entsprechen.</li>
</ol>2. Zellkultur
<ol><li>Bereiten Sie 25 cm2 Zellkulturflaschen mit 4 ml Schneider's Medium mit 10% FBS vor.</li>
	<li>Die Kolben werden bei 28 °C unter einer CO2 -% Atmosphäre für 5 bis 7 Tage 7,24 inkubiert.</li>
	<li>Beobachten Sie ungefärbte Aa23- und Aa23-T-Zellen in den Kolben mittels Lichtmikroskopie bei 100-facher Vergrößerung (Abbildung 1).</li>
</ol>3. DNA-Extraktion
<ol><li>Kultivieren Sie die Zellen für 5-7 Tage bis zu 70-80% Konfluenz pro Kolben (Schritt 2). Ernten Sie die Zellen mit manueller Pipettierung aus 1 ml resuspendiertem Kulturmedium durch Zentrifugation für 5 min bei 100 × g in einer Mikrozentrifuge.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand durch Absaugung und lagern Sie das resultierende Zellpellet bei -20 °C.</li>
	<li>Die Pellets werden in 0,40 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert, 50 μL der Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, 5 μL Proteinase K (20 mg/ml) zugegeben und bei 55 °C für 1 h inkubiert. Schließlich erhitzen Sie diese Röhren bei 99 ° C für 15 Minuten, um die rohe DNA zu erhalten und bei -20 ° C zu lagern.</li>
</ol>4. Nachweis von Wolbachia-Nukleinsäure
<ol><li>PCR-Analyse<ol>
<li>Durchführung einer PCR in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 μL, bestehend aus 8 μL ddH2O, 10 μL Taq-Polymerase (siehe Materialtabelle), 1 μL DNA-Vorlage (aus Schritt 3), 0,5 μL Vorwärts- und Rückwärtsprimern (10 μM): wsp81 F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') und wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, beziehungsweise.</li>
		<li>Verwenden Sie die folgenden PCR-Bedingungen: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 5 min, gefolgt von 35 Denaturierungszyklen bei 94 °C, Glühen bei 55 °C und Verlängerung bei 72 °C; dann eine letzte Verlängerung bei 72 °C für 7 min.</li>
		<li>Nachweis der DNA auf einem 1% Agarosegel (1% w/v Agarose in PBS) mit einem Gel-Imager.</li>
	</ol></li>
	<li>qPCR-Analyse<ol>
<li>Analysieren Sie die Wolbachia-Genomkopie auf drei biologische Replikate (n = 6) aus der extrahierten DNA (Schritt 3) mit den wsp-Primern 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') und QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22, normalisiert mit ribosomalen S6 (RPS6) Vorwärts- und Rückwärtsprimern (5' GAAGTTGAACGTATCGTC 3' bzw. 5' GAGATGGTCAGCGGTGTT 3')3.</li>
		<li>Generieren Sie eine Standardkurve für wAlbB und RPS6.<ol>
<li>Extrahieren Sie DNA aus PMD-18T (ein spezieller Vektor für die effiziente Klonierung von PCR-Produkten (TA-Klonierung)) Rekombinantes Plasmid mit WSP - und RPS6-Genfragmenten (Supplemental File) und messen Sie die DNA-Konzentration des Plasmids (siehe Materialtabelle).</li>
			<li>Wandeln Sie die DNA-Konzentration des Plasmids mit Eq (1) in die Kopienzahlkonzentration um. Plasmid-Kopiennummer = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63662/63662eq01v3.jpg"> (1)</li>
			<li>Verdünnen Sie die Plasmidkopienzahl von 101 auf 108 mit Reinstwasser und legen Sie 3 Replikate für jeden Konzentrationsgradienten fest.</li>
			<li>Führen Sie eine qPCR-Verstärkung mit TB Green und einem real-time PCR-System durch (siehe Materialtabelle) und zeichnen Sie die Ergebnisse jeder Reaktion auf. Verwenden Sie den Wert Ct, um eine Standardkurve zu entwickeln. Analysieren Sie die DNA in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 μL, umfassend 7 μL ddH2O, 10,4 μL TB Green (siehe Materialtabelle), 1 μL DNA-Vorlage (bereitgestellt durch Schritt 3) und 0,8 μL Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 μM). Verwenden Sie die folgenden Reaktionsbedingungen: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 5 min, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 10 s und Glühen bei 60 °C für 35 s.</li>
			<li>Berechnen Sie die WSP- und RPS6-Genkopienzahlen in den Zellen gemäß der etablierten Standardkurve und die Wolbachia-relative Dichte anhand der Kopierzahl von wsp/RPS6. Analysieren Sie die Daten mit einem unabhängigen Stichproben-t-Test.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Western-Blot-Analyse des Wolbachia-Proteins<ol>
<li>Proteinextraktion<ol>
<li>Sammeln Sie 2 × 107 Aa23- und Aa23-T-Zellen von der Sechs-Well-Platte (aus Schritt 2) in einem Mikrozentrifugenröhrchen, waschen Sie sie dreimal mit PBS und zentrifugieren Sie sie bei 100 × g für 5 min bei 4 °C.</li>
			<li>Es werden 1 ml Lysate mit RIPA-Lysepuffer (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 1 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat [SDS], 2 mM Natriumpyrophosphat, 25 mM β-Glycerophosphat, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 0,5 μg/ml Leupeptin) und PMSF (Endkonzentration 1 mM) hergestellt.</li>
			<li>Geben Sie 200 μL Lysepuffer in das Zellpellet und halten Sie es 30 Minuten auf Eis. Die Lysate bei 12.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ermitteln Sie die WSP-Konzentration des Überstands mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Protein-Assay-Kit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Laden Sie gleiche Mengen Protein auf ein 15% SDS-PAGE Gel [10% destilliertes Wasser; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8,8; 1% (10% SDS), 1% (10% Ammoniumpersulfat), 0,04% TEMED].</li>
