Name: Laser-Mikrodissektion für speziesunabhängige Einzelgewebeanwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Erfahren Sie Laser-Mikrodissektion mit CEL-Seq2 für transkriptomische Analysen einzelner Gewebeproben. Diese Methode ermöglicht genexpressionsstudien bei C. elegans und nicht-modellen Organismen.

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Diese Arbeit wurde durch NIH (R01GM141395) und NSF (1656736) Zuschüsse an DF und NIH Fellowship (F32GM136170) an AW finanziert. Abbildung 1 wurde mit Hilfe von BioRender.com erstellt.

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Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Kritische Schritte der Methode Bei korrekter Durchführung erhält die hier beschriebene Methode robuste RNA-Profile mit einer relativ kleinen Anzahl laserdissektierter Proben (70 Schwanzspitzen in diesem Beispiel). Für Proben von sich entwickelnden Tieren ist jedoch eine enge Synchronisation entscheidend, um die Variabilität zwischen den Proben zu reduzieren. Aus diesem Grund empfiehlt das Protokoll die Hatch-Off-Methode für die Wurmsynchronisation. Hier kann der Forscher den Altersunterschied zwischen...

Nematoden – insbesondere die Rhabditiden-Nematoden, die mit dem Modellsystem Caenorhabditis elegans verwandt sind – sind aus vielen Gründen eine wunderbare Gruppe von Tieren für die evolutionäre Entwicklungsbiologie (EDB) 1,2. Zu den Vorteilen gehören die geringe Anzahl von Zellen, definierte und konsistente Zelllinien, Transparenz und einfache Kultur und Haltung. Es gibt auch viele Ressourcen, darunter hochwertige Genome für mehrere Arten und für C. elegans, umfangreiche molekulargenetische Werkzeuge und Wissen über Entwicklung, Genetik, Anatomie und Physiologie 3,4,5,6.
Wie bei vielen anderen Organismen hat die Fähigkeit, die Transkriptomdynamik in einzelnen Geweben oder einzelnen Zellen zu charakterisieren, die Analyse der Entwicklung in C. elegans 7,8,9,10 revolutioniert. In der Lage zu sein, einzellige Transkriptome über Nematoden hinweg zu vergleichen, würde EDB in ähnlicher Weise mit diesen Organismen transformieren. Zum Beispiel würden solche Vergleiche Aufschluss darüber geben, wie sich genregulatorische Netzwerke für Charaktere (Merkmale) entwickelt haben, die konserviert wurden, für Charaktere, die divergiert sind, oder für Charaktere, die sich unabhängig voneinander entwickelt haben.

