Name: Charakterisierung der Salmonella Typhimurium-induzierten septischen Peritonitis bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Lernen Sie die Induktion einer gramnegativen monobakteriellen Sepsis bei Mäusen mit Salmonella Typhimurium. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung inflammatorischer und letaler Immunantworten.

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Wir danken der Central Animal Facility, IISc, für die Bereitstellung von Mäusen für die Forschung. Diese Studie wurde durch Zuschüsse an DpN vom Department of Biotechnology and Science and Engineering Research Board der indischen Regierung finanziert. Die infrastrukturelle Unterstützung durch das DBT-IISc-Programm und die DST-FIST-Zuschüsse werden sehr anerkannt. Wir danken allen bisherigen und aktuellen Mitgliedern des DpN-Labors für ihre Unterstützung.

Alle Experimente mit Salmonella Typhimurium wurden in Einrichtungen der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt. Es muss darauf geachtet werden, dass eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) verwendet, die Sicherheit gewährleistet und die Standardmethoden zur Entsorgung von BSL-2-Biogefahren befolgt werden. Alle Mäuseexperimente wurden nach den Richtlinien des Institutional Animal Ethics Committee, IISc, durchgeführt. Mäuse wurden in der Central Animal Facility von IISc (Registrierungsnummer: 48/1999/CPCSEA, vom 1.3.1999) gezüchtet und gepflegt, die vom Ministerium für Umwelt und Wald der indischen Regierung genehmigt wurde. Die Versuchsprotokolle wurden vom Committee for Purpose and Control and Supervision of Experiments on Animals mit der genehmigten Genehmigungsnummer CAF/Ethics/797/2020 genehmigt.
BSL2-Definition: Eine BSL2-Einstufung bedeutet, dass die biogefährlichen Wirkstoffe eine moderate Bedrohung für die Umwelt und das Laborpersonal darstellen5.
1. Kulturzubereitung von Salmonella Typhimurium         
<ol><li>100 μL Salmonella Typhimurium NCTC 12023 Glycerinbrühe in 3 ml Luria Bertani (LB) Brühe geben. Inkubieren Sie die Kultur bei 160 U / min bei 37 ° C über Nacht.</li>
	<li>50 μL der über Nacht angebauten Kultur in LB-Brühe auf eine Salmonella Shigella (SS) Agarplatte streichen und bei 37 °C für ~12 h inkubieren. Lagern Sie die SS-Agarplatte mit den Bakterienkolonien vor dem In-vivo-Infektionsexperiment mehrere Tage bei 4 °C.</li>
	<li>Wählen Sie eine einzelne Kolonie von der gestreiften SS-Agarplatte mit einer Mikrospitze aus. Werfen Sie die Mikrospitze über Nacht in 3 ml LB-Brühe und Kultur bei 160 U / min bei 37 ° C.</li>
	<li>Fügen Sie 0,1 ml der Bakterienkultur zu 50 ml LB-Brühe hinzu und inkubieren Sie bei 37 ° C in einem Shaker-Inkubator bei 160 U / min für 3-4 h, um die logarithmische Wachstumsphase zu erreichen. Verdünnen Sie die Kultur um den Faktor 2 mit LB-Brühe. HINWEIS: Während der logarithmischen Phase sind Bakterienzellen bei bester Gesundheit und teilen sich aktiv.</li>
	<li>Messen Sie die optische Dichte (OD) der Kultur bei 600 nm Wellenlänge des Lichts in einem Spektralphotometer oder Mikroplattenleser. Sobald die OD 1,0 erreicht hat, machen Sie zwei Aliquots von 1 ml Kultur in 1,5 ml Mikrofugenröhrchen.</li>
	<li>Zentrieren Sie die Röhrchen bei 7.750 × g für 15 min. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 1 ml 1x PBS 2x. Zentrifen Sie die Röhrchen bei 7.750 × g für 15 min.</li>
	<li>Resuspendiert das Pellet in 0,5 ml von 1x PBS in zwei verschiedenen 1,5 ml Mikrofugenröhrchen. Kombinieren Sie die Suspensionen aus beiden Rohren zu einem 1,5-ml-Rohr, das jetzt ~ 2 × 108 koloniebildende Einheiten (CFU) / ml enthält.</li>
	<li>Bereiten Sie eine bakterielle Zellsuspension von 1 × 106 KBE/ml vor, indem Sie diese Stammlösung verdünnen. ACHTUNG: Optimieren Sie die CFU, die OD entspricht, unter bestimmten Laborbedingungen, um die CFU für OD 1.0 zu bestimmen, bevor Sie mit den Experimenten beginnen.</li>
</ol>2. Mäuse und Infektionen
<ol><li>Haus 8-10 Wochen alte männliche C57BL / 6 Mäuse mit einem Gewicht von ~ 20 g im Reinluftraum der Tieranlage für mehrere Tage zur Akklimatisierung.</li>
	<li>Halten Sie am Tag der Infektion die Maus mit einer Hand, wischen Sie die Bauchhaut mit 70% Ethanol ab und spreizen Sie die Hinterbeine für eine bessere Zugänglichkeit der Bauchdecke.</li>
