Hochauflösende Neutronenspektroskopie zur Untersuchung der Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser

Die Neutronenrückstreuung misst die globale Diffusion und die interne Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser ohne Strahlungsschäden. Die Neutronenspektroskopie greift gleichzeitig auf räumliche und zeitliche Zusammenhänge auf molekularer Ebene zu. In weicher Materie und biologischen Materialien ist es besonders interessant, indirekte Informationen über die lokale Ordnung auf diesen langreichweitigen Unordnungssystemen zu erhalten.

Die Neutronenrückstreuung kann also verwendet werden, um die Dynamik in der Biologie, Chemie oder im materiellen Sinne zu untersuchen. Ein weiteres starkes Feld ist die Energie, mit Studien zum Beispiel zu Batterien und Brennstoffzellen. Die Neutronenrückstreuung wurde erfolgreich eingesetzt, um die molekulare Dynamik von Proteinen zu untersuchen, die an neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson beteiligt sind.

Die erzielten Ergebnisse helfen uns, die molekularen Merkmale dieser Pathologien besser zu verstehen, und könnten den Weg für die Entwicklung einer besseren Diagnostik ebnen. Um den Probenhalter vorzubereiten, reinigen Sie zunächst einen flachen Aluminium-Probenhalter und seine Indiumdrahtdichtung und Schrauben gründlich mit Wasser, gefolgt von Ethanol, und lassen Sie ihn dann trocknen. Wiegen Sie die verschiedenen Teile des Probenhalters, einschließlich des Bodens, des Deckels und des Indiumdrahts, separat auf einer Präzisionswaage.

Setzen Sie die ein Millimeter dicke Indiumdrahtdichtung in die Nut des unteren Teils des Probenhalters ein und lassen Sie eine kleine Überlappung an der Stelle, an der sich die beiden Enden verbinden. Fügen Sie etwa 100 Milligramm gefriergetrocknetes Protein hinzu, so dass es die Innenfläche des unteren Teils des Probenhalters ausfüllt. Als nächstes legen Sie den Probenhalter für 24 Stunden in einen Exsikkator mit einer Petrischale mit Phosphorpentoxidpulver, um das Proteinpulver vollständig zu trocknen.

Wiegen Sie den getrockneten unteren Teil des Probenhalters, der die Indiumdichtung und das getrocknete Pulver enthält, um die Masse der getrockneten Probe zu erhalten. Entfernen Sie das Phosphorpentoxid aus dem Exsikkator und legen Sie eine Petrischale mit Deuteriumoxid sowie die Probe hinein, um das Pulver zu hydratisieren. Wiederholen Sie das Trocknen und Hydratisieren dreimal, um einen vollständigen Austausch von Wasserstoff zu Deuterium zu gewährleisten.

Messen Sie die Pulvermasse regelmäßig, um den Hydratationsgrad zu überprüfen, und wenn der Hydratationsgrad leicht über dem gewünschten Wert liegt, warten Sie, bis die Masse langsam abnimmt. Sobald die gewünschte Hydratation erreicht ist, setzen Sie schnell den Deckel auf den unteren Teil und verschließen Sie zuerst den Probenhalter mit vier Schrauben, um den Dampfaustausch zu stoppen. Setzen Sie alle verbleibenden Schrauben ein und ziehen Sie sie fest, bis kein Spalt mehr zwischen dem unteren Teil und dem Deckel sichtbar ist.

Wiegen Sie den versiegelten Probenhalter, um nach dem Neutronenexperiment auf einen möglichen Hydratationsverlust durch Lecks zu prüfen. Um die Probe im flüssigen Zustand herzustellen, lösen Sie das Protein im deuterierten Puffer auf. Bestimmen Sie mit Wasser das geeignete Flüssigkeitsvolumen, das in den Probenhalter gegeben werden soll.

Stellen Sie vor dem Umgang mit Material sicher, dass die Dosis ionisierender Strahlung weniger als 100 Mikrosievert pro Stunde beträgt. Trocknen Sie dann das Probenstäbchen gründlich ab und entfernen Sie alle vorherigen Proben. Legen Sie die Probe auf das Probenstäbchen, prüfen Sie die richtige Zentrierung relativ zur Strahlmitte und setzen Sie das Probenstäbchen in den Kryoofen ein.

Verwenden Sie ein Timeout von 200 Minuten. Verwenden Sie eine for-Schleife mit 65 Wiederholungen. Setzen Sie im Inneren einen IN16-Doppler-Einstellungsregler ein, gefolgt vom Zählregler und stellen Sie einen einzelnen Scan von 30 Sekunden ein.

Drücken Sie dann die Starttaste, um das Skript auszuführen. Die elastischen und inelastischen Lysosomen-Scans mit festem Fenster zeigten eine Zunahme des Signals bei niedrigem Impulstransfer und niedrigem Energietransfer, während das Signal bei hohem Energietransfer und niedrigem Impulstransfer abnahm. Der anfängliche Massendiffusionskoeffizient betrug 15 Ångström im Quadrat pro Nanosekunde, der dann im Laufe der Zeit exponentiell abnahm.

Bei Temperaturen über 220 Kelvin war das Hydratwasser um die Tau-Fasern herum deutlich beweglicher als um die Tau-Monomere. Der Anteil der Wassermoleküle, die eine Translationsbewegung durchlaufen, und sowohl der Translations- als auch der Rotationsdiffusionskoeffizient der Wassermoleküle waren um die Fasern herum erhöht. Die Proteinkonzentration sollte 2000 Milligramm pro ml oder mindestens 20 Milligramm pro ml für proteinierte Proteine betragen, da die Neutronenrückstreuung durch den Neutronenfluss oder den Probenhalterpufferhintergrund begrenzt ist.

Die Neutronenrückstreuung wurde beispielsweise kürzlich angewendet, um zu verstehen, wie Wasser, die natürlichen Umweltproteine, vollständig durch ein synthetisches Polymer für biotechnologische Anwendungen wie z. B. die Verabreichung von Medikamenten ersetzt werden können.