		<li>Übertragen Sie das Protein auf Nitrocellulosemembranen, blockieren Sie die Membranen mit 5% Magermilch für 2 h 26,27 bei Raumtemperatur und waschen Sie die Membranen dann dreimal mit TBST (1 ml Tween20 in 1 L TBS) (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Inkubieren Sie die Membranen über Nacht bei 4 °C mit 100 μL polyklonalem Anti-WSP-Antikörper (intern hergestellt, siehe Ergänzungsdatei)), hergestellt durch Verdünnung des primären Antikörpers mit 5% Magermilch (1:12.000).</li>
		<li>Waschen Sie den primären Antikörper dreimal mit TBST.</li>
		<li>Die Membranen in 100 μL Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper auf einem Shaker für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Membranen dreimal mit TBST und mischen Sie 20 μL Lösung A (HRP-Substratluminol-Reagenz) und 20 μL Lösung B (HRP-Substratperoxid-Reagenz) im Chemilumineszenz-Detektionskit im Verhältnis 1:1. Tauchen Sie die gesamte Membran gleichzeitig in die Lumineszenzlösung ein und beobachten Sie die Signale mit einem multifunktionalen Bildgebungssystem.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunfluoreszenzlokalisation des Wolbachia-Proteins<ol>
<li>Inkubieren Sie 5 × 10 5Aa23- und Aa23-T-Zellen bei 28 °C auf einer konfokalen Laser-Petrischale mit einer Dicke von 0,17 mm am Boden unter einer CO 2-Atmosphäre von5% für 3 bis 4 Tage 7,24. Warten Sie, bis die Zelle zu 60% -70% zusammenfließt, und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.</li>
		<li>Fixieren Sie die Zellen für 20 min bei 4 ° C in 1 ml 4% (w / v) Paraformaldehyd in PBS.</li>
		<li>Waschen Sie die festen Zellen mit PBST (0,2% v/v Triton X-100 in PBS) für 5 min und waschen Sie die Zellen erneut zweimal mit PBS.</li>
		<li>Die Objektträger für 1 h bei 37 °C in 1 ml 3% (w/v) Rinderserumalbumin in PBS inkubieren.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht in 100 μL Maus-Anti-WSP-Polyklonal-Antikörper (intern hergestellt) und Mausserum (1:1.000 Verdünnung in PBS) in einer Nassbox (es kann Feuchtigkeit aufrechterhalten und verhindern, dass Feuchtigkeit verdunstet) bei 4 ° C.</li>
		<li>Entfernen Sie die Dias aus der nassen Box und bringen Sie sie auf Raumtemperatur zurück; Waschen Sie sie dreimal mit PBS und entfernen Sie die PBS. HINWEIS: Ab Schritt 4.4.7 müssen alle Vorgänge vor Licht geschützt werden.</li>
		<li>Bebrüten Sie die Objektträger mit 100 μL eines Alexa Fluor 488-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörpers (1:2.000 Verdünnung in PBS) bei 37 °C für 30 min.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Probenobjektträger mit 50 μL 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI verdünnt in PBS auf 10 μg/ml, bindet stark an DNA) bei 37 °C für 5 min und waschen Sie sie dann dreimal mit PBS.</li>
		<li>Beobachten Sie die Immunfärbung unter einem konfokalen Mikroskop.<ol>
<li>Schalten Sie die Stromversorgung und den Laser ein.</li>
			<li>Schalten Sie die normalen und Quecksilberlampen des Mikroskops ein.</li>
			<li>Starten Sie das System und führen Sie die Betriebssoftware aus. Legen Sie einen Tropfen Zedernöl auf die Objektträger, legen Sie die Objektträger auf den Mikroskoptisch und bewegen Sie den Tisch an die entsprechende Position.</li>
			<li>Klicken Sie auf die Beobachtungsschaltfläche der Quecksilberlampe in der Software, öffnen Sie den Auslöser der Quecksilberlampe und beobachten Sie die Probe unter einem umgekehrten Mikroskop, um zu fokussieren.</li>
			<li>Verwenden Sie das manuelle Bedienfeld , um grüne und blaue Fluoreszenz auszuwählen, um Fluoreszenzfotos unter 100-facher Vergrößerung aufzunehmen.</li>
			<li>Schalten Sie die Beobachtungstaste für die Quecksilberlampe aus und beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern.</li>
			<li>Um eine gute Bildqualität zu gewährleisten, scannen Sie nach Scangröße (512 Pixel x 512 Pixel). Passen Sie die Scangröße an, um klare Bilder zu erhalten (1.024 Pixel x 1.024 Pixel).</li>
			<li>Führen Sie eine Rauschunterdrückung durch, wenn die Hintergrundgeräusche zu hoch sind.</li>
			<li>Stoppen Sie das Scannen und speichern Sie die Bilder.</li>
			<li>Schalten Sie die Quecksilberlampe und die Laser aus.</li>
			<li>Wischen Sie das Ziel mit 75% Alkohol ab und senken Sie das Ziel auf die niedrigste Position.</li>
			<li>Schalten Sie den Verschluss und das Mikroskop aus.</li>
			<li>Nachdem das Instrument abgekühlt ist, bedecken Sie es mit der Staubschutzabdeckung.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li>
<li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li>
<li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immunofluorescence%2C+Western+blotting%2C+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Der Nachweis einer intrazellulären Wolbachia-Infektion ist essentiell für die Untersuchung von Wolbachia-Wirt-Interaktionen und die Bestätigung einer erfolgreichen Transfektion von Zellen mit neuartigen Stämmen. In diesem Protokoll wurden vier Methoden verwendet, um eine intrazelluläre Wolbachia-Infektion auf Nukleinsäure- und Proteinebene erfolgreich nachzuweisen. Diese vier experimentellen Methoden bestätigten und verbesserten die Nachweisgenauigkeit der Wolbachia-Infektion von Zelle...