	<li>Injizieren Sie 0,5 ml 1 × 106 KBE/ml Bakteriensuspension intraperitoneal mit Hilfe einer 1 ml Spritze. Daher erhält jede Maus 5 × 105 KBE. Kontrollieren Sie, nicht infizierte Mäuse erhalten allein 0,5 ml PBS. Nach der Infektion die Kultur zur Überprüfung der tatsächlich injizierten CFU auffüllen, die zwischen 0,2 und 0,8 Millionen KBE / 0,5 ml variieren kann.</li>
	<li>Legen Sie die Mäuse wie zugewiesen wieder in die Käfige.</li>
	<li>Opfern Sie die Mäuse mit CO2 Asphyxiation ~ 12-18 h nach der Infektion für die beste Reaktion. Normalerweise sterben alle infizierten Mäuse innerhalb von 96 h. Unter einigen experimentellen Interventionen können einige Mäuse überleben. Euthanasieren Sie diese Mäuse nach 96 h. Euthanasieren Sie auch jede Maus mit einer Körpertemperatur unter 33,2 ° C und akutem Stress bei 96 h als humanen Endpunkt. HINWEIS: In diesem Modell können einige Mäuse nach 12 Stunden Salmonelleninjektion zu sterben beginnen. Planen Sie daher ordnungsgemäß Experimente mit mehreren Zeitpunkten.</li>
</ol>3. Bewertung von Organen durch die KBE
<ol><li>Opfern Sie die infizierte Maus durch CO 2-Ersticken und wischen Sie den Bauch mit einem Stück Baumwolle ab, das in 70% Ethanol getaucht ist. Schneiden Sie die Bauchhaut auf. Im Artikel von Ray und Dittel finden Sie ein Videoprotokoll zum Sammeln von Peritonealspülflüssigkeit6. Schneiden Sie die Peritonealhöhle auf und sammeln Sie die interessierenden Organe in Mikrofugenröhrchen. Da das Blut bei Mäusen mit Sepsis schnell koaguliert wird und die Mengen niedrig sind, sammeln Sie es nach dem Opfer schnell. HINWEIS: Dieses Video zeigt die Aufzählung von Organ-CFU aus der Leber, da die Leber in diesem Sepsismodell umfangreiche histopathologische Schäden erleidet.</li>
	<li>Schneiden Sie ein kleines Stück der Leber und legen Sie es in einen Mikrofugenschlauch. HINWEIS: Diese kann maximal 2-3 h auf Eis gelagert werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird.</li>
	<li>Wiegen Sie die Teile und geben Sie sie in Mikrozentrifugenröhrchen. Vorzugsweise schneiden Sie Stücke mit einem Gewicht von ~ 10-15 mg für eine ordnungsgemäße Homogenisierung. Verwenden Sie ganze Organe bei kleineren wie den mesenterialen Lymphknoten (MLNs) oder dem Thymus.</li>
	<li>Geben Sie 0,5 ml 1x PBS in das Röhrchen und homogenisieren Sie die Organe mit einem Handhomogenisator. Stellen Sie sicher, dass die Organe vollständig homogenisiert sind. Erhöhen Sie die Lautstärke auf 1 ml, indem Sie 0,5 ml von 1x PBS hinzufügen.</li>
	<li>Die Röhrchen bei 200 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Sammeln Sie den Überstand in frischen Mikrofugenröhrchen und bereiten Sie Verdünnungen von 1 × 10−1 und 10−2 in einer 96-Well-Platte vor.</li>
	<li>50 μL des Verdünnungsmittels auf frische SS-Agarplatten verteilen und die Platten bei 37 °C für 12 h inkubieren.</li>
	<li>Zählen Sie die Anzahl der Kolonien, die in jeder Bedingung auftreten, und normalisieren Sie die Daten mit dem Organgewicht mit Gleichung (1): KBE/mg = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63695/63695eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1) HINWEIS: Die Zahl 20 wird in der Formel verwendet, um die Kolonien pro Platte in CFU/ml umzurechnen. Diese Zahl ergibt sich, indem man 1 ml durch die Menge eines gegebenen Volumens der Kulturplattierung - in diesem Fall 50 μL - dividiert. Wenn beispielsweise 100 Kolonien in einer SS-Agarplatte gefunden werden, in der 50 μL einer 1 × 10-1 Verdünnung eines homogenisierten Organs mit einem Gewicht von 10 mg verteilt sind, dann gilt KBE/mg = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63695/63695eq02.jpg" style="margin: auto;">
</li>
</ol>4. Durchflusszytometrische Analyse verschiedener Immunzellpopulationen in Peritonealexsudat
<ol><li>Sammeln Sie die Peritonealzellen, wie zuvor von Ray und Dittel6 beschrieben.</li>