Die Isolierung bestimmter Gewebe oder Zellen von Nematoden ist jedoch eine der großen Herausforderungen. Für viele Organismen können einzelne Zellen aus Geweben dissoziiert und unvoreingenommen geerntet oder mit gewebespezifischer Expression eines fluoreszierenden Proteins markiert und durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)11 sortiert werden. Bei C. elegans war die Hochdurchsatzisolierung (HTP) von Zellen hauptsächlich auf Embryonen beschränkt, da die zähe äußere Kutikula (und das hydrostatische Skelett) die Zellisolierung von Larven und Erwachsenen behindert hat. Um diese Herausforderung zu umgehen, haben einige Methoden genetische Werkzeuge in ganzen C. elegans-Würmern eingesetzt, wie z.B. gewebespezifisches mRNA-Tagging12 und differentielle Expressionsvergleiche zwischen Wildtyp und Mutanten, die einen Zelltyp13 beeinflussen. Neuere Methoden haben die Herausforderung überwunden, indem sie die Kutikula aufgelöst haben, um Kerne 14 oder ganze Zellen 8,9,15 zu isolieren. Zellisolierung und Zellkultur haben jedoch die offensichtlichen Nachteile, dass Zellen aus ihrem natürlichen Entwicklungs- oder anatomischen Kontext entfernt werden - z. B. weg von der Zell-Zell-Signalisierung und dem Kontakt mit der extrazellulären Matrix -, von denen erwartet wird, dass sie das Genexpressionsprofilbeeinflussen 15. Darüber hinaus sind die genetischen Werkzeuge und gewebespezifischen Marker artspezifisch (d.h. sie können nur in C. elegans verwendet werden).
LMD bietet eine alternative Methode zur Isolierung von Geweben, ohne den natürlichen Kontext von Zellen zu stören. Bezeichnend für EDB ist, dass LMD es auch ermöglicht, Transkriptome aus homologen Geweben verschiedener Spezies zu vergleichen, ohne dass speziesspezifische genetische Toolkits erforderlich sind, wenn Genom- oder ganze Transkriptomsequenzen dieser Spezies verfügbar sind. LMD beinhaltet das Targeting von Geweben durch direkte mikroskopische Beobachtung und die Verwendung eines Laser-Mikrostrahls - integriert in die Optik des Mikroskops -, um das Gewebe von Interesse auszuschneiden und zu ernten (einzufangen) 16. Einschränkungen von LMD sind, dass es für sehr HTP-Ansätze nicht förderlich ist (obwohl die Transkriptionsprofile für Schwanzspitzen, wie in diesem Protokoll beschrieben, mit ~ 70 Proben robust waren), bestimmte Proben könnten schwierig zu sezieren sein, und Schnitte sind auf die Präzision des Lasers beschränkt und was im Mikroskop visualisiert werden kann.
Der Zweck des vorliegenden Protokolls ist es, zu beschreiben, wie LMD, gefolgt von RNA-Seq aus Einzelgewebe, verwendet werden kann, um stadien- und gewebespezifische Transkriptomdaten von Nematoden zu erhalten. Insbesondere zeigt es LMD zur Isolierung von Schwanzspitzen aus Larven der vierten Stufe (L4) von C. elegans. Diese Methode kann jedoch an andere Gewebe und natürlich an verschiedene Arten angepasst werden.
Bei C. elegans gibt es 4 Zellen, die sowohl bei Männchen als auch bei Hermaphroditen die Schwanzspitze bilden. Während des L4-Stadiums bei Männern - aber nicht bei Hermaphroditen - verändern die Schwanzspitzenzellen ihre Form und wandern anterior und innerlich. Dieser Prozess tritt auch bei einigen, aber nicht allen anderen Rhabditiden-Nematodenarten auf. Daher ist die Schwanzspitze ein gutes Modell für die Evolution der sexuell-dimorphen Morphogenese. Aufgrund ihrer Position ist die Heckspitze auch leicht mit LMD zu isolieren.
Um Transkriptomprofile von Schwanzspitzen zu erhalten, verwendet das vorliegende Protokoll CEL-Seq2, eine RNA-Seq-Methode, die für einzelne Zellen17,18 entwickelt wurde. Diese Methode hat mehrere Vorteile für LMD-abgeleitete Gewebe. CEL-Seq2 ist hochempfindlich und effizient und verwendet eindeutige molekulare Identifikatoren (UMIs), um eine einfache Quantifizierung von mRNA-Lesevorgängen zu ermöglichen, In-vitro-Transkription, um eine lineare Amplifikation zu gewährleisten, und Barcodes, die das Multiplexen einzelner Gewebeproben ermöglichen. Die einzige Einschränkung von CEL-Seq2 besteht darin, dass wiederhergestellte Lesevorgänge auf das 3'-Ende von mRNAs verzerrt sind und die meisten Isoformen daher nicht unterschieden werden können.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 0,5 & Mikro; M PEN Membran-Objektträger RNasefrei</td><td>Leica</td><td>11600288</td><td>für LMD</td></tr><tr><td>500 &micro; L PCR-Röhrchen (nukleasefrei)</td><td>Axygen</td><td>732-0675</td><td>zum Schneiden der Schwanzspitzen</td></tr> in <tr><td>ein Verbundmikroskop mit 40x Objektiv und DIC</td><td>beliebig</td><td></td><td>zur Alterskontrolle von Würmern</td></tr><tr><td>Desktop-Luftbefeuchter</td><td>jedes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop mit Durchlichtbasis</td><td>beliebig</td><td></td><td>für alle Wurmarbeiten</td></tr><tr><td>Glaspasteurpipetten</td><td>beliebiger</td><td></td><td>Griff des Wurmpickers</td></tr><tr><td>Glasobjektträger und Deckgläser</td><td>beliebig</td><td></td><td>zur Altersüberprüfung von Würmern</td></tr><tr><td>LMD6 Mikrodissektionssystem</td><td>Leica</td><td>mehrfach</td><td>zum Schneiden von Schwanzspitzen</td></tr><tr><td>LoBind Röhrchen 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431005</td><td></td></tr><tr><td>M9 Puffer</td><td></td><td></td><td>Rezept im WormBook</td></tr><tr><td>Methanol 99,8%</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td>zur Fixierung von Würmern</td></tr><tr><td>NGM Wachstumsmedium</td><td>US Biologisches</td><td>N1000</td><td>Puffer und Salze müssen hinzugefügt werden: Rezept im WormBook</td></tr><tr><td>P10 Pipette mit variablem Volumen</td>, <td>z.B. Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipette mit variablem Volumen</td><td>, z.B. Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 Pipette mit variablem Volumen</td><td>, z.B. Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen 1.000 & Mikro; L</td><td>beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen 1-10 & Mikro; L filtriert</td><td>jeden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platin-Iridiumdraht</td><td>Tritech</td><td>PT-9010</td>, <td>um Wurmpickel</td></tr><tr><td>steril und nukleasefrei zu machen 1 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Fügen Sie eine sehr kleine Menge zum M9-Puffer hinzu, um zu verhindern, dass Würmer an den Pipettenspitzen haften</td></tr><tr><td>bleiben belüftete 6 mm Kunststoff-Petrischalen</td><td>beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Für CEL-Seq2</td>4200 TapeStation-System <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mit Reagenzien für den hochempfindlichen RNA- und DNA-Nachweis</td><td>Automatisiertes Elektrophoresesystem</td><td>Aligent</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP-Kügelchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA-Aufreinigungskügelchen</td></tr><tr><td>Bead-Bindungspuffer & nbsp; 20 % PEG8000, 2,5 M NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEL-Seq2-Primer (siehe Tabelle S1)</td><td>Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf</td><td>6335000020</td><td>Thermocycler mit programmierbarem Deckel und Block für 200 & Mikro; l Rohre.</td></tr><tr><td>DNA-Polymerase I (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18052-025</td><td></td></tr><tr><td>dNTP-Mix 10 mM</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA-Ligase</td><td>Invitrogen</td><td>18052-019</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT für die PCR-Produktreinigung</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td>Exonuklease-Lösung</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transkriptionskit</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td>Für Schritt 4.6.1</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>beliebiger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix mit HF-Puffer</td><td>NEB</td><td>M0531</td><td>PCR Mix Schritt 4.9.7</td></tr><tr><td>zufälliges Hexamer RT Primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN</td><td>IDT</td><td></td><td>ein Primer mit 6 Nukleotiden, die zufällig</td></tr><tr><td>RNA Fragmentierungspuffer</td><td>NEB</td> <td>sindE6150S</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Fragmentierungsstopp-Puffer</td><td>NEB</td><td>E6150S</td><td></td></tr><tr><td>RNA-PCR-Index-Primer (RPI1&ndash; RPI48)</td><td>Illumina, NEB oder IDT</td><td></td><td>RPIX im Protokollschritt 4.9.7, verfügbare Sequenzen von Illumina</td></tr><tr><td>RNAClean XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY Surface Decontaminant</td><td>Thermo Scientific</td><td>7000TS1</td><td>oder einem anderen ähnlichen Produkt</td></tr><tr><td>RNaseH (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Rekombinant Ribonuklease-Inhibitor</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Zweiter Strangpuffer</td><td>Invitrogen</td><td>10812-014</td><td></td></tr><tr><td>Superscripit II</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td>reverse Transkriptase</td></tr></tbody></table>