Die Asiatische Tigermücke Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), die in Asien und anderen Teilen der Welt ein Schlüsselvektor des Dengue-Virus (DENV) ist1, ein natürlicher Wirt von zwei Arten der intrazellulären Bakterien, Wolbachia (w AlbA und wAlbB), die über die Keimbahn und das somatische Gewebe verteilt sind 2,3. Die Aa23-Zelllinie, die aus A. albopictus-Embryonen gewonnen wird, besteht aus mindestens zwei morphologischen Zelltypen, die beide die Infektion4 unterstützen und mit Antibiotika (Aa23-T) von einer nativen Wolbachia-Infektion geheilt werden können. Da Aa23 nur wAlbB behält, ist es ein nützliches Modell für die Untersuchung von Wirt-Endosymbionten-Interaktionen 4,5,6.
Wolbachia wird mütterlich übertragen und infiziert schätzungsweise 65% der Insektenarten 8,9 und 28% der Mückenarten10. Es infiziert eine Vielzahl von Geweben und bildet eine intime symbiotische Beziehung mit dem Wirt, die normalerweise zytoplasmatische Inkompatibilität (CI)11 und Populationsersatz durch Manipulation des Wirtsfortpflanzungssystems12,13 induziert. Diese Wirtsreaktionen wurden in natürlichen Populationen von Drosophila simulans14 und in A. aegypti in einem Laborkäfig und Feldversuch15 beobachtet. Eine wichtige nichtreproduktive Manipulation, die durch Wolbachia ausgelöst wird, ist die induzierte Wirtsresistenz gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern, einschließlich DENV, Chikungunya-Virus (CHIKV) und West-Nil-Virus (WNV) 16,17, die durch ein verbessertes angeborenes Immunsystem des Symbiontenvermittelt werden können 18,19, die Konkurrenz zwischen Wolbachia und Viren um essentielle Wirtsressourcen 20 und die Manipulation von viralen Abwehrwegen des Wirts 21 .
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um diese zugrunde liegenden Mechanismen der antiviralen Reaktionen des Wolbachia-induzierten Wirts zu untersuchen. Es verwendet vier Methoden zum Nachweis der intrazellulären Wolbachia-Infektion von Aa23-Zellen. Diese Methoden bieten eine starke theoretische Grundlage für Studien zur intrazellulären Wolbachia-Infektion anderer Wirtsarten. Die erste Methode, die PCR - eine leistungsstarke Technik, die die enzymatische Amplifikation bestimmter DNA-Regionen ohne Verwendung herkömmlicher Klonierungsverfahren ermöglicht - wurde verwendet, um Wolbachia-DNA nachzuweisen und das Vorhandensein / Fehlen einer Wolbachia-Infektion zu bestimmen 22. Die zweite Methode misst die Wolbachia-DNA-Kopierdichte mittels quantitativer PCR (qPCR) für den zuverlässigen Nachweis und die Messung von Produkten, die während jedes PCR-Zyklus erzeugt werden, der direkt proportional zur Menge der Vorlage vor PCR23 ist. Die dritte Methode erkennt das Vorhandensein von intrazellulären Wolbachia-Proteinen unter Verwendung von Western Blot - einem der leistungsfähigsten Werkzeuge zum Nachweis spezifischer Proteine in komplexen Gemischen, indem es die hohe Trennleistung der Elektrophorese, die Spezifität von Antikörpern und die Empfindlichkeit chromogener enzymatischer Reaktionen kombiniert. Die letzte Methode ist ein Immunfluoreszenz-Assay (IFA), der Immunologie, Biochemie und Mikroskopie kombiniert, um das Wolbachia-Oberflächenprotein (wsp) durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion nachzuweisen, um die zelluläre Aufnahme von Wolbachia zu bestätigen und seine zelluläre Lokalisation zu bestimmen.
Dieses Papier beschreibt die vier oben aufgeführten Methoden, um die Existenz von Wolbachia in den Zellen zu überprüfen, mit denen nachgewiesen werden kann, ob die exogene Wolbachia erfolgreich transfiziert und die Wolbachia in der Zelle beseitigt wurde. Nachdem festgestellt wurde, ob Wolbachia in den Zellen vorhanden ist oder nicht, können verschiedene Analysen durchgeführt werden, einschließlich Genomik, Proteomik oder Metabolomik. Dieses Protokoll demonstriert den Nachweis von Wolbachia durch Aa23-Zellen, kann aber auch in anderen Zellen verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Fisher Scietific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Pipetman</td><td>F167380</td><td>P10</td></tr><tr><td>inSituX Plattform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Analysesoftware <td>Eigenentwickelte</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cer-dotierte Yttrium-Aluminium-Granate</td><td>Supplies</td><td></td><td>Ce:Y3Al5O12, YAG Einkristallsubstrate</td></tr><tr><td>Chiphalter</td><td>Eigenentwickelte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steuerungssoftware</td><td>Eigenentwickeltes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersionsöl</td><td>Cargille Laboratories</td><td>16482</td><td>Typ A niedrige Viskosität 150 cSt</td></tr><tr><td>inSituX-Plattform</td><td>Eigenentwickelte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR-Lichtquelle</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>LED mit Glaslinse, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td></tr><tr><td>Außenring&nbsp;</td><td>Eigenentwickelte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pumplaser</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm, 400 mW und Oslash; 9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td></tr><tr><td>Raspberry Pi</td><td>Raspberry Pi Fundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sicherungsring</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>SM1 Sicherungsring für &Oslash; 1" Linsentuben und Halterungen</td></tr><tr><td>Seedless Quarzkristall</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>25,4 mm Durchmesser Z-Schnitt 0,05 mm Dicke doppelseitig poliert 8 mm auf -X</td></tr><tr><td>Unterlegscheibe</td><td>Eigenentwickelter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Röntgenstrahlanschlag</td><td>Eigenentwicklung</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nachweis des wolbachia-stammes walbb in aedes albopictus-zelllinien