	<li>Resuspendiert das Zellpellet aus peritonealer Lavageflüssigkeit in 1 ml RPMI, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS). Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in der Peritonealspülung mit einem Hämozytometer auf. Passen Sie die Zellzahl so an, dass jede Röhre 0,2-0,5 Millionen Zellen erhält. HINWEIS: Peritoneale Lavage bei Mäusen mit Sepsis kann RBCs enthalten, die wahrscheinlich aufgrund von Blutungen auftreten. Achten Sie darauf, RBCs auszuschließen, während Sie Peritonealzellen zählen. Im Hellfeldmikroskop erscheinen Erythrozyten viel kleiner als die Immunzellen. Diese erscheinen als flache Scheiben oder Donuts, rund, mit einer Vertiefung in der Mitte, aber nicht hohl. Ein Schritt zur Lyse von RBCs kannhinzugefügt werden 7.</li>
	<li>Drehen Sie die Zellen bei 200 × g bei 4 °C für 10 min nach unten, entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen 1x mit 1x kaltem PBS. Zentrifen Sie die Zellen bei 200 × g bei 4 °C für 10 min.</li>
	<li>Blockieren Sie die FC-Rezeptoren auf PECs mit FcR-Blocker (1:400 Verdünnung), hergestellt in Blockpuffer, bestehend aus 5% FBS und 0,02% Natriumazid in PBS. 15 min auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 × g bei 4 °C für 10 min. Verwerfen Sie den Überstand. Verdünnen Sie die fluorochromkonjugierten Antikörper, die im Blockpuffer von Interesse sind. Verwenden Sie eine 1:500-Verdünnung von Anti-Maus-LY6G, um die Neutrophilen zu färben. HINWEIS: Andere Immunzellpopulationen können ebenfalls nachgewiesen werden, z. B. mit Anti-Maus-B220 für B-Zellen, Anti-Maus-CD3 für T-Zellen und Anti-Maus-F4/80 für Makrophagen.</li>
	<li>Inkubieren Sie ~ 0,2 Millionen Zellen in 200 μL der verdünnten Lösungen von Antikörpern in separaten Röhrchen. Stellen Sie als Negativkontrolle ein Röhrchen in jedem Fluorochromtyp für die ungefärbte Kontrolle zur Verfügung, um die Zellen mit 200 μL blockierendem Puffer ohne Antikörper zu inkubieren.</li>
	<li>Brüten Sie die Proben auf Eis für 45 Minuten mit intermittierendem Klopfen alle 15 Minuten aus.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 × g für 10 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für ~ 15 min bei Raumtemperatur, wenn sie mehrere Tage gelagert werden müssen. Am besten ist es jedoch, Daten von frisch gefärbten Proben in einem Durchflusszytometer zu erfassen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μL FACS-Färbepuffer (2% FBS in PBS). Erfassen Sie die Daten in einem Durchflusszytometer.</li>
</ol>

<ol><li>Hotchkiss, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+and+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Sepsis and septic shock.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).</li>
<li>Rudd, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regional%2C+and+national+sepsis+incidence+and+mortality%2C+1990-2017%3A+Analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).</li>
<li>Vincent, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+study+of+the+prevalence+and+outcomes+of+infection+in+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units.</a> JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).</li>
<li>Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+murine+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Infections%22%5BJournal%5D)">Current murine models of sepsis.</a> Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).</li>
<li>Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+and+biohazards%3A+Understanding+biosafety+levels+and+meeting+safety+requirements+of+a+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22Biobanking%22%5BJournal%5D)">Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank.</a> Biobanking. 1897, 213-225 (2019).</li>
<li>Ray, A., Dittel, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mouse+Peritoneal+Cavity+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488(2010).</li>
<li>Liu, X., Quan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+isolation+from+mouse+femur+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Immune cell isolation from mouse femur bone marrow.</a> Bio-protocol. 5 (20), 1631(2015).</li>
<li>Yadav, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+2+enhances+the+survival+of+mice+during+Salmonella+Typhimurium+infection-induced+sepsis+by+increasing+reactive+oxygen+species%2C+inflammatory+cytokines+and+recruitment+of+neutrophils+to+the+peritoneal+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity.</a> Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).</li>
