Name: Laser-Mikrodissektion für speziesunabhängige Einzelgewebeanwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Erfahren Sie Laser-Mikrodissektion mit CEL-Seq2 für transkriptomische Analysen einzelner Gewebeproben. Diese Methode ermöglicht genexpressionsstudien bei C. elegans und nicht-modellen Organismen.

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Diese Arbeit wurde durch NIH (R01GM141395) und NSF (1656736) Zuschüsse an DF und NIH Fellowship (F32GM136170) an AW finanziert. Abbildung 1 wurde mit Hilfe von BioRender.com erstellt.

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Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Kritische Schritte der Methode Bei korrekter Durchführung erhält die hier beschriebene Methode robuste RNA-Profile mit einer relativ kleinen Anzahl laserdissektierter Proben (70 Schwanzspitzen in diesem Beispiel). Für Proben von sich entwickelnden Tieren ist jedoch eine enge Synchronisation entscheidend, um die Variabilität zwischen den Proben zu reduzieren. Aus diesem Grund empfiehlt das Protokoll die Hatch-Off-Methode für die Wurmsynchronisation. Hier kann der Forscher den Altersunterschied zwischen...

Nematoden – insbesondere die Rhabditiden-Nematoden, die mit dem Modellsystem Caenorhabditis elegans verwandt sind – sind aus vielen Gründen eine wunderbare Gruppe von Tieren für die evolutionäre Entwicklungsbiologie (EDB) 1,2. Zu den Vorteilen gehören die geringe Anzahl von Zellen, definierte und konsistente Zelllinien, Transparenz und einfache Kultur und Haltung. Es gibt auch viele Ressourcen, darunter hochwertige Genome für mehrere Arten und für C. elegans, umfangreiche molekulargenetische Werkzeuge und Wissen über Entwicklung, Genetik, Anatomie und Physiologie 3,4,5,6.
Wie bei vielen anderen Organismen hat die Fähigkeit, die Transkriptomdynamik in einzelnen Geweben oder einzelnen Zellen zu charakterisieren, die Analyse der Entwicklung in C. elegans 7,8,9,10 revolutioniert. In der Lage zu sein, einzellige Transkriptome über Nematoden hinweg zu vergleichen, würde EDB in ähnlicher Weise mit diesen Organismen transformieren. Zum Beispiel würden solche Vergleiche Aufschluss darüber geben, wie sich genregulatorische Netzwerke für Charaktere (Merkmale) entwickelt haben, die konserviert wurden, für Charaktere, die divergiert sind, oder für Charaktere, die sich unabhängig voneinander entwickelt haben.