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Als mütterlich beherbergter Endosymbiont infiziert Wolbachia große Teile der Insektenpopulationen. Studien haben kürzlich über die erfolgreiche Regulation der RNA-Virusübertragung mit Wolbachia-transfizierten Moskitos berichtet. Zu den wichtigsten Strategien zur Kontrolle von Viren gehören die Manipulation der Wirtsreproduktion durch zytoplasmatische Inkompatibilität und die Hemmung viraler Transkripte durch Immun-Priming und Konkurrenz um vom Wirt abgeleitete Ressourcen. Die zugrunde liegenden Mechanismen der Reaktionen von Wolbachia-transfizierten Moskitos auf eine Virusinfektion sind jedoch kaum verstanden. Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die In-vitro-Identifizierung von Wolbachia-Infektionen auf Nukleinsäure- und Proteinebene in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-Zellen vor, um das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Wolbachia und seinen Insektenvektoren zu verbessern. Durch die kombinierte Verwendung von Polymerase-Kettenreaktion (PCR), quantitativer PCR, Western Blot und immunologischen Analysemethoden wurde ein morphologisches Standardprotokoll für den Nachweis von Wolbachia-infizierten Zellen beschrieben, das genauer ist als die Verwendung einer einzigen Methode. Dieser Ansatz kann auch auf den Nachweis einer Wolbachia-Infektion in anderen Insektentaxa angewendet werden.

