Etablierung menschlicher Lungenorganoide und proximale Differenzierung zur Erzeugung reifer Atemwegsorganoide

Das Protokoll stellt eine Methode vor, um menschliche Lungenorganoide aus primärem Lungengewebe abzuleiten, die Lungenorganoide zu erweitern und eine proximale Differenzierung zu induzieren, um 3D- und 2D-Atemwegsorganoide zu erzeugen, die das menschliche Atemwegsepithel originalgetreu phänokopieren.

Wir stellen eine Methode vor, um die organoide Kultur des menschlichen Atemwegsepithels in Kulturplatten zu etablieren. Wir leiten menschliches Lungenorganoid direkt aus primärem Lungengewebe mit hoher Effizienz ab. Die abgeleiteten menschlichen Lungenorganoide werden über ein Jahr lang stabil expandiert, und ein proximales Differenzierungsprotokoll ermöglicht die Erzeugung reifer Atemwegsorganoide, die das menschliche Atemwegsepithel bis zu einem nahezu physiologischen Niveau originalgetreu simulieren können.

Daher ermöglicht das Kultursystem den Wissenschaftlern, das menschliche Atemwegsepithel in Kulturplatten zu rekonstruieren und zu erweitern. Man Chun Chiu und Yifei Yu, Doktoranden in unserem Labor demonstrieren Um mit der Zellisolierung aus menschlichem Lungengewebe für die 3D-Organoidkultur zu beginnen, zerkleinern Sie das Lungengewebe in ein Millimeter kleine Stücke mit einem sterilen Skalpell und waschen Sie die Gewebestücke mit 10 Milliliter kaltem Basalmedium. Zentrifugieren Sie das Gewebe bei 400 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in acht Milliliter Basalmedium, ergänzt mit Kollagenase, in einer Endkonzentration von zwei Milligramm pro Milliliter wieder suspendieren.

Verdauen Sie dann die Gewebestücke, indem Sie den Schlauch bei 120 U / min für 30 bis 40 Minuten bei 37 Grad Celsius schütteln. Nach der Verdauung 20 Mal mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren, um die verdauten Gewebestücke zu scheren. Filtern Sie dann die Suspension mit einem 100-Mikron-Sieb in ein 50-Milliliter-Rohr.

Die Gewebestücke werden vom Sieb zurückgewonnen und mit dem Basalmedium in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Um die Verdauung zu beenden, fügen Sie dem Durchfluss fötales Rinderserum bis zu einer Endkonzentration von 2% hinzu, zentrifugieren Sie dann das Röhrchen und suspendieren Sie das Zellpellet wie zuvor beschrieben in 10 Milliliter des Basalmediums. Nach der Zentrifugation wird das Pellet in 80 bis 160 Mikroliter kaltem Grundmatrixmedium resuspendiert und die Röhrchen auf Eis gelegt.

Als nächstes geben Sie 40 Mikroliter der Suspension an jede Vertiefung einer vorgewärmten 24-Well-Suspensionskulturplatte ab. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten. Lassen Sie die Kellermatrix erstarren und ein Tröpfchen bilden.

Nach der Inkubation fügen Sie 500 Mikroliter menschliches Lungenorganoid-Expansionsmedium, ergänzt mit fünf Nanomolar Heregulin-beta 1, zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator. Entfernen Sie nach drei Tagen das alte Medium, während Sie das Tröpfchen intakt halten, und fügen Sie vorsichtig frisches Medium hinzu. Beobachten Sie die Organoide nach 10 bis 14 Tagen des Passierens unter einem Mikroskop und stellen Sie sicher, dass die Organoide nicht mit einer sehr hohen Zelldichte eingebettet sind.

Um die Lungenorganoide mit Scherung zu passieren, brechen Sie die Tröpfchen, indem Sie mit einer Ein-Milliliter-Spitze auf und ab pipettieren. Übertragen Sie dann die Organoide zusammen mit dem Medium in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und stellen Sie das Volumen mit einem kalten Basalmedium auf 10 Milliliter ein. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Organoide mit 10 Millilitern kaltem Basalmedium.

Dann suspendieren Sie die Organoide in zwei Millilitern kaltem Basalmedium und scheren Sie sie mit einer Pasteur-Pipette in kleine Stücke. Als nächstes fügen Sie Basalmedium zu einem Gesamtvolumen von 10 Millilitern hinzu und zentrifugieren, bevor Sie die Organoidfragmente mit einer kalten Basalmatrix auffüllen, die ausreicht, um eine 1: 3 bis 1: 5-Expansion zu ermöglichen, und legen Sie die Röhrchen auf Eis. Dosieren Sie 40 Mikroliter Organoidsuspension in jeder Vertiefung einer vorerwärmten 24-Well-Platte, um bei 37 Grad Celsius zu inkubieren, damit die Kellermatrix für 10 bis 15 Minuten erstarren kann.

Später fügen Sie 500 Mikroliter Lungenorganoid-Expansionsmedium zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie in einem Zellkultur-Inkubator. Erfrischen Sie das Medium alle drei Tage und passieren Sie die Organoide alle zwei Wochen. Um Lungenorganoide mit Trypsinisierung zu passieren, resuspendieren Sie geerntete Lungenorganoide in einem Milliliter Dissoziationsenzym.

Inkubieren Sie das Organoid in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für drei bis fünf Minuten. Dann fügen Sie einen Milliliter Basalmedium zum Rohr hinzu und scheren Sie die Organoide mechanisch, indem Sie nach oben und unten pipettieren. Überprüfen Sie die Größe der Organoidstücke unter einem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung, bevor Sie die Verdauung mit 40 Mikrolitern fetalem Rinderserum beenden.