Die Isolierung bestimmter Gewebe oder Zellen von Nematoden ist jedoch eine der großen Herausforderungen. Für viele Organismen können einzelne Zellen aus Geweben dissoziiert und unvoreingenommen geerntet oder mit gewebespezifischer Expression eines fluoreszierenden Proteins markiert und durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)11 sortiert werden. Bei C. elegans war die Hochdurchsatzisolierung (HTP) von Zellen hauptsächlich auf Embryonen beschränkt, da die zähe äußere Kutikula (und das hydrostatische Skelett) die Zellisolierung von Larven und Erwachsenen behindert hat. Um diese Herausforderung zu umgehen, haben einige Methoden genetische Werkzeuge in ganzen C. elegans-Würmern eingesetzt, wie z.B. gewebespezifisches mRNA-Tagging12 und differentielle Expressionsvergleiche zwischen Wildtyp und Mutanten, die einen Zelltyp13 beeinflussen. Neuere Methoden haben die Herausforderung überwunden, indem sie die Kutikula aufgelöst haben, um Kerne 14 oder ganze Zellen 8,9,15 zu isolieren. Zellisolierung und Zellkultur haben jedoch die offensichtlichen Nachteile, dass Zellen aus ihrem natürlichen Entwicklungs- oder anatomischen Kontext entfernt werden - z. B. weg von der Zell-Zell-Signalisierung und dem Kontakt mit der extrazellulären Matrix -, von denen erwartet wird, dass sie das Genexpressionsprofilbeeinflussen 15. Darüber hinaus sind die genetischen Werkzeuge und gewebespezifischen Marker artspezifisch (d.h. sie können nur in C. elegans verwendet werden).
LMD bietet eine alternative Methode zur Isolierung von Geweben, ohne den natürlichen Kontext von Zellen zu stören. Bezeichnend für EDB ist, dass LMD es auch ermöglicht, Transkriptome aus homologen Geweben verschiedener Spezies zu vergleichen, ohne dass speziesspezifische genetische Toolkits erforderlich sind, wenn Genom- oder ganze Transkriptomsequenzen dieser Spezies verfügbar sind. LMD beinhaltet das Targeting von Geweben durch direkte mikroskopische Beobachtung und die Verwendung eines Laser-Mikrostrahls - integriert in die Optik des Mikroskops -, um das Gewebe von Interesse auszuschneiden und zu ernten (einzufangen) 16. Einschränkungen von LMD sind, dass es für sehr HTP-Ansätze nicht förderlich ist (obwohl die Transkriptionsprofile für Schwanzspitzen, wie in diesem Protokoll beschrieben, mit ~ 70 Proben robust waren), bestimmte Proben könnten schwierig zu sezieren sein, und Schnitte sind auf die Präzision des Lasers beschränkt und was im Mikroskop visualisiert werden kann.
Der Zweck des vorliegenden Protokolls ist es, zu beschreiben, wie LMD, gefolgt von RNA-Seq aus Einzelgewebe, verwendet werden kann, um stadien- und gewebespezifische Transkriptomdaten von Nematoden zu erhalten. Insbesondere zeigt es LMD zur Isolierung von Schwanzspitzen aus Larven der vierten Stufe (L4) von C. elegans. Diese Methode kann jedoch an andere Gewebe und natürlich an verschiedene Arten angepasst werden.
Bei C. elegans gibt es 4 Zellen, die sowohl bei Männchen als auch bei Hermaphroditen die Schwanzspitze bilden. Während des L4-Stadiums bei Männern - aber nicht bei Hermaphroditen - verändern die Schwanzspitzenzellen ihre Form und wandern anterior und innerlich. Dieser Prozess tritt auch bei einigen, aber nicht allen anderen Rhabditiden-Nematodenarten auf. Daher ist die Schwanzspitze ein gutes Modell für die Evolution der sexuell-dimorphen Morphogenese. Aufgrund ihrer Position ist die Heckspitze auch leicht mit LMD zu isolieren.
Um Transkriptomprofile von Schwanzspitzen zu erhalten, verwendet das vorliegende Protokoll CEL-Seq2, eine RNA-Seq-Methode, die für einzelne Zellen17,18 entwickelt wurde. Diese Methode hat mehrere Vorteile für LMD-abgeleitete Gewebe. CEL-Seq2 ist hochempfindlich und effizient und verwendet eindeutige molekulare Identifikatoren (UMIs), um eine einfache Quantifizierung von mRNA-Lesevorgängen zu ermöglichen, In-vitro-Transkription, um eine lineare Amplifikation zu gewährleisten, und Barcodes, die das Multiplexen einzelner Gewebeproben ermöglichen. Die einzige Einschränkung von CEL-Seq2 besteht darin, dass wiederhergestellte Lesevorgänge auf das 3'-Ende von mRNAs verzerrt sind und die meisten Isoformen daher nicht unterschieden werden können.