Bevor Wolbachia nachgewiesen wurde, wurden Aa23- und Aa23-T-Zellen unter einem Lichtmikroskop beobachtet, um morphologische Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien zu bestimmen. Aa23- und Aa23-T-Zellen haben mindestens zwei Zellmorphologien, aber keinen offensichtlichen morphologischen Unterschied zwischen den beiden Zelltypen (Abbildung 1). Hier wurden Aa23-Zellen als Modellsystem verwendet, um eine Wolbachia-Infektion mit vier Methoden zu erkennen. Ei...

Vier Methoden wurden verwendet, um intrazelluläre Wolbachia nachzuweisen, die sich gegenseitig ergänzten und die Nachweisgenauigkeit der Wolbachia-Infektion von Aedes albopictus-abgeleiteten Aa23 und Aa23-T, die von nativer Wolbachia-Infektion mit Antibiotika geheilt wurden, verbesserten.

Nachweis des Wolbachia-Stammes wAlbB in Aedes albopictus-Zelllinien

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Dieses Protokoll hilft, die Existenz von Wolbachia in Zellen zu überprüfen, was die Grundlage für das Verständnis der Interaktion zwischen Wolbachia und seinem Host ist. In diesem Protokoll wurden vier Methoden verwendet, um eine intrazelluläre Wolbachia-Infektion erfolgreich nachzuweisen, was die Nachweisgenauigkeit der Wolbachia-Infektion von Zellen bestätigte und verbesserte. Qiuqiu Xiao, ein Doktorand des Schlüssellabors für moderne Pathogenbiologie und -merkmale, wird das Verfahren demonstrieren.Beginnen Sie mit der Beobachtung unbefleckter Aa23- und Aa23-T-Zellen bei 100-facher Vergrößerung mittels Lichtmikroskopie. Kultivieren Sie die Zellen für fünf bis sieben Tage, um 70 bis 80% Konfluenz pro Flasche zu erreichen. Übertragen Sie mit einer Pipette 1 ml des Kulturmediums auf ein Mikrozentrifugenröhrchen.Zentrifugieren Sie bei 100 RCF für fünf Minuten, um die Zellen zu ernten. Entfernen Sie den Überstand und lagern Sie das resultierende Zellpellet bei minus 20 Grad Celsius. Kultivieren Sie die Zellen für fünf bis sieben Tage, um 90 bis 100% Konfluenz pro Kolben zu erreichen.Resuspendieren Sie die Pellets in 0,40 ml PBS und übertragen Sie 50 Mikroliter dieser Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie fünf Mikroliter 20 mg / ml Proteinase K hinzu und inkubieren Sie bei 55 Grad Celsius für eine Stunde. Dann inkubieren Sie die Röhrchen bei 99 Grad Celsius für 15 Minuten, um die rohe DNA zu erhalten und sie bei minus 20 Grad Celsius zu lagern.Um eine PCR durchzuführen, bereiten Sie ein Gesamtreaktionsgemisch von 20 Mikrolitern vor und stellen Sie die PCR-Bedingungen wie im Textmanuskript beschrieben ein. Nachweis der DNA auf einem 1%Agarosegel mit einem Gel-Imager. Führen Sie eine quantitative PCR-Amplifikation mit TB Green in einem Echtzeit-PCR-System durch und zeichnen Sie die Ergebnisse jeder Reaktion auf.Analysieren Sie die DNA in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 Mikrolitern und stellen Sie die quantitativen PCR-Bedingungen ein, wie im Textmanuskript beschrieben. Berechnen Sie die WSP- und RPS6-Genkopienzahlen in den Zellen nach der festgelegten Standardkurve. Berechnen Sie dann die relative Wolbachia-Dichte anhand der Kopierzahl von wsp/RPS6.Analysieren Sie die Daten mit einem unabhängigen Stichproben-t-Test. Geben Sie 200 Mikroliter Lysepuffer in das Zellpellet und inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis. Die Lysate bei 12.000 RCF für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand abspritzen.Analysieren Sie die wsp-Konzentration des Überstands mit einem BCA-Protein-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Laden Sie gleiche Mengen Protein auf ein 15%SDS-PAGE Gel. Übertragen Sie das Protein auf Nitrocellulosemembranen und blockieren Sie die Membranen mit 5% Magermilch für zwei