laser-mikrodissektion für speziesunabhängige einzelgewebeanwendungen

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Einzelzellmethoden haben die Analyse der Transkriptome bestimmter Zelltypen revolutioniert. Sie erfordern jedoch oft speziesspezifische genetische "Toolkits", wie z.B. Promotoren, die die gewebespezifische Expression fluoreszierender Proteine vorantreiben. Darüber hinaus entfernen Protokolle, die Gewebe stören, um einzelne Zellen zu isolieren, Zellen aus ihrer nativen Umgebung (z. B. Signalisierung von Nachbarn) und können zu Stressreaktionen oder anderen Unterschieden von nativen Genexpressionszuständen führen. Im vorliegenden Protokoll ist die Lasermikrodissektion (LMD) optimiert, um einzelne Nematodenschwanzspitzen für die Untersuchung der Genexpression während der Morphogenese der männlichen Schwanzspitze zu isolieren.
LMD ermöglicht die Isolierung eines Teils des Tieres ohne zelluläre Störung oder artspezifische Toolkits und ist somit auf jede Art anwendbar. Anschließend können einzellige RNA-seq-Bibliotheksvorbereitungsprotokolle wie CEL-Seq2 auf LMD-isolierte Einzelgewebe angewendet und mithilfe von Standardpipelines analysiert werden, vorausgesetzt, dass ein gut annotiertes Genom oder Transkriptom für die Spezies verfügbar ist. Solche Daten können verwendet werden, um festzustellen, wie konserviert oder unterschiedlich die Transkriptome sind, die der Entwicklung dieses Gewebes bei verschiedenen Arten zugrunde liegen.
Zu den Einschränkungen gehört die Möglichkeit, das interessierende Gewebe und die Stichprobengröße auszuschneiden. Eine Leistungsanalyse zeigt, dass nur 70 Heckspitzen pro Bedingung für 80% Leistung benötigt werden. Eine enge Synchronisation der Entwicklung ist erforderlich, um diese Anzahl von Tieren im gleichen Entwicklungsstadium zu erhalten. Somit wird auch eine Methode beschrieben, Tiere in 1-Stunden-Intervallen zu synchronisieren.