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 0,5 & Mikro; M PEN Membran-Objektträger RNasefrei</td><td>Leica</td><td>11600288</td><td>für LMD</td></tr><tr><td>500 &micro; L PCR-Röhrchen (nukleasefrei)</td><td>Axygen</td><td>732-0675</td><td>zum Schneiden der Schwanzspitzen</td></tr> in <tr><td>ein Verbundmikroskop mit 40x Objektiv und DIC</td><td>beliebig</td><td></td><td>zur Alterskontrolle von Würmern</td></tr><tr><td>Desktop-Luftbefeuchter</td><td>jedes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop mit Durchlichtbasis</td><td>beliebig</td><td></td><td>für alle Wurmarbeiten</td></tr><tr><td>Glaspasteurpipetten</td><td>beliebiger</td><td></td><td>Griff des Wurmpickers</td></tr><tr><td>Glasobjektträger und Deckgläser</td><td>beliebig</td><td></td><td>zur Altersüberprüfung von Würmern</td></tr><tr><td>LMD6 Mikrodissektionssystem</td><td>Leica</td><td>mehrfach</td><td>zum Schneiden von Schwanzspitzen</td></tr><tr><td>LoBind Röhrchen 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431005</td><td></td></tr><tr><td>M9 Puffer</td><td></td><td></td><td>Rezept im WormBook</td></tr><tr><td>Methanol 99,8%</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td>zur Fixierung von Würmern</td></tr><tr><td>NGM Wachstumsmedium</td><td>US Biologisches</td><td>N1000</td><td>Puffer und Salze müssen hinzugefügt werden: Rezept im WormBook</td></tr><tr><td>P10 Pipette mit variablem Volumen</td>, <td>z.B. Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipette mit variablem Volumen</td><td>, z.B. Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 Pipette mit variablem Volumen</td><td>, z.B. Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen 1.000 & Mikro; L</td><td>beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen 1-10 & Mikro; L filtriert</td><td>jeden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platin-Iridiumdraht</td><td>Tritech</td><td>PT-9010</td>, <td>um Wurmpickel</td></tr><tr><td>steril und nukleasefrei zu machen 1 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Fügen Sie eine sehr kleine Menge zum M9-Puffer hinzu, um zu verhindern, dass Würmer an den Pipettenspitzen haften</td></tr><tr><td>bleiben belüftete 6 mm Kunststoff-Petrischalen</td><td>beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Für CEL-Seq2</td>4200 TapeStation-System <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mit Reagenzien für den hochempfindlichen RNA- und DNA-Nachweis</td><td>Automatisiertes Elektrophoresesystem</td><td>Aligent</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP-Kügelchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA-Aufreinigungskügelchen</td></tr><tr><td>Bead-Bindungspuffer & nbsp; 20 % PEG8000, 2,5 M NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEL-Seq2-Primer (siehe Tabelle S1)</td><td>Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf</td><td>6335000020</td><td>Thermocycler mit programmierbarem Deckel und Block für 200 & Mikro; l Rohre.</td></tr><tr><td>DNA-Polymerase I (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18052-025</td><td></td></tr><tr><td>dNTP-Mix 10 mM</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA-Ligase</td><td>Invitrogen</td><td>18052-019</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT für die PCR-Produktreinigung</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td>Exonuklease-Lösung</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transkriptionskit</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td>Für Schritt 4.6.1</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>beliebiger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix mit HF-Puffer</td><td>NEB</td><td>M0531</td><td>PCR Mix Schritt 4.9.7</td></tr><tr><td>zufälliges Hexamer RT Primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN</td><td>IDT</td><td></td><td>ein Primer mit 6 Nukleotiden, die zufällig</td></tr><tr><td>RNA Fragmentierungspuffer</td><td>NEB</td> <td>sindE6150S</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Fragmentierungsstopp-Puffer</td><td>NEB</td><td>E6150S</td><td></td></tr><tr><td>RNA-PCR-Index-Primer (RPI1&ndash; RPI48)</td><td>Illumina, NEB oder IDT</td><td></td><td>RPIX im Protokollschritt 4.9.7, verfügbare Sequenzen von Illumina</td></tr><tr><td>RNAClean XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY Surface Decontaminant</td><td>Thermo Scientific</td><td>7000TS1</td><td>oder einem anderen ähnlichen Produkt</td></tr><tr><td>RNaseH (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Rekombinant Ribonuklease-Inhibitor</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Zweiter Strangpuffer</td><td>Invitrogen</td><td>10812-014</td><td></td></tr><tr><td>Superscripit II</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td>reverse Transkriptase</td></tr></tbody></table>