Stunden bei Raumtemperatur.Dann waschen Sie die Membranen dreimal mit TBST. Inkubieren Sie die Membranen über Nacht bei 4 Grad Celsius mit 100 Mikrolitern polyklonaler Anti-WSP-Antikörper, die durch Verdünnung des primären Antikörpers mit 5% Magermilch hergestellt werden. Waschen Sie den primären Antikörper dreimal mit TBST.Geben Sie 100 Mikroliter Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörper zu den Membranen und inkubieren Sie ihn auf einem Shaker für eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Membranen dreimal mit TBST und mischen Sie 20 Mikroliter Lösung A und 20 Mikroliter Lösung B im Chemilumineszenz-Detektionskit in einem Verhältnis von eins zu eins. Tauchen Sie die gesamte Membran gleichzeitig in die Lumineszenzlösung ein und beobachten Sie die Signale mit einem multifunktionalen Bildgebungssystem.Inkubieren Sie auf einer konfokalen Laser-Petrischale Aa23- und Aa23-T-Zellen für drei bis vier Tage bei 28 Grad Celsius unter 5% atmosphärischem Kohlendioxid. Wenn die Zelle 60 bis 70% Konfluenz erreicht, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Fixieren Sie die Zellen in einem ml 4% Paraformaldehyd für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.Waschen Sie die festen Zellen fünf Minuten lang mit PBST und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS neu. Brüten Sie die Petrischale in einem ml 3%Rinderserumalbumin für eine Stunde bei 37 Grad Celsius aus. Geben Sie 100 Mikroliter Maus-Anti-WSP-Polyklonal-Antikörper und Mausserum zu den Objektträgern und inkubieren Sie es über Nacht in einer nassen Box bei vier Grad Celsius.Die Petrischale aus der Nasszelle nehmen und wieder auf Raumtemperatur bringen. Waschen Sie sie dreimal mit PBS und entfernen Sie die PBS. Schützen Sie die folgenden Verfahren vor Licht.Brüten Sie die Petrischale mit 100 Mikrolitern eines Alexa Fluor 488-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörpers bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten aus. Inkubieren Sie die Proben-Petrischale mit 50 Mikrolitern DAPI, verdünnt in PBS auf 10 Mikrogramm / ml bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten und waschen Sie sie dann dreimal mit PBS. Beobachten Sie die Immunfärbung unter einem konfokalen Mikroskop.Vor dem Nachweis von Wolbachia wurden Aa23- und Aa23-T-Zellen unter einem Lichtmikroskop beobachtet, um morphologische Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien zu bestimmen. Die Aa23- und AA23-T-Zellen hatten mindestens zwei Zellmorphologien, aber es wurden keine offensichtlichen morphologischen Unterschiede zwischen den beiden Zelltypen beobachtet. Mit den diagnostischen Primern 81F/691R wurde eine positive Amplifikation des Wolbachia wsp-Gens in Aa23-Zellen, aber nicht in Aa23-T-Zellen nachgewiesen.Die Analyse der Wolbachia-Dichte in den Zelllinien zeigte ein wsp/rps6-Verhältnis von 2,4 in Aa23-Zellen, aber keine Wolbachia in Aa23-T-Zellen. Die Western-Blot-Analyse von Proteinextrakten zeigte ein starkes WSP-Signal für Aa23, aber für Aa23-T wurde kein Signal detektiert. Der indirekte Immunfluoreszenz-Assay wies das wsp-Protein in Aa23-Zellen nach, während in Aa23-T-Zellen nur DAPI-gefärbte DNA nachgewiesen wurde.Stellen Sie sicher, dass die Kulturkolben fünf bis sieben Tage lang bei 28 Grad Celsius unter 5% atmosphärischem Kohlendioxid inkubiert werden. Diesem Verfahren kann eine Elektronenmikroskopie folgen, bei der besonders auf die Probenvorbereitung und das Schneiden der Proben geachtet werden muss. Die vier experimentellen Methoden, die in dieser Studie verwendet wurden, bestätigten die Nachweisgenauigkeit der Wolbachia-Infektion in Zellen, die auch auf andere Arten von Zellen und Geweben anwendbar ist.

