Etablierung von Organoiden aus dem menschlichen Zahn als mächtiges Werkzeug für die mechanistische Forschung und regenerative Therapie

Dieses neue Organoidmodell für menschliche Zähne bietet das erste leistungsfähige Werkzeug, um die Biologie menschlicher zahnzahnmedizinischer Stammzellen mit Perspektiven für zahnregenerative Anwendungen zu entschlüsseln. Derzeit ist dieses Zahnorganoidmodell das einzige verfügbare Werkzeug, um menschliche Zahnepithelstammzellen zuverlässig und robust zu züchten und zu erweitern. Dieses Organoidprotokoll kann angewendet werden, um Forschungsmodelle zu etablieren, nicht nur von gesunden, sondern auch von kranken Zähnen wie Zahntumoren und bakteriellen Auswirkungen.

Die Erforschung solcher Krankheitsmodelle kann neue therapeutische Ziele aufdecken. Dieses Organoidmodell ist sehr hilfreich bei der Entschlüsselung des Schmelzbildungsprozesses im menschlichen Zahn und kann die Konstruktion von Zahnteilen wie Zahnschmelz für generative Zwecke ermöglichen. Das Verfahren wird Lara Hemeryck, Doktorandin in meiner Forschungsgruppe, demonstrieren.

Sammeln Sie zunächst die dritten Molaren mit zugehörigen Zahnfollikeln in dem auf Eis gelegten Entnahmemedium und übertragen Sie den Inhalt der Röhrchen in eine Petrischale. Halten Sie den Zahn mit einer Pinzette fest und isolieren Sie die Zahnfollikel vorsichtig mit einer chirurgischen Klinge. Waschen Sie das restliche Blut von den Zahnfollikeln, indem Sie das Zahnfollikelgewebe für 20 Sekunden kurz in die erste Vertiefung von 70% Ethanol legen, dann für 20 Sekunden auf die nächste Todesethanolplatte und weiter auf die dritte Ethanolquelle.

Spülen Sie es dreimal in phosphatgepufferten Salzbrunnen weiter, gefolgt von einem Spülen der Zahnfollikel in den drei verbleibenden Medienvertiefungen der Zahnfollikelsammlung für insgesamt maximal 20 Minuten. Übertragen Sie die gespülten Zahnfollikel in eine neue Petrischale. Schneiden Sie ein kleines Stück eines der Zahnfollikel für eine Paraformaldehydfixierung ab und lagern Sie es in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern Auffangmedium für maximal sechs Stunden.

Zerkleinern Sie den Rest der Zahnfollikel in kleine Stücke und geben Sie sie in eine 15-Milliliter-Röhre mit vier Millilitern vorgewärmtem Dissoziationsmedium, dann inkubieren Sie die Röhre bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden im Wasserbad. Pipettieren Sie alle 15 Minuten das Dissoziationsmedium der Zahnfollikel und mischen Sie es mit einer Glaspipette auf und ab, um den Gewebezerfall zu beschleunigen. Wenn Zahnfollikelstücke nicht mehr beobachtet werden, fahren Sie mit der Dissoziation mit einer verengten, feuerpolierten Pasteur-Pipette fort.

In der Zwischenzeit bereiten Sie 10 Milliliter Medium A mit 100 Mikrolitern DNase vor und fügen Sie fünf Milliliter dieses Mediums zu jeder Tube mit dissoziierten Zahnfollikeln hinzu. Eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren. Spülen Sie den Filter mit einem Milliliter Medium A.Kombinieren Sie in diesem Schritt die mehreren Röhrchen dissoziierter Zahnfollikel eines Patienten und zentrifugieren Sie die gefilterte Zellsuspension bei 200 mal g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius.

Entfernen Sie den Überstand. Resuspendiert das Pellet in einem Milliliter serumfrei definiertem Medium und überträgt die Zellsuspension auf ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen. Berechnen Sie die Zellkonzentration mit einem automatisierten Zellzähler und berechnen Sie die Anzahl der Vertiefungen, die ausgesät werden können.

Die endgültige Mischung besteht aus Zellsuspension und Basalmembranmatrix in einem Verhältnis von 30 zu 70. Entfernen Sie die entsprechende Menge an Überstand und suspendieren Sie ihn langsam, um ein Verhältnis von 70 zu 30 von eiskalter Basalmembranmatrix zu Zellsuspension für die Beschichtung zu erhalten. Sobald es in der Basalmembranmatrix resuspendiert ist, halten Sie das Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, um eine Erstarrung der Grundmembranmatrix zu vermeiden.

Pipettieren Sie die 20 Mikroliter Basalmembran-Matrixtröpfchen in der Mitte der vorgewärmten 48-Well-Kulturplatte. Drehen Sie die Platte auf den Kopf und legen Sie sie 20 Minuten lang in einen 1,9% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Rho-assoziierten Kinase-Inhibitor und Amphotericin B in das Organoidmedium der Zähne geben und das Medium in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad vorwärmen.