<li>Verma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+hemoglobin+is+a+marker+of+systemic+inflammation+in+mouse+models+of+sepsis%3A+A+Raman+spectroscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study.</a> Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).</li>
<li>Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+mouse+peritoneal+macrophages%3A+Heterogeneity%2C+development%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function.</a> Frontiers in Immunology. 6, 225(2015).</li>
<li>Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+pathophysiology+of+sepsis%2C+an+inflammatory+disorder%3A+Key+roles+of+oxidative+and+nitrosative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress.</a> Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2(2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Induktion einer schweren Form der bakteriellen Sepsis durch intraperitoneale Injektion von Salmonella Typhimurium. Dieses Modell ist vorteilhaft gegenüber anderen, da Salmonella Typhimurium ein intrazellulärer Erreger und daher hoch pathogen ist und den klinisch relevanten Zustand der gramnegativen Sepsis nachahmt. Das Ergebnis der Peritonitis-Sepsis in diesem Modell ist systemisch, mit 100% Mortalität innerhalb von 96 h nach der Infektion. Daher ist dieses Mod...

Sepsis ist definiert als eine fehlregulierte systemische Entzündungs- und Immunantwort auf mikrobielle Invasion oder Gewebeschäden, die zu Organverletzungen führen, die weit vom Ort der Infektion oder Schädigung entfernt sind. Der septische Schock ist eine Untergruppe der Sepsis, die durch eine Hypotonie gekennzeichnet ist, die während der Volumenreanimation anhält, mit einem wesentlich erhöhten Mortalitätsrisiko1. Die breite Öffentlichkeit ist sich dieser Störung während der COVID-19-Pandemie bewusster geworden. Trotz der hohen assoziierten Mortalität fehlen aufgrund der Komplexität der Diagnose umfassende epidemiologische Daten zur globalen Belastung durch Sepsis. Im Jahr 2017 gab es weltweit 48,9 Millionen Sepsis-Inzidenzen und 11 Millionen Todesfälle, was 19,7% aller weltweiten Todesfälleentspricht2. Darüber hinaus ergab eine Studie über die erweiterte Prävalenz von Infektionen und damit verbundenen Sepsis bei Patienten auf der Intensivstation, dass 62% der positiven Isolate von Patienten gramnegative Organismenwaren 3.
Zunächst konzentrierten sich die Untersuchungen zur Sepsis auf die Abgrenzung der mikrobiellen Pathogenese. Das Verständnis der "Gefahrenhypothese", die diktiert, wie der Wirt das Selbst und das Nicht-Selbst unterscheidet, führte jedoch dazu, dass das Gleichgewicht der Sepsisforschung in Richtung Verständnis der Reaktion des Wirts auf einen eindringenden Krankheitserreger kippte. Zu den weit verbreiteten Mäusemodellen der Sepsis gehören das Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte Endotoxämiemodell, polymikrobielle Sepsismodelle, cecal ligation and puncture (CLP) und colon ascendens stent peritonitis (CASP) und monobakterielle Infektionsmodelle4.
Wir haben ein Mausmodellsystem standardisiert, indem wir eine Peritoneussepsis mit Salmonella Typhimurium induzieren. Dieses Modell ist vorteilhaft gegenüber anderen, da Salmonella Typhimurium ein intrazellulärer Erreger ist, der den klinisch relevanten Zustand der gramnegativen Sepsis nachahmt. Das Ergebnis der Peritonitis-Sepsis in diesem Modell ist systemisch, mit 100% Mortalität innerhalb von 96 h nach der Infektion. Daher ist dieses Modell maßgeblich an der Untersuchung der entzündlichen und tödlichen Wirtsreaktionen beteiligt. In diesem Modell wird Sepsis induziert, indem intraperitoneal 0,5 Millionen koloniebildende Einheiten (CFU) Salmonella Typhimurium in eine 8-10 Wochen alte C57BL / 6-Maus injiziert werden. Eine systemische Infektion kann durch die Beurteilung der Organbakterienbelastung ~ 16 h nach der Infektion bestätigt werden. Dieser Artikel zeigt die Salmonella Typhimurium-induzierte Peritonitis-Sepsis bei Mäusen, charakterisiert die daraus resultierenden Veränderungen in der peritonealen Zellzusammensetzung und quantifiziert die bakterielle Belastung in verschiedenen Organen.