laser-mikrodissektion für speziesunabhängige einzelgewebeanwendungen

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Einzelzellmethoden haben die Analyse der Transkriptome bestimmter Zelltypen revolutioniert. Sie erfordern jedoch oft speziesspezifische genetische "Toolkits", wie z.B. Promotoren, die die gewebespezifische Expression fluoreszierender Proteine vorantreiben. Darüber hinaus entfernen Protokolle, die Gewebe stören, um einzelne Zellen zu isolieren, Zellen aus ihrer nativen Umgebung (z. B. Signalisierung von Nachbarn) und können zu Stressreaktionen oder anderen Unterschieden von nativen Genexpressionszuständen führen. Im vorliegenden Protokoll ist die Lasermikrodissektion (LMD) optimiert, um einzelne Nematodenschwanzspitzen für die Untersuchung der Genexpression während der Morphogenese der männlichen Schwanzspitze zu isolieren.
LMD ermöglicht die Isolierung eines Teils des Tieres ohne zelluläre Störung oder artspezifische Toolkits und ist somit auf jede Art anwendbar. Anschließend können einzellige RNA-seq-Bibliotheksvorbereitungsprotokolle wie CEL-Seq2 auf LMD-isolierte Einzelgewebe angewendet und mithilfe von Standardpipelines analysiert werden, vorausgesetzt, dass ein gut annotiertes Genom oder Transkriptom für die Spezies verfügbar ist. Solche Daten können verwendet werden, um festzustellen, wie konserviert oder unterschiedlich die Transkriptome sind, die der Entwicklung dieses Gewebes bei verschiedenen Arten zugrunde liegen.
Zu den Einschränkungen gehört die Möglichkeit, das interessierende Gewebe und die Stichprobengröße auszuschneiden. Eine Leistungsanalyse zeigt, dass nur 70 Heckspitzen pro Bedingung für 80% Leistung benötigt werden. Eine enge Synchronisation der Entwicklung ist erforderlich, um diese Anzahl von Tieren im gleichen Entwicklungsstadium zu erhalten. Somit wird auch eine Methode beschrieben, Tiere in 1-Stunden-Intervallen zu synchronisieren.

Nach der Laser-Capture-Mikrodissektion einzelne Schwanzspitzen von Männchen und Hermaphroditen an 4 Zeitpunkten (L3 22 h nach dem Schlüpfen; L4 24, 26 und 28 h nach dem Schlüpfen) wurden für die RNA-Sequenzierung unter Verwendung des CEL-Seq2-Protokolls hergestellt. CEL-Seq2-Primer enthalten eindeutige Barcodes, mit denen Sequenzlesevorgänge aus einer bestimmten Probe (in diesem Fall einer einzelnen Schwanzspitze) bioinformatisch identifiziert werden können. Sequenzierungsdaten wurden mit dieser Methode für insgesamt 557...

Es wird ein Protokoll beschrieben, das Laser-Mikrodissektion verwendet, um einzelne Nematodengewebe für die RNA-Sequenzierung zu isolieren. Das Protokoll erfordert keine artspezifischen genetischen Toolkits, so dass Genexpressionsprofile zwischen verschiedenen Spezies auf der Ebene von Einzelgewebeproben verglichen werden können.

Laser-Mikrodissektion für speziesunabhängige Einzelgewebeanwendungen

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...

