Untersuchung der räumlichen Interaktion zwischen Astrozyten und Neuronen in geräumten Gehirnen
31. März 2022
Die Kombination von viraler Vektortransduktion und Gehirn-Clearing mit der CLARITY-Methode ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung einer großen Anzahl von Neuronen und Astrozyten.
Die Klarheitstechnik, die erstmals 2013 beschrieben wurde, ist eine Gewebereinigungstechnik, die die Probenahme größerer Mengen von Zellen, Blutgefäßen, also sogar Proteinen einer solchen Einzelzellauflösung in dicken Gehirnscheiben ermöglicht. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung intakter mikroskopischer Strukturen, indem sie das gesamte Gehirn transparent macht. Dieses Protokoll ist ein einfacher Chip und eine unkomplizierte Pipeline für Tissue Clear.
Diese Technik kann zur Reinigung von Geweben in anderen Systemen zusätzlich zu Gehirngewebe verwendet werden. Um zu beginnen, verschließen Sie das Rohr und die Kappe mit Parafilm und durchstechen Sie zwei Löcher in die Kappe. Übertragen Sie dann Stickstoffgas aus dem Tank mit einem flexiblen Rohr mit einem Innendurchmesser von fünf Millimetern und einer 19-Gauge-Nadel, die an seinem Ende angeschlossen ist.
Beginnen Sie mit der Entgasung, indem Sie das Rohr am Rohr befestigen und den Gasaustausch für 30 Minuten bei Raumtemperatur ermöglichen. Lösen Sie das Rohr und schließen Sie die Löcher sofort mit Modelliermasse ab. Dann die entgasungsversiegelten Röhrchen für 3 1/2 Stunden in ein 37 Grad Celsius-Bad geben, um die Hydrogellösung zu polymerisieren.
Nimm das Gehirn aus der Röhre heraus. Entfernen Sie mit Labortüchern das polymerisierte Hydrogel um das Gehirn herum, um sicherzustellen, dass kein Restgel an der Oberfläche des Gehirns haftet. Teilen Sie das Gehirn in dicke Scheiben, die alle Bereiche von Interesse enthalten.
Legen Sie die Scheiben in die erste Räumlösung und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit Rotation bei 70 U / min für 24 Stunden. Bereiten Sie in der Zwischenzeit einen perforierten Schlauch vor, um das Gehirn zu platzieren. Legen Sie das perforierte Rohr in ein mit zweiter Räumlösung gefülltes Becherglas auf eine Rührvorrichtung.
Legen Sie dann das Gehirn in das Becherglas und versiegeln Sie es mit Aluminiumfolie, um ein Bleichen zu verhindern. Nachdem das Gewebe transparent geworden ist, übertragen Sie das Gehirn in PBST und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit einer Rotation bei 70 U / min für 24 Stunden. Ersetzen Sie die Lösung durch frisches PBST und setzen Sie die Inkubation für weitere 24 Stunden fort.
Übertragen Sie dann das Gehirn 24 Stunden lang bei Raumtemperatur auf PBS. Entfernen Sie nach 24 Stunden das Gehirn von PBS und übertragen Sie es auf die Brechungsindex-Matching-Lösung. Inkubieren Sie das Gehirn bei 37 Grad Celsius über Nacht.
Platzieren Sie die Probe zunächst in der Mitte des Objektträgers. Erstellen Sie mit Heißkleber Wände an den Rändern des Objektträgers, die fast so hoch sind wie das Gewebe. Achten Sie darauf, eine kleine Lücke an einer der Ecken zu lassen.
Wenn sich die Heißklebeschicht der Höhe der Gehirnscheibe nähert, tragen Sie ein bis zwei Tropfen der Brechungsindex-Matching-Lösung auf die Probe auf, um die obere Oberfläche zu befeuchten und die Bildung von Blasen zu verhindern. Während der Heißkleber noch flüssig ist, verschließen Sie die Oberseite mit einem Deckschlitten, legen Sie sie so gleichmäßig wie möglich und füllen Sie dann die Kammer mit der Brechungsindex-Matching-Lösung. Schließen Sie die Lücke mit Heißkleber.
Wenn die Heißklebewände über die Ränder des Objektträgers hinausragen, schneiden Sie die ausladenden Kanten ab. Wenn ein Öltauchobjektiv für die Bildgebung verwendet wird, fügen Sie weitere zwei bis drei Millimeter Kleber an die Wände über dem Deckglas hinzu, um die Tauchlösung zu erhalten. Nach diesem Protokoll wird das Hirngewebe gereinigt.
Mit diesem Protokoll wurden klare Gehirnschnitte hergestellt, um Populationen von Astrozyten und Neuronen in der CA1-Region des Hippocampus der Maus zu visualisieren. Alle Astrozyten exprimierten tdTomaten und exzitatorische Neuronen exprimierten H2B-GFP in ihren Kernen. Die für das geklärte Gewebe vorbereitete Kammer war optimal für die Bildgebung unter einem Zwei-Photonen- oder Konfokalmikroskop.
Mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop wurden über 300 Astrozyten in einem geräumten Abschnitt der CA1-Region des Hippocampus der Maus beobachtet. Die Hippocampus-Astrozyten in roten und pyramidalen Zellen, Somata in Grün waren sichtbares und dickes, transparentes Gewebe, das die räumliche Nähe zwischen diesen beiden Zelltypen darstellte. Mit einem konfokalen Rasterlasermikroskop wurden axonale Bündel von exzitatorischen Neuronen über eine ganze Hemisphäre verfolgt.