Stellen Sie das Volumen mit Basalmedium und Zentrifuge auf 10 Milliliter auf, bevor Sie die Organoidstücke in einer kalten Kellermatrix mit einem Volumen aussetzen, das ausreicht, um mit einem Verhältnis von 1: 5 bis 1: 10 zu passieren. Später dosieren Sie 40 Mikroliter Organoidsuspension in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte und kultivieren Sie die Platte wie zuvor gezeigt. Um 3D-Atemwegsorganoide zu erzeugen, inkubieren Sie die Lungenorganoide im Expansionsmedium für sieben bis 10 Tage nach dem Passieren durch mechanische Scherung.

Ersetzen Sie dann das Expansionsmedium durch proximales Differenzierungsmedium und inkubieren Sie die Organoide in einem Zellkulturinkubator. Nach 14 Tagen entsorgen Sie das Medium in jeder Vertiefung und fügen Sie Zelllysatpuffer hinzu, um das differenzierte Atemwegsorganoid für die RNA-Extraktion und den Nachweis der zellulären Genexpression durch RT-qPCR-Assay zu ernten. Vorinkubieren Sie die Einsätze im Zellkultur-Inkubator mit 250 bzw. 500 Mikrolitern des Basalmediums in der oberen und unteren Kammer einer 24-Well-Platte.

Dann fügen Sie einen Milliliter Basalmedium in die Röhre hinzu und pipettieren Sie auf und ab, um die Organoide in einzelne Zellen zu scheren. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, bevor Sie die Verdauung mit 40 Mikrolitern fetalem Rinderserum beenden. Filtern Sie die Zellen durch ein 40-Mikron-Sieb in ein 50-Milliliter-Rohr und übertragen Sie die gefilterte Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Rohr.

Füllen Sie die Suspension mit Basalmedium auf ein Gesamtvolumen von 10 Millilitern auf. Nach der Zentrifugation resuspendiert das aus 24 Tröpfchen gesammelte Pellet in 1 bis 2,5 Milliliter Lungenorganoid-Expansionsmedium, abhängig von der Zelldichte. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit dem Zellzähler unter einem Mikroskop und passen Sie dann die Zellkonzentration auf 1,3 mal 10 bis sechs pro Milliliter für 24-Well-Einsätze an.

Entfernen Sie das Basalmedium aus der oberen und unteren Kammer, bevor Sie 500 Mikroliter Expansionsmedium in die untere Kammer geben. 100 Mikroliter Zellsuspension zuvor auf die apikale Kammer des 24-Well-Einsatzes auftragen und inkubieren. Ersetzen Sie nach zwei Tagen das Expansionsmedium durch proximales Differenzierungsmedium sowohl in der apikalen als auch in der unteren Kammer der Platte.

Inkubieren Sie die Organoide für 14 Tage und erfrischen Sie das Medium alle drei Tage. Messen Sie den transepithelialen elektrischen Widerstand jeden Tag mit einem elektrischen Widerstandsmesssystem. Auf der repräsentativen Mikrofotografie sind die frisch isolierten Lungenzellen zu sehen, die in die Basalmembranmatrix Typ zwei mit reduziertem Wachstumsfaktor eingebettet sind.

Die zystischen Organoide wurden im Laufe der Zeit gezeigt und gezüchtet. Hier werden die Lungenorganoide nach der vierten Passage demonstriert. Innerhalb von zwei Stunden nach der mechanischen Scherung bildeten die in den Basalmembranextrakt eingebetteten Organoidfragmente die zystischen Domänen.

Die Mikrofotografie des gleichen Feldes am fünften Tag bestätigte das Organoidwachstum im Laufe der Zeit. Die expandierenden Organoide beherbergten alle vier wichtigsten Epithelzelltypen der Atemwege, einschließlich ACCTUB-positiver oder FOXJ1-positiver Flimmerzelle, P63-positiver Basalzelle, CC10-positiver Clubzelle und MUC5AC-positiver Kelchzelle in einem vorzeitigen Zustand. Die im Expansions- und Proximaldifferenzierungsmedium inkubierten Organoide entwickelten im Laufe der Zeit eine ausgeprägte Morphologie.

Nach zwei Wochen Differenzierung im proximalen Differenzierungsmedium waren in jedem Organoid bewegliche Zilien erkennbar. Es wurde beobachtet, dass die synchron schlagende Celia die Zelltrümmer in das Organoidlumen trieb und sie unidirektional wirbelte, um die eingeatmeten Partikel zu entfernen. Weiterhin zeigte die Durchflusszytometrie-Analyse, dass die differenzierten Organoide vier Atemwegsepithelzelltypen in proximalem Differenzierungs- und Expansionsmedium beherbergten.

Nach zweiwöchiger Differenzierung entwickelten 2D-Atemwegsorganoide eine intakte Epithelbarriere. Ein Dextran-Blockade-Assay wurde durchgeführt, um die Integrität der Epithelbarriere zu beurteilen, die in 2D-Atemwegsorganoiden gebildet wird. Die 2D-Organoide enthielten reichlich bewimperte Zellen.

Das langfristig erweiterbare Lungenorganoid und das differenzierte Atemwegsorganoid bieten ein physiologisch aktives und universelles Modellsystem für die Untersuchung der Atemwegsbiologie und -pathologie, einschließlich COVID-19.