<table><tbody><tr><td>Verbrauchsmaterialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL Sterile Spritze mit 26 g</td><td>Nadel Beckton Dickinson, Singapur</td><td>303060</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Tarsons, USA</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Sterile Spritze mit 21 g Nadel</td><td>Beckton Dickinson, Spanien</td><td>307758</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konuskolben</td><td>Tarsons, USA</td><td>441150</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Messschieber-Zentrifugenröhrchen</td><td>Tarsons, USA</td><td>546041</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Mess-Zentrifugenröhrchen</td><td>Tarsons, USA</td><td>546021</td><td></td></tr><tr><td>Zellspreizer</td><td>VWR, USA</td><td>VWRU60828-680</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>HiMedia, Mumbai, Indien</td><td>TS1006</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983 FcR-Blocker</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FITC Ratte Anti-Maus Ly6G (Klon 1A8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>551460</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Handbasierter Homogenisator</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hämozytometer (Neubauer-Zählkammer)</td> <td>Rohem, Indien</td><td>I.S. 10269</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani Bouillon</td><td>HiMedia, Mumbai, Indien</td><td>M1245</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Petriplatten</td><td>Tarsons, USA</td><td>460091</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Himedia, Mumbai, Indien</td><td>AT060-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Salmonellen-Shigella-Agar</td><td>HiMedia, Mumbai, Indien</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstungen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Kubota</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD FACSverse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>N-biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waage</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

charakterisierung der salmonella typhimurium-induzierten septischen peritonitis bei mäusen

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

Sepsis ist eine fehlregulierte Immunantwort des Wirts auf mikrobielle Invasion oder Gewebeschäden, die zu Organverletzungen an einer Stelle führt, die von der der Infektion oder des Schadens entfernt ist. Derzeit umfassen die weit verbreiteten Mäusemodelle der Sepsis Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte Endotoxämie, cecal ligation and puncture (CLP) und monobakterielle Infektionsmodellsysteme. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung der Wirtsreaktionen während der durch Salmonella Typhimurium-Infektion induzierten septischen Peritonitis bei Mäusen. S. Typhimurium, ein gramnegativer intrazellulärer Erreger, verursacht bei Mäusen eine typhusähnliche Erkrankung.
Dieses Protokoll entwickelt die Kulturvorbereitung, die Induktion einer septischen Peritonitis bei Mäusen durch intraperitoneale Injektion und Methoden zur Untersuchung systemischer Wirtsreaktionen. Weiterhin wird die Beurteilung der Keimbelastung in verschiedenen Organen und die durchflusszytometrische Analyse erhöhter Neutrophilenzahlen in der Peritonealspülung vorgestellt. Salmonelle Typhimurium-induzierte Sepsis bei Mäusen führt zu einem Anstieg der proinflammatorischen Zytokine und einer schnellen Infiltration von Neutrophilen in der Peritonealhöhle, was zu einem geringeren Überleben führt.
Jeder Schritt in diesem Protokoll wurde optimiert, was zu einer hohen Reproduzierbarkeit der Pathogenese der septischen Peritonitis führt. Dieses Modell ist nützlich für die Untersuchung immunologischer Reaktionen während bakterieller Sepsis, der Rolle verschiedener Gene im Krankheitsverlauf und der Auswirkungen von Medikamenten zur Abschwächung der Sepsis.

Eine detaillierte Charakterisierung der Immunantwort des Wirts mit diesem speziellen Modell ist in früheren Publikationengezeigt 8,9. Einige repräsentative Ergebnisse des beschriebenen Protokolls werden in diesem Abschnitt dargestellt. Dieses Modell zielt darauf ab, eine systemische Infektion von S zu induzieren. Typhimurium durch intraperitoneale Injektion der Bakterienkultur zur Induktion einer Sepsis. Um die Infektion zu bestätigen, wurden die Lysate ...

Dieses Protokoll beschreibt die Induktion einer gramnegativen monobakteriellen Sepsis in einem Mausmodellsystem. Das Modell ist nützlich bei der Untersuchung der entzündlichen und tödlichen Wirtsreaktionen während der Sepsis.