detecting-wolbachia-strain-walbb-in-aedes-albopictus-cell-lines

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wolbachia Bakterielle Infektion in Drosophila

Dieses Video beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von Wolbachia pipientis von einer Anopheles gambiae Zelllinie und dann Kultivierung des Endosymbionten in zellfreien Medium. Ein Test für die Lebensfähigkeit des Bakteriums nachgewiesen ist.

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RNA-Seq-Analysen werden immer wichtiger, um die molekularen Grundlagen adaptiver Merkmale in Nicht-Modellorganismen zu identifizieren. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene zwischen Diapause- und Nicht-Diapause-Aedes albopictus-Mücken beschrieben, von der Mückenaufzucht über die RNA-Sequenzierung bis hin zu bioinformatischen Analysen von RNA-Seq-Daten.

Eine experimentelle und Bioinformatik-Protokoll für die RNA-seq Analysen der Photoperiodische Diapause in den asiatischen Tigermücke, Aedes albopictus

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Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Untersuchung der Paarungswettbewerbsfähigkeit von männlichen Aedes aegypti unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff als Marker. Weibliche Moskitos sind sowohl markierten als auch unmarkierten Männchen zur Kopulation ausgesetzt. Nach der Paarung werden ihre Spermatheken unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht, um ihren Paarungspartner zu bestimmen.

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RNA-Interferenz im Ei-Parasitoiden, Trichogramma dendrolimi matsumura

Mikrobielle Gemeinschaften in Mücken sind vielversprechend für biologische Vektorkontrollstrategien. Die meisten Symbionten sind nicht kultivierbar und erfordern metagenomische Analysen. Wir beschreiben eine Methode zur Sezierung weiblicher Mücken und zur Trennung von Eierstöcken, Mitteldarm- und Speicheldrüsen, um Kreuzkontaminationen zu verhindern, Mikrobiomstudien auf Organebene zu erleichtern und das Verständnis der Rolle von Mikroorganismen in der Mückenbiologie zu verbessern.

Präparierung von Mücken-Eierstöcken, Mitteldarm- und Speicheldrüsen für Mikrobiomanalysen auf Organebene

Zelllinien sind nützlich für Studien an intrazellulären Organismen, die nicht außerhalb ihrer Wirtszellen kultiviert werden können. Obwohl Wolbachia-infizierte Linien viele Entdeckungen ermöglicht haben, kann die Heterogenität innerhalb dieser Linien zu unterschiedlichen experimentellen Ergebnissen führen. Wir stellen ein Protokoll zur Generierung von Einzelzellklonen und kontinuierlichen Kulturen aus Wolbachia-infizierten JW18-Zellen vor.

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Lernen Sie vier komplementäre Methoden zum Nachweis intrazellulärer Wolbachia in Aedes albopictus-Zelllinien. Dieses Protokoll verbessert die Nachweisgenauigkeit und unterstützt die Erforschung von Wolbachia-Wirt-Interaktionen in der Mikrobiologie.

Nachweis des Wolbachia-Stammes wAlbB in Aedes albopictus-Zelllinien

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