Grüne Bündel wurden vom dorsalen Hippocampus in Richtung der Supermamillarkörper verfolgt. Die roten Bündel wurden von den Brustkörpern bis zu ihrem Ursprung am Hippocampus der Entlüftung verfolgt. Faktoren wie Temperatur, Konzentrationen und Inkubationszeit beeinflussten das Ergebnis des Klarheitsverfahrens.
Daher ist die Präzision in jedem Schritt des Protokolls entscheidend für den Erfolg, klares Gewebe zu erreichen. Mit dieser Technik messen wir die Abstände zwischen Neuronen und Astrozyten in mehreren Gehirnstrukturen. Dieses Protokoll ermöglichte die Analyse von zwei bis drei Größenordnungen mehr Zellen als in früheren Studien.
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Übersicht
Diese Studie verwendet die CLARITY-Methode in Kombination mit viraler Vektor-Transduktion, um die räumlichen Beziehungen zwischen Neuronen und Astrozyten im Maus-Hippocampus zu untersuchen. Durch die Transparenzmachung des Gewebes ermöglicht diese Technik Forschern, eine größere Anzahl von Zellen zu untersuchen und gibt Einblicke in die zelluläre Organisation und Interaktionen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Gewebeklärungstechniken
- Zelluläre Bildgebung
Hintergrund
- Die CLARITY-Technik ermöglicht die Visualisierung von Hirngewebe auf zellulärer Ebene.
- Sie erlaubt die Analyse großer Populationen von Neuronen und Astrozyten in intakten Geweben.
- Diese Methode verbessert die Klarheit dicker Hirnschnitte im Vergleich zu traditionellen Bildgebungsverfahren.
- Die Studie betont die Rolle der Gewebetransparenz für das Verständnis der neuronalen Architektur.
Zweck der Studie
- Untersuchung der strukturellen Beziehungen zwischen Astrozyten und Neuronen im Maus-Hippocampus.
- Messung der Abstände zwischen verschiedenen Zelltypen in verschiedenen Hirnstrukturen.
- Demonstration der Wirksamkeit der CLARITY-Methode für zelluläre Bildgebung.
Verwendete Methoden
- Die Studie verwendete die CLARITY-Technik für die Gewebeklärung in Hirnschnitten.
- Maus-Hippocampus-Gewebe wurde verwendet, um Astrozyten und erregende Neuronen zu visualisieren.
- Es wurden keine Multiomics-Workflows erwähnt.
- Wichtige Schritte umfassten Entgasung, Polymerisation des Hydrogels und Inkubation in Klärlösungen.
- Das Gewebe wurde mit Zwei-Photonen- und Konfokalmikroskopie abgebildet.
Hauptergebnisse
- Über 300 Astrozyten wurden in geklärten Hippocampus-Schnitten visualisiert.
- Der räumliche Kontext von Astrozyten und erregenden Neuronen wurde etabliert und zeigt ihre Nähe.
- Es gab signifikante Beobachtungen von axonalen Bündeln zwischen neuronalen Populationen in geklärten Geweben.
- Verschiedene Faktoren beeinflussten die Klarheit der Gewebe und unterstreichen die Notwendigkeit einer präzisen Methodik.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie zeigt, dass die CLARITY-Methode die Visualisierung zellulärer Beziehungen im Gehirn erheblich verbessern kann.
- Die Ergebnisse ermöglichen ein besseres Verständnis der räumlichen Organisation von Neuronen und Gliazellen.
- Die aus dieser Methode gewonnenen Erkenntnisse könnten Auswirkungen auf die Forschung zu neuronalen Mechanismen und potenziellen Krankheitsmodellen haben.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
High-resolution mapping of astrocyte-neuron spatial interactions in intact brain tissue addresses a critical gap in early CNS target validation and mechanistic de-risking. The integration of viral vector labeling with CLARITY tissue clearing enables quantitative, large-scale analysis of cellular domains, supporting predictive confidence in neurobiological discovery. This capability enhances portfolio triage by providing robust, scalable data on cell-type interactions relevant to disease modeling and target prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of astrocyte-neuron spatial relationships in disease-relevant brain regions.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular domain boundaries and proximity metrics.
- Facilitates functional target validation through genetically defined cell-type labeling and imaging.
- Provides high-content data for predictive confidence in CNS target selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, intact brain tissue systems for downstream imaging-based assays.
- Standardizes sample preparation for reproducible, quantitative spatial measurements.
- Enables scalable imaging of hundreds to thousands of cells per sample for robust screening.
- Supports assay development for compound evaluation targeting neuron-glia interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial mapping outputs with disease-relevant CNS models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by providing quantitative benchmarks for cell-type interactions.
- Supports biomarker discovery through high-resolution mapping of cellular domains.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation in neurobiology portfolios.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content spatial analysis of genetically defined brain cell populations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on astrocyte-neuron interactions and clarifies mechanistic pathways in CNS tissue.
- Screening: Provides reproducible, quantitative spatial readouts for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Delivers cell proximity and domain occupancy metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects spatial mapping data to disease models and biomarker strategies when supported by the system.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for CNS tissue clearing and imaging across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes tissue clearing and imaging for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiological assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector transduction, tissue clearing, and advanced microscopy.
- Demands access to two-photon or confocal imaging platforms and analytical infrastructure.
- Necessitates strict protocol standardization for cross-team reproducibility.
- Adaptation may be needed for different brain regions or model systems.
- Protocol precision is critical; temperature, reagent concentrations, and timing directly affect data quality.