Charakterisierung der Salmonella Typhimurium-induzierten septischen Peritonitis bei Mäusen

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection ...

Sepsis ist eine fehlregulierte Immunantwort des Wirts auf mikrobielle Invasion oder Gewebeschäden, die zu Organverletzungen an einer Stelle führt, die von der der Infektion oder Schädigung entfernt ist. Die breite Öffentlichkeit ist sich dieser Störung während der COVID-19-Pandemie bewusster geworden. Im Jahr 2017 gab es weltweit 48,9 Millionen Sepsis-Inzidenzen und 11 Millionen Todesfälle, was fast 20% aller weltweiten Todesfälle entspricht.Wie zu erwarten, befinden sich die meisten Fälle in Krankenhäusern. Tatsächlich ergab eine Studie, dass fast 62% der positiven Isolate von Patienten auf Intensivstationen mit Sepsis gramnegative Organismen waren. Es gibt mehrere Modelle, und einige der häufig verwendeten Mäusemodelle der Sepsis umfassen LPS-induzierte Endotoxämie, das cecal Ligations- und Punktionsmodell und die monobakteriellen Infektionsmodellsysteme.In unserem Labor haben wir ein Mausmodellsystem standardisiert, um eine Peritoneussepsis mit Salmonella Typhimurium zu induzieren. Dieses Modell ist vorteilhaft gegenüber anderen, da Salmonella Typhimurium ein intrazellulärer Erreger ist, der den klinisch relevanten Zustand der gramnegativen Sepsis nachahmt. Das Ergebnis der Peritonitis-Sepsis in diesem Modell ist systemisch mit 100% Mortalität, innerhalb von 96 Stunden nach der Infektion.Daher ist dieses Modell maßgeblich an der Untersuchung der Entzündungsreaktionen des Wirts beteiligt. In diesem Modell wird Sepsis durch intraperitoneale Injektion von 0,5 Millionen CFE Salmonella Typhimurium in eine 8-10 Wochen alte C57BL / 6-Maus induziert. Eine systemische Infektion kann durch die Beurteilung der bakteriellen Belastung des Organs etwa 16 Stunden nach der Infektion bestätigt werden.Die Experimente mit Salmonella Typhimurium erfordern eine BSL-2-Einrichtung und die Einhaltung der BSL-2-Richtlinien. Es muss darauf geachtet werden, dass eine ordnungsgemäße PSA verwendet wird, die Sicherheit gewährleistet ist, und die Standard-BSL-2-Biohazard-Entsorgungsmethoden befolgen. Alle Experimente wurden von der institutionellen Tierethikkommission genehmigt.Kulturzubereitung von Salmonella Typhimurium. Fügen Sie hundert Mikroliter Salmonella Typhimurium NCTC 12023 Glycerinbrühe in 3 ml LB-Brühe hinzu. Inkubieren Sie die Kultur mit 160 Umdrehungen pro Minute, bei 37 Grad Celsius über Nacht.50 Mikroliter der über Nacht angebauten Kultur in LB-Brühe auf eine Salmonella Shigella-Agarplatte streichen und bei 37 Grad Celsius für 12 Stunden inkubieren. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus der gestreiften SS-Agarplatte mit einer Mikrospitze aus. Werfen Sie die Mikrospitze in 3 ml LB-Brühe aus und kultivieren Sie sie über Nacht bei 160 U / min bei 37 Grad Celsius.Fügen Sie 0,1 ml der Bakterienkultur in 50 ml LB-Brühe hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem Shaker-Inkubator bei 160 U / min für drei bis vier Stunden, um die logarithmische Wachstumsphase zu erreichen. Verdünnen Sie die Kultur mit LB-Brühe um den Faktor zwei. Messen Sie die optische Dichte der Kultur bei 600 Nanometer Wellenlänge des Lichts in einem Spektralphotometer.Sobald die OD eins erreicht hat, machen Sie zwei Aliquots von 1 ml Kultur in 1,5 ml Mikrofugenröhrchen. Zentrieren Sie die Röhrchen bei 7.750 G für 15 Minuten. Entsorgen Sie diesen Überstand und waschen Sie das Pellet zweimal mit 1 ml 1XPBS.Zentrieren Sie die Röhrchen bei 7.750 G für 15 Minuten. Resuspendiert das Pellet in 0,5 ml von 1XPBS in zwei verschiedenen 1,5 ml Mikrofugenröhrchen. Kombinieren Sie die Suspensionen aus beiden Rohren zu einer 1,5-ml-Röhre, die jetzt etwa zwei multipliziert mit 10 enthält, die zur Potenz von acht koloniebildenden Einheiten pro ml angehoben