Charakterisierung der Salmonella Typhimurium-induzierten septischen Peritonitis bei Mäusen

Sepsis ist eine fehlregulierte Immunantwort des Wirts auf mikrobielle Invasion oder Gewebeschäden, die zu Organverletzungen an einer Stelle führt, die von der der Infektion oder Schädigung entfernt ist. Die breite Öffentlichkeit ist sich dieser Störung während der COVID-19-Pandemie bewusster geworden. Im Jahr 2017 gab es weltweit 48,9 Millionen Sepsis-Inzidenzen und 11 Millionen Todesfälle, was fast 20% aller weltweiten Todesfälle entspricht.

Wie zu erwarten, befinden sich die meisten Fälle in Krankenhäusern. Tatsächlich ergab eine Studie, dass fast 62% der positiven Isolate von Patienten auf Intensivstationen mit Sepsis gramnegative Organismen waren. Es gibt mehrere Modelle, und einige der häufig verwendeten Mäusemodelle der Sepsis umfassen LPS-induzierte Endotoxämie, das cecal Ligations- und Punktionsmodell und die monobakteriellen Infektionsmodellsysteme.

In unserem Labor haben wir ein Mausmodellsystem standardisiert, um eine Peritoneussepsis mit Salmonella Typhimurium zu induzieren. Dieses Modell ist vorteilhaft gegenüber anderen, da Salmonella Typhimurium ein intrazellulärer Erreger ist, der den klinisch relevanten Zustand der gramnegativen Sepsis nachahmt. Das Ergebnis der Peritonitis-Sepsis in diesem Modell ist systemisch mit 100% Mortalität, innerhalb von 96 Stunden nach der Infektion.

Daher ist dieses Modell maßgeblich an der Untersuchung der Entzündungsreaktionen des Wirts beteiligt. In diesem Modell wird Sepsis durch intraperitoneale Injektion von 0,5 Millionen CFE Salmonella Typhimurium in eine 8-10 Wochen alte C57BL / 6-Maus induziert. Eine systemische Infektion kann durch die Beurteilung der bakteriellen Belastung des Organs etwa 16 Stunden nach der Infektion bestätigt werden.

Die Experimente mit Salmonella Typhimurium erfordern eine BSL-2-Einrichtung und die Einhaltung der BSL-2-Richtlinien. Es muss darauf geachtet werden, dass eine ordnungsgemäße PSA verwendet wird, die Sicherheit gewährleistet ist, und die Standard-BSL-2-Biohazard-Entsorgungsmethoden befolgen. Alle Experimente wurden von der institutionellen Tierethikkommission genehmigt.

Kulturzubereitung von Salmonella Typhimurium. Fügen Sie hundert Mikroliter Salmonella Typhimurium NCTC 12023 Glycerinbrühe in 3 ml LB-Brühe hinzu. Inkubieren Sie die Kultur mit 160 Umdrehungen pro Minute, bei 37 Grad Celsius über Nacht.

50 Mikroliter der über Nacht angebauten Kultur in LB-Brühe auf eine Salmonella Shigella-Agarplatte streichen und bei 37 Grad Celsius für 12 Stunden inkubieren. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus der gestreiften SS-Agarplatte mit einer Mikrospitze aus. Werfen Sie die Mikrospitze in 3 ml LB-Brühe aus und kultivieren Sie sie über Nacht bei 160 U / min bei 37 Grad Celsius.

Fügen Sie 0,1 ml der Bakterienkultur in 50 ml LB-Brühe hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem Shaker-Inkubator bei 160 U / min für drei bis vier Stunden, um die logarithmische Wachstumsphase zu erreichen. Verdünnen Sie die Kultur mit LB-Brühe um den Faktor zwei. Messen Sie die optische Dichte der Kultur bei 600 Nanometer Wellenlänge des Lichts in einem Spektralphotometer.

Sobald die OD eins erreicht hat, machen Sie zwei Aliquots von 1 ml Kultur in 1,5 ml Mikrofugenröhrchen. Zentrieren Sie die Röhrchen bei 7.750 G für 15 Minuten. Entsorgen Sie diesen Überstand und waschen Sie das Pellet zweimal mit 1 ml 1XPBS.