Wir kombinieren Laser-Capture-Mikrodissektion mit einem einzelligen RNA-Seek-Protokoll namens CEL-Seq2, um transkriptomische Datensätze für kleine einzelne Gewebeproben zu generieren. Diese Technik ermöglicht es uns, die Genexpression in Geweben oder Spezies zu untersuchen, die mit herkömmlichen Zellsortiermethoden nicht untersucht werden können. Darüber hinaus bietet es mehr Spezifität als ein Bulk-RNA-Seq-Ansatz.Hier demonstrierten wir diese Technik für die vierzelligen Schwanzspitzen von C.elegans Männchen im vierten Larvenstadium und Hermaphroditen. Aber das Schöne an diesem Ansatz ist, dass er sogar auf Nicht-Modellarten angewendet werden kann. Das Verfahren wird Frau Raya Jallad, Doktorandin aus meinem Labor, und Dr. Antonio Herrera, derzeit leitender biomedizinischer Wissenschaftler an der Baylor-Schule in Chattanooga, Tennessee, demonstrieren.Beginnen Sie damit, ein bis zwei Milliliter M9-Puffer vorsichtig gegen die Wand der Platte zu pipettieren, ohne zu spritzen. Schwenken Sie die Platte, um die Würmer zu entfernen. Entfernen und entsorgen Sie die gesamte Flüssigkeit und die Würmer, indem Sie die Pipettenspitze an der Wand der Platte am Rand des Agars platzieren, um zu vermeiden, dass Löcher stechen.Dieses Video zeigt die Platte, bevor Mütter und Larven entfernt werden. Nur Embryonen sollten übrig bleiben, nachdem die Mütter und Larven entfernt wurden. L1-Larve wird nach der Inkubation für eine Stunde oder so erscheinen.Legen Sie dann die Platte auf 25 Grad Celsius. Entfernen Sie nach einer Stunde die Platte aus dem Inkubator. Lassen Sie vorsichtig einen Milliliter M9-Puffer auf das Agar fallen und schwenken Sie die Platte, um die L1s, aber nicht die Embryonen zu entfernen.Zentrifugieren Sie das Röhrchen und pipettieren Sie die L1s direkt auf den Bakterienrasen einer ausgesäten Platte. Halten Sie die Würmer bei 25 Grad Celsius. Beginnen Sie unter einem Dissektionsmikroskop mit einer Vergrößerung von 30 bis 50 x mit dem Pflücken der Männchen und der Hermaphroditen von den Synchronisationsplatten auf separaten unsitzenden Platten.Männchen unterscheiden sich von Hermaphroditen durch die vorgewölbte Form und hellere Farbe der männlichen Schwänze im Vergleich zu der spitzen Form und dunkleren Farbe der Hermaphroditenschwänze. Waschen Sie die Würmer mit ein bis zwei Millilitern M9-Puffer von der Platte mit einer Pipettenspitze, die mit einem M9-Puffer vorgewaschen wurde, der 0,01% Reinigungsmittel enthält. Übertragen Sie die Würmer in ein Ein-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, drehen Sie es für eine Minute und fügen Sie einen Milliliter M9-Puffer hinzu.Drehen Sie sich erneut für eine Minute. Fügen Sie einen Milliliter eiskaltes 70% Methanol hinzu und mischen Sie gut. Wiederholen Sie die Wäsche mit einem Milliliter Methanol, mischen Sie gut.Drehen Sie es für eine Minute und fügen Sie 500 Mikroliter 70% Methanol hinzu. Mischen Sie es und lagern Sie es bei vier Grad Celsius für eine Stunde bis über Nacht. Pipette 20 Mikroliter der festen Würmer auf die beschichtete Seite eines Polyethylen-Naphthalat- oder PEN-Membran-Glasobjektträgers.Warten Sie, bis das Methanol verdampft ist. Entfernen Sie die Kunststoffabschirmung über der Bühne und klicken Sie auf die Entladetaste mit dem Aufwärtspfeil, um die Membranschienen zu laden. Stellen Sie sicher, dass der Objektträger vollständig trocken ist, drehen Sie ihn so um, dass die Membran nach unten zeigt, und setzen Sie den Objektträger ein.Klicken Sie im Fenster zum Ändern der Probe auf Weiter. Der Diahalter bewegt sich. Ersetzen Sie dann die Kunststoffabschirmung, wählen Sie am unteren Bildschirmrand aus, welcher Diahalter die Folie enthält, und klicken Sie auf die Schaltfläche Entladen mit dem Pfeil nach unten, um die Rohre zu laden.Ziehen Sie das Fach heraus und entfernen Sie den Rohrblock. Setzen Sie die Tubenkappen von vier 500 Mikroliter PCR-Röhrchen in den Halter ein und falten Sie das Röhrchen darunter. Bringen Sie den Block in das Fach zurück und schieben Sie das Fach zurück in den Mikroskoptisch.Wählen Sie im Popup-Fenster des Change Collector Device die Option PCR-Röhren aus und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf die Position der leeren Röhre unten links auf dem Bildschirm unter den Tubuskappen des Kollektorgeräts und wählen Sie im Bedienfeld des Mikroskops TLBF für die Hellfeldbeleuchtung des Durchlichts. Stellen Sie mit dem 2,5-fachen Objektiv