Nach der Laser-Capture-Mikrodissektion einzelne Schwanzspitzen von Männchen und Hermaphroditen an 4 Zeitpunkten (L3 22 h nach dem Schlüpfen; L4 24, 26 und 28 h nach dem Schlüpfen) wurden für die RNA-Sequenzierung unter Verwendung des CEL-Seq2-Protokolls hergestellt. CEL-Seq2-Primer enthalten eindeutige Barcodes, mit denen Sequenzlesevorgänge aus einer bestimmten Probe (in diesem Fall einer einzelnen Schwanzspitze) bioinformatisch identifiziert werden können. Sequenzierungsdaten wurden mit dieser Methode für insgesamt 557...

Es wird ein Protokoll beschrieben, das Laser-Mikrodissektion verwendet, um einzelne Nematodengewebe für die RNA-Sequenzierung zu isolieren. Das Protokoll erfordert keine artspezifischen genetischen Toolkits, so dass Genexpressionsprofile zwischen verschiedenen Spezies auf der Ebene von Einzelgewebeproben verglichen werden können.

Laser-Mikrodissektion für speziesunabhängige Einzelgewebeanwendungen

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...

Wir kombinieren Laser-Capture-Mikrodissektion mit einem einzelligen RNA-Seek-Protokoll namens CEL-Seq2, um transkriptomische Datensätze für kleine einzelne Gewebeproben zu generieren. Diese Technik ermöglicht es uns, die Genexpression in Geweben oder Spezies zu untersuchen, die mit herkömmlichen Zellsortiermethoden nicht untersucht werden können. Darüber hinaus bietet es mehr Spezifität als ein Bulk-RNA-Seq-Ansatz.Hier demonstrierten wir diese Technik für die vierzelligen Schwanzspitzen von C.elegans Männchen im vierten Larvenstadium und Hermaphroditen. Aber das Schöne an diesem Ansatz ist, dass er sogar auf Nicht-Modellarten angewendet werden kann. Das Verfahren wird Frau Raya Jallad, Doktorandin aus meinem Labor, und Dr. Antonio Herrera, derzeit leitender biomedizinischer Wissenschaftler an der Baylor-Schule in Chattanooga, Tennessee, demonstrieren.Beginnen Sie damit, ein bis zwei Milliliter M9-Puffer vorsichtig gegen die Wand der Platte zu pipettieren, ohne zu spritzen. Schwenken Sie die Platte, um die Würmer zu entfernen. Entfernen und entsorgen Sie die gesamte Flüssigkeit und die Würmer, indem Sie die Pipettenspitze an der Wand der Platte am Rand des Agars platzieren, um zu ve

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Laser Capture Mikrodissektion von Säugetiergewebe

Das Video beschreibt die Laserdissektion des 3D-organotypischen Co-Kulturmodells mit Präzision im Mikrometerbereich. In organotypischen 3D-Modellen werden stromale Bestandteile wie Fibroblasten 3-dimensional mit Krebsepithelzellen kokultiviert. Das 3D-Modell dient als experimentelles Werkzeug, mit dem Invasion und Krebs-Stroma-Wechselwirkungen unter nahezu physiologischen Bedingungen untersucht werden können.

Lasermikrodissektion: Eine Technik zur Isolierung eindringender Darmkrebszellen aus einem organotypischen 3D-Kulturmodell

Dieses Video beschreibt die Technik zur Gewinnung einer einzelnen Zelle aus einer heterogenen Zellpopulation mittels Laser-Capture-Mikrodissektion. Die einzelne isolierte Zelle kann für weitere genomische Studien oder die Krebsforschung verwendet werden.