werden.Bereiten Sie eine bakterielle Zellsuspension von 10 CFU/ml mit einer Leistung von sechs KBE/ml vor, indem Sie die Stammlösung verdünnen. Wichtiger Hinweis: Optimieren Sie die CFU, die der OD in Ihrem Labor entspricht, um die CFU für OD eins zu bestimmen, bevor Sie mit den Experimenten beginnen. Mäuse und Infektionen.Halten Sie am Tag der Infektion die Maus mit einer Hand, wischen Sie die Bauchhaut mit 70% Ethanol ab und spreizen Sie die Hinterbeine für eine bessere Zugänglichkeit der Bauchdecke. Injizieren Sie 0,5 ml von 10 auf die Leistung sechs CFU/ml Bakteriensuspension intraperitoneal, mit Hilfe einer 1 ml Spritze. Nach der Infektion die Kultur zur Überprüfung der tatsächlich injizierten KBE, die zwischen 0,2 und 0,8 Millionen KBE pro 0,5 ml variieren kann.CFU-Bewertung von Organen. Die Maus wurde mit Kohlendioxid-Erstickung geopfert. Nachdem Sie die infizierte Maus geopfert haben, wischen Sie den Bauch mit einem Stück Baumwolle ab, das in 70% Ethanol getaucht ist.Schneiden Sie die Bauchhaut auf. Siehe den Artikel von Ray und Dittle, für ein Videoprotokoll, wie man peritoneale Lavageflüssigkeit sammelt. Schneiden Sie die Peritonealhöhle auf und sammeln Sie das interessierende Organ.In diesem Video demonstrieren wir die Aufzählung von Organ-CFU aus der Leber. Die Leber erfährt in diesem Modell der Sepsis umfangreiche histopathologische Schäden. Schneiden Sie ein kleines Stück Leber und legen Sie es in eine Mikrofugenröhre.Dieser kann zwei bis drei Stunden in Eis gelagert werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird. Wiegen Sie das Stück und geben Sie es in ein Mikrofugenröhrchen. Vorzugsweise schneiden Sie die Stücke mit einem Gewicht von etwa 10 bis 15 mg, um eine ordnungsgemäße Homogenisierung zu gewährleisten.Fügen Sie 0,5 ml 1XPBS in den Schlauch hinzu und homogenisieren Sie die Organe mit einem Handhomogenisator. Stellen Sie sicher, dass die Organe vollständig homogenisiert sind. Erhöhen Sie das Volumen auf 1 ml, indem Sie 0,5 ml von 1XPBS hinzufügen.Zentrieren Sie die Röhrchen bei 200 G für fünf Minuten, bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand in frischen Mikrofugenröhrchen. Bereiten Sie Verdünnungen von 10 zur Potenz minus eins und 10 zur Leistung minus zwei in einer 96-Well-Platte vor.Verteilen Sie 50 Mikroliter des Verdünnungsmittels auf frische SS-Agarplatten und inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 12 Stunden. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien, die in jeder Bedingung auftreten, und normalisieren Sie die Daten mit dem Organgewicht mit der folgenden Formel. CFU/mg ist gleich der Anzahl der Kolonien, multipliziert mit 20, multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor, das Ganze geteilt durch das Organgewicht in mg.Beachten Sie, dass die Zahl 20 in der Formel verwendet wird, um die Kolonien pro Platte in KBE / ml umzurechnen. Diese Zahl ergibt sich, indem man 1 ml der Menge eines gegebenen Volumens der Kulturplatte dividiert. In diesem Fall 50 Mikroliter.Zum Beispiel, wenn Sie hundert Kolonien in einer SS-Agarplatte finden, wo 50 Mikroliter von 10 Leistung minus einer Verdünnung des homogenisierten Organs mit einem Gewicht von 10 mg verteilt wird, dann ist CFU / mg gleich 100 multipliziert mit 20, multipliziert mit 10, das Ganze geteilt durch 10, was 2000 CFU / mg entspricht. Durchflusszytometrische Analyse verschiedener Immunzellpopulationen in peritonealem Exsudat. Sammeln Sie die Peritonealzellen, wie zuvor von Ray und Dittle beschrieben.Resuspendiert das Zellpellet aus Peritonealspülflüssigkeit in 1 ml RPMI, ergänzt mit 10% FBS. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in der Peritonealspülung mit einem Hämozytometer auf. Stellen Sie die Zellzahl so ein, dass jede Röhre zwei bis fünf multipliziert mit 10 angehobenen fünf Zellen erhält.Drehen Sie die Zellen bei 200 G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten nach unten. Verwerfen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1XPBS.Zentrifen Sie die Zellen bei 200 G für 10 Minuten. Blockieren Sie die Fc-Rezeptoren mit dem FcR-Blocker. Eine ist zu 400 Verdünnung, hergestellt in Blockpuffer, bestehend aus 5% FBS und 0,02% Natriumazid in PBS.15 Minuten auf Eis inkubieren. Zentrifen Sie die Zellen bei 200 G für 10 Minuten. Verwerfen Sie den Überstand.Verdünnen Sie die fluorochromkonjugierten Antikörper, die im Blockpuffer von Interesse sind. Hier verwenden wir eine 500-Verdünnung von Anti-Maus-Ly6G, um Neutrophile zu färben. Beachten Sie, dass auch andere Immunzellpopulationen gezeigt werden können, wobei Anti-Maus-B220 für B-Zellen, Anti-Maus-CD3 für T-Zellen, Anti-Maus-F4 / 80 für Makrophagen usw. verwendet werden.Inkubieren Sie etwa 0,2 Millionen Zellen in 200 Mikrolitern verdünnter Lösungen von Antikörpern in separaten Röhrchen. Als Negativkontrolle sollten Sie bei jedem Fluorochromtyp eine Röhre für eine unverfärbte Kontrolle beiseite legen. Inkubieren Sie in diesem Röhrchen die Zellen mit 200 Mikroliter blockierendem Puffer ohne Antikörper.Inkubieren Sie die Proben 45 Minuten lang auf Eis, wobei alle 15 Minuten intermittierend geklopft wird. Zentrifen Sie die Zellen bei 200 G für 10 Minuten, bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Überstand.Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur, falls erforderlich, um sie mehrere Tage zu lagern. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikroliter FACS-Färbepuffer, 2% FBS in PBS. Erfassen Sie die Daten im Durchflusszytometer.Die hier gezeigten Bilder von SS-Agarplatten zeigen die Organ-CFU-Belastung in Leber und Milz von septischen Mäusen. Das homogenisierte Organ Lys6 wurde bei einer Verdünnung von 10 auf die Potenz minus eins verteilt und bei 37 Grad Celsius inkubiert. Die schwarz pigmentierten S.Typhimurium-Kolonien erschienen nach etwa 12 Stunden nach der Inkubation.Ein Teil der Platte ist hier als vergrößerter Einschub dargestellt, um die Kolonien hervorzuheben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich der Erreger erfolgreich systemisch verbreitet und die inneren Organe besiedelt hat. Diese Abbildung zeigt die Seren, die von gesunden und septischen Mäusen isoliert wurden.Das Volumen des sammelbaren Blutes von septischen Mäusen ist geringer als bei gesunden Kontrollen, so dass das erhaltene Serum geringer ist. Dies geschieht aufgrund einer erhöhten Gerinnung bei Sepsis. Auch die Seren von septischen Mäusen zeigen eine deutliche rote Färbung, was auf das Auftreten einer ausgedehnten Hämolyse hinweist.Die Abbildung zeigt zytometrische Diagramme von Peritonealzellen von gesunden und septischen Mäusen, die mit Anti-Ly6G-Antikörpern gefärbt sind. Diese Bilder sind repräsentativ für eine gesunde und zwei infizierte Mäuse. Septische Mäuse sahen eine erhöhte Infiltration von Neutrophilen in die Peritonealhöhle.In diesem Video haben wir eine Methode zur Induktion einer bakteriellen Sepsis bei Mäusen durch intraperitoneale Injektion von Salmonella Typhimurium gezeigt. Dies ist ein nützliches Modell, um die Auswirkungen therapeutischer Interventionen bei der Abschwächung der Sepsis zu untersuchen. In diesem Modellsystem ändert sich die zelluläre Zusammensetzung der Peritonealhöhle dramatisch, um den Erreger zu bekämpfen.Daher ist es ein nützliches Modell, um die kinetischen Veränderungen der Zusammensetzung und Funktionen von Immunzellen während der Sepsis zu untersuchen. Das Modell ist auch nützlich, um den Anstieg der interzellulären reaktiven Sauerstoffspezies, der entzündungsfördernden Zytokinspiegel, der Hämolyse und der Blutgerinnung zu verstehen, die alle während der Sepsis auftreten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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