den Fokus so lange ein, bis die Würmer und die Oberflächenstruktur der PEN-Membran sichtbar sind.Wechseln Sie zum 20X-Objektiv und verschieben Sie die Bühne in einen Bereich ohne Würmer. Stellen Sie den Fokus so ein, dass die blasenartigen Strukturen in der Membran eine gelbliche Farbe haben, um den Laser auf die richtige Fokusebene zu fokussieren, und stellen Sie dann die Laserparameter ein. Für die Heckspitzen beginnen Sie mit Power 45 Blende 30 in Geschwindigkeit 20.Wählen Sie im Laserbedienfeld Kalibrieren und folgen Sie den Anweisungen. Als nächstes klicken Sie am unteren Bildschirmrand bei den Röhrenkappen des Kollektorgeräts auf Position A, wählen Sie auf der rechten Seite des Bildschirms eine einzelne Form aus, gefolgt von Zeichnen und Schneiden. Wählen Sie dann Punkt zu Punkt und zeichnen Sie eine Linie.Klicken Sie auf Startschnitt, damit der Laser die Membran durchschneidet. Suchen Sie einen Wurm und wechseln Sie, um sich zu bewegen und zu schneiden. Verwenden Sie die Maus, um den Schwanz zu durchschneiden.Um die Probe zu sammeln, wechseln Sie zur Zeichen- und Schnitteinstellung mit der Punkt-zu-Punkt-Funktion und der Zeichnungsform, um den Schnitt eines Membranabschnitts abzuschließen. Wählen Sie die nächste Röhre an der Röhrenkappe des Kollektorgeräts am unteren Bildschirmrand aus und schneiden Sie die nächste Schwanzspitze ab. Sobald vier Schwänze geschnitten sind, entladen Sie das Rohrgestell, indem Sie mit dem Pfeil nach unten auf Entladen klicken.Suchen Sie die Membranabschnitte unter einem Seziermikroskop und fahren Sie mit der nachgeschalteten Probenverarbeitung fort. Hier RNA-Sequenzierung mit CEL-Seq2. Pipettieren Sie 1,2 Mikroliter eines CEL-Seq2 Primer Mastermixes direkt auf die Probe und schließen Sie das Röhrchen.Beschriften Sie mit der Primernummer und legen Sie die Tubenkappe sofort direkt auf ein Stück Trockeneis, um die Probe schockgefrieren zu lassen und so den RNA-Abbau zu verhindern. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Proben gesammelt wurden. Zum Schluss lagern Sie die Röhren bei minus 70 Grad Celsius.C.elegans L3 Hermaphroditen und Männchen 21 bis 23 Stunden nach dem Schlüpfen können unter einem Seziermikroskop durch die Morphologie ihrer Schwänze unterschieden werden. Die Geschichte von Hermaphroditen ist eng, während die von Männchen geschwollen ist und klar erscheint. Das Aussehen der PEN-Membran-Objektträgerstruktur und des Schneckenschwanzes ist in diesen Bildern dargestellt.Hier ist der Fokus für die 20X und 40X Linsen am Mikroskop richtig. Die sezierte Schwanz, die die PEN-Membran unparteiisch ausgeschnitten hat, sind hier sichtbar. Nach dem Schließen der Lücke im Schnitt fällt das Membranstück in die Rohrkappe unterhalb des Objektträgers.Hier ist eine Schlauchkappe mit einem PEN-Membranabschnitt mit einer sezierten Schwanzspitze zu sehen. Das grafische Bild stellt den natürlichen log transformierten eindeutigen molekularen Identifikator oder UMI-Zählungen pro individueller Schwanzspitze für verschiedene Zeitpunkte und Geschlechter dar. Die powsimR-Software wird verwendet, um zu bestimmen, wie viele unabhängige Proben benötigt werden, um differentielle exprimierte oder DE-Gene auf verschiedenen Expressionsebenen nachzuweisen.Das grafische Bild hier stellt die wahre positive Rate dar, um die DE-Gene zwischen zwei Bedingungen für vier verschiedene Simulationen mit unterschiedlichen Stichprobengrößen pro Bedingung zu erkennen. Die gestrichelte Linie zeigt eine positive Rate von 80% an. Die False-Discovery-Rate und die gleichen vier Simulationen werden hier gezeigt.Die gestrichelte Linie zeigt eine False-Discovery-Rate von 10 % an. Die Grafiken zeigten, dass eine Stichprobengröße von 70 Schwanzspitzen pro Bedingung ausreicht, um die DE-Gene mit Ausnahme der Gene mit sehr niedrigen Expressionswerten nachzuweisen. Stellen Sie für eine ordnungsgemäße Synchronisation sicher, dass nur Embryonen auf dem Teller vorhanden sind.Um einen Probenverlust zu vermeiden, pipettieren Sie die Primermischung direkt auf die PEN-Membransektion in der Kappe und seien Sie äußerst schonend beim Schließen der Kappe. Da es speziesunabhängig ist, können wir dieses Protokoll verwenden, um zu untersuchen, wie sich genregulatorische Netzwerke für homologe Strukturen in verschiedenen Spezies entwickelt haben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Laser Capture Mikrodissektion von Säugetiergewebe