Einzelzellprobenahme mittels Laser-Capture-Mikrodissektion: Eine Technik zur Gewinnung von Zielzellen aus einer heterogenen Zellpopulation

SIVQ-LCM ist ein innovativer Ansatz, der einen Computer-Algorithmus, räumlich invarianten Vektor Quantisierung (SIVQ) nutzt, um den Laser Mikrodissektion Verfahren (LCM) zu fahren. Die SIVQ LCM-Workflow die Geschwindigkeit und Genauigkeit der Mikrodissektion stark verbessert, mit Anwendungen in der Forschung und klinischen Umgebungen.

SIVQ LCM-Protokoll für das Instrument ArcturusXT

Mikrodissektion wurde ausgiebig für die Untersuchung von DNA, RNA und Protein in Gewebe eingesetzt. Laser-Capture-Mikroskopie (LCM) ist die am häufigsten verwendete Methode, aber eine neue Frästechnik mesodissection ist kürzlich verfügbar. Wir zeigen, RNA-Extraktion aus Formalin fixiert mesodissected Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten von Mycobacterium tuberculosis Granulome.

A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Spezifische Transkripte aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Lung Granulome

Die Isolierung der einzelnen Dopamin-Neuronen oder der ventralen Haubengebiet mit direkter oder indirekter Immunhistochemie nutzt Laser Mikrodissektion demonstriert. Parameter für die Isolierung von Gewebe aus einem Glasobjektträger unter Verwendung eines Infrarotlasers und aus Membran Folien unter Verwendung der Kombination eines Infrarot und Ultraviolett-Lasers diskutiert.

Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die lasergestützte Mikrodissektion spezifischer Pflanzenzelltypen für die transkriptionelle Profilerstellung. Während das Protokoll für verschiedene Spezies und Zelltypen geeignet ist, liegt der Schwerpunkt bei der Kreuzblütlergattung Boechera auf schwer zugänglichen Zellen der weiblichen Keimbahn, die für die sexuelle und apomiktische Fortpflanzung wichtig sind.

Lasergestützte Mikrodissektion (LAM) als Werkzeug für die Transkriptionsprofilierung einzelner Zelltypen

Lasermikrodissektion (LMD) ist eine empfindliche und hochreproduzierbare Technik, die verwendet werden kann, um Wege aufzudecken, die Gliomheterogenität und Invasion vermitteln. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Isolierung diskreter Bereiche aus Gliomgewebe mittels Laser LMD, gefolgt von transkriptomischer Analyse.

Lasercapture Mikrodissektion von Glioma Subregionen für räumliche und molekulare Charakterisierung der intratumoralen Heterogenität, Oncostreams und Invasion

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Workflow für die künstliche Intelligenz-gesteuerte Segmentierung von pathologiebestätigten Regionen von Interesse aus gefärbten, dünnen Gewebeschnittbildern zur Anreicherung von histologieaufgelösten Zellpopulationen mittels Laser-Mikrodissektion. Diese Strategie beinhaltet einen neuartigen Algorithmus, der die Übertragung von Demarkationen, die Zellpopulationen von Interesse bezeichnen, direkt auf Lasermikroskope ermöglicht.

Industrialisierte, von künstlicher Intelligenz gesteuerte Laser-Mikrodissektion zur mikroskaligen proteomischen Analyse der Tumormikroumgebung

Die Laser-Capture-Mikrodissektion von oralem submukösem Fibrosegewebe ermöglicht die präzise Extraktion von Zellen aus histologischen Regionen von Interesse für die Analyse von Multi-Omics-Daten mit morphologischen und räumlichen Informationen.

Isolierung von Zellen mit morphologischen und räumlichen Informationen aus oralen submukösen Fibroseproben mittels Laser-Capture-Mikrodissektion

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von RNA aus definierten histologischen Regionen von paraformaldehydfixiertem, mit Optimal Cutting Temperatur eingebettetem Mauslebergewebe mittels Laser-Capture-Mikrodissektion, was eine gezielte nachgeschaltete Genexpressionsanalyse ermöglicht.

Laser-Capture-Mikrodissektion von paraformaldehydfixiertem Mauslebergewebe zur RNA-Analyse

Erfahren Sie Laser-Mikrodissektion mit CEL-Seq2 für transkriptomische Analysen einzelner Gewebeproben. Diese Methode ermöglicht genexpressionsstudien bei C. elegans und nicht-modellen Organismen.

Laser-Mikrodissektion für speziesunabhängige Einzelgewebeanwendungen

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