Nehmen Sie die 48-Well-Platte aus dem Inkubator. Setzen Sie es aufrecht und fügen Sie 250 Mikroliter des vorbereiteten vorerwärmten Mediums zu jeder Vertiefung mit einem Basalmembranmatrixtröpfchen hinzu, das die Zellen enthält, und bringen Sie die Platte in den Kohlendioxid-Inkubator zurück. Um das Medium aufzufrischen, neigen Sie die Platte in einem Winkel von 45 Grad.

Entfernen Sie vorsichtig das vorherige Medium, während Sie vermeiden, das Basalmembranmatrix-Tröpfchen zu berühren, und fügen Sie alle zwei bis drei Tage 250 Mikroliter neues vorgewärmtes Zahnorganoidmedium hinzu. Um die Passage der Organoide durchzuführen, entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen mit Organoiden und sammeln Sie bis zu vier konfluierende Brunnen. Um die Organoide zu sammeln, geben Sie 400 Mikroliter eiskaltes, serumfreies definiertes Medium pro Vertiefung direkt auf das Membranmatrixtröpfchen und pipettieren Sie das Medium wiederholt auf und ab, bis sich das gesamte Tröpfchen gelöst hat.

Wenn Vertiefungen gepoolt werden, übertragen Sie die 400 Mikroliter vom ersten Brunnen zum nächsten, um das Organoid enthaltende Tröpfchen zu entfernen. Übertragen Sie die gelöste Organoidanordnung in ein 1,5-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen und wiederholen Sie die Zugabe von serumfreiem definiertem Medium, bis alle Organoidstrukturen aus den Vertiefungen gesammelt sind. Zentrifen Sie es bei 200 mal g für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius.

Entfernen Sie den Überstand aus dem Zentrifugenröhrchen und suspendieren Sie das Pellet in einem vorgewärmten Aliquot von TrypLE Express. Fügen Sie 400 Mikroliter eiskaltes, serumfreies definiertes Medium hinzu, um das Enzym zu inaktivieren, und zentrifugieren Sie es bei 200 mal g für fünf Minuten bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand.

Beschichten Sie eine Spitze mit eiskaltem, serumfrei definiertem Medium vor und suspendieren Sie das Organoidpellet in sterilem Zustand erneut. Suspendiert das Pellet in 200 Mikrolitern eiskaltem, serumfreiem definiertem Medium für die Low-Passage-Methode. Drücken Sie die vollständig entleerte Pipettenspitze gegen den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens, um den Durchmesser zu reduzieren.

Fünf Minuten lang auf und ab pipettieren, um die Organoide mechanisch zu stören. Für die Methode mit höherer Passage wird das Pellet in 700 Mikroliter eiskaltem, serumfrei definiertem Medium mit einer P1000-Spitze resuspendiert. Fügen Sie dieser P1000-Spitze eine P200-Spitze hinzu und beschichten Sie sie mit eiskaltem, serumfreiem definiertem Medium.

Verhindern Sie die Bildung von Luftblasen, indem Sie die Lautstärkeeinstellung der Pipette anpassen. Streben Sie mindestens 90% des mittleren Volumens mit Organoiden an und pipepieren Sie fünf Minuten lang auf und ab, um die Organoide mechanisch zu stören. Die Organoide entwickeln sich typischerweise zwei Wochen nach der Aussaat der Zahnfollikelzellen.

Die Organoide sind langfristig erweiterbar auf bis zu 11 Passagen. Die Aussaat von etwa 20.000 Zellen pro Basalmembranmatrixtröpfchen ergibt eine optimale Dichte an Organoiden, während die Aussaat höherer Zellzahlen zu einem suboptimalen Organoidauswuchs mit ähnlichen Organoiden bei zu hoher Dichte führt, da der Platz zum Wachsen nicht ausreicht. Die entwickelten Organoide zeigen ein dichtes Aussehen und enthalten Zellen mit einem hohen nukleozytoplasmatischen Verhältnis.

Darüber hinaus exprimieren die Organoide den ERM-Marker Cytokeratin 14, der ihren epithelialen Ursprung bestätigt, und andere vorgeschlagene ERM-Marker wie P63, CD44 und Integrin alpha-6. Organoide exprimieren SOX2, einen bekannten DESC-Marker bei Mäusen. Interessanterweise ist der Hauptbestandteil der Schmelzmatrix, Amelogenin, auch in den Organoiden ausgedrückt.

Die Organoide behalten ihren ERMM-Stammheitsphänotyp während des Passaging, wie die stabile Expression von Markern zeigt. Für ein optimales langfristiges Organoidwachstum ist es wichtig, die empfohlenen Passagemethoden zu verwenden, was die niedrige Passage oder die höheren Passagemethoden bedeutet. Einmal gebildet, können die Organoide verwendet werden, um den Amelogeneseprozess weiter zu untersuchen und die Schmelzmatrixablagerung in der zahnmedizinischen Forschung derzeit nicht erreicht zu haben.

Diese Technik ermöglicht die Erforschung der Biologie der dentalen Epithelstammzellen, des Prozesses der Schmelzbildung und der Interaktion mit dem Zahnmesenchym, einem Zusammenspiel, das für die korrekte Zahnbildung unerlässlich ist.