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Dieses Video beschreibt die Technik zur Gewinnung einer einzelnen Zelle aus einer heterogenen Zellpopulation mittels Laser-Capture-Mikrodissektion. Die einzelne isolierte Zelle kann für weitere genomische Studien oder die Krebsforschung verwendet werden.

Einzelzellprobenahme mittels Laser-Capture-Mikrodissektion: Eine Technik zur Gewinnung von Zielzellen aus einer heterogenen Zellpopulation

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SIVQ LCM-Protokoll für das Instrument ArcturusXT

Mikrodissektion wurde ausgiebig für die Untersuchung von DNA, RNA und Protein in Gewebe eingesetzt. Laser-Capture-Mikroskopie (LCM) ist die am häufigsten verwendete Methode, aber eine neue Frästechnik mesodissection ist kürzlich verfügbar. Wir zeigen, RNA-Extraktion aus Formalin fixiert mesodissected Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten von Mycobacterium tuberculosis Granulome.

A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Spezifische Transkripte aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Lung Granulome

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Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die lasergestützte Mikrodissektion spezifischer Pflanzenzelltypen für die transkriptionelle Profilerstellung. Während das Protokoll für verschiedene Spezies und Zelltypen geeignet ist, liegt der Schwerpunkt bei der Kreuzblütlergattung Boechera auf schwer zugänglichen Zellen der weiblichen Keimbahn, die für die sexuelle und apomiktische Fortpflanzung wichtig sind.

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Lasercapture Mikrodissektion von Glioma Subregionen für räumliche und molekulare Charakterisierung der intratumoralen Heterogenität, Oncostreams und Invasion

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Workflow für die künstliche Intelligenz-gesteuerte Segmentierung von pathologiebestätigten Regionen von Interesse aus gefärbten, dünnen Gewebeschnittbildern zur Anreicherung von histologieaufgelösten Zellpopulationen mittels Laser-Mikrodissektion. Diese Strategie beinhaltet einen neuartigen Algorithmus, der die Übertragung von Demarkationen, die Zellpopulationen von Interesse bezeichnen, direkt auf Lasermikroskope ermöglicht.

Industrialisierte, von künstlicher Intelligenz gesteuerte Laser-Mikrodissektion zur mikroskaligen proteomischen Analyse der Tumormikroumgebung

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Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von RNA aus definierten histologischen Regionen von paraformaldehydfixiertem, mit Optimal Cutting Temperatur eingebettetem Mauslebergewebe mittels Laser-Capture-Mikrodissektion, was eine gezielte nachgeschaltete Genexpressionsanalyse ermöglicht.

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