Zentrieren Sie die Röhrchen bei 7.750 G für 15 Minuten. Resuspendiert das Pellet in 0,5 ml von 1XPBS in zwei verschiedenen 1,5 ml Mikrofugenröhrchen. Kombinieren Sie die Suspensionen aus beiden Rohren zu einer 1,5-ml-Röhre, die jetzt etwa zwei multipliziert mit 10 enthält, die zur Potenz von acht koloniebildenden Einheiten pro ml angehoben werden.

Bereiten Sie eine bakterielle Zellsuspension von 10 CFU/ml mit einer Leistung von sechs KBE/ml vor, indem Sie die Stammlösung verdünnen. Wichtiger Hinweis: Optimieren Sie die CFU, die der OD in Ihrem Labor entspricht, um die CFU für OD eins zu bestimmen, bevor Sie mit den Experimenten beginnen. Mäuse und Infektionen.

Halten Sie am Tag der Infektion die Maus mit einer Hand, wischen Sie die Bauchhaut mit 70% Ethanol ab und spreizen Sie die Hinterbeine für eine bessere Zugänglichkeit der Bauchdecke. Injizieren Sie 0,5 ml von 10 auf die Leistung sechs CFU/ml Bakteriensuspension intraperitoneal, mit Hilfe einer 1 ml Spritze. Nach der Infektion die Kultur zur Überprüfung der tatsächlich injizierten KBE, die zwischen 0,2 und 0,8 Millionen KBE pro 0,5 ml variieren kann.

CFU-Bewertung von Organen. Die Maus wurde mit Kohlendioxid-Erstickung geopfert. Nachdem Sie die infizierte Maus geopfert haben, wischen Sie den Bauch mit einem Stück Baumwolle ab, das in 70% Ethanol getaucht ist.

Schneiden Sie die Bauchhaut auf. Siehe den Artikel von Ray und Dittle, für ein Videoprotokoll, wie man peritoneale Lavageflüssigkeit sammelt. Schneiden Sie die Peritonealhöhle auf und sammeln Sie das interessierende Organ.

In diesem Video demonstrieren wir die Aufzählung von Organ-CFU aus der Leber. Die Leber erfährt in diesem Modell der Sepsis umfangreiche histopathologische Schäden. Schneiden Sie ein kleines Stück Leber und legen Sie es in eine Mikrofugenröhre.

Dieser kann zwei bis drei Stunden in Eis gelagert werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird. Wiegen Sie das Stück und geben Sie es in ein Mikrofugenröhrchen. Vorzugsweise schneiden Sie die Stücke mit einem Gewicht von etwa 10 bis 15 mg, um eine ordnungsgemäße Homogenisierung zu gewährleisten.

Fügen Sie 0,5 ml 1XPBS in den Schlauch hinzu und homogenisieren Sie die Organe mit einem Handhomogenisator. Stellen Sie sicher, dass die Organe vollständig homogenisiert sind. Erhöhen Sie das Volumen auf 1 ml, indem Sie 0,5 ml von 1XPBS hinzufügen.

Zentrieren Sie die Röhrchen bei 200 G für fünf Minuten, bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand in frischen Mikrofugenröhrchen. Bereiten Sie Verdünnungen von 10 zur Potenz minus eins und 10 zur Leistung minus zwei in einer 96-Well-Platte vor.

Verteilen Sie 50 Mikroliter des Verdünnungsmittels auf frische SS-Agarplatten und inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 12 Stunden. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien, die in jeder Bedingung auftreten, und normalisieren Sie die Daten mit dem Organgewicht mit der folgenden Formel. CFU/mg ist gleich der Anzahl der Kolonien, multipliziert mit 20, multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor, das Ganze geteilt durch das Organgewicht in mg.

Beachten Sie, dass die Zahl 20 in der Formel verwendet wird, um die Kolonien pro Platte in KBE / ml umzurechnen. Diese Zahl ergibt sich, indem man 1 ml der Menge eines gegebenen Volumens der Kulturplatte dividiert. In diesem Fall 50 Mikroliter.

Zum Beispiel, wenn Sie hundert Kolonien in einer SS-Agarplatte finden, wo 50 Mikroliter von 10 Leistung minus einer Verdünnung des homogenisierten Organs mit einem Gewicht von 10 mg verteilt wird, dann ist CFU / mg gleich 100 multipliziert mit 20, multipliziert mit 10, das Ganze geteilt durch 10, was 2000 CFU / mg entspricht. Durchflusszytometrische Analyse verschiedener Immunzellpopulationen in peritonealem Exsudat. Sammeln Sie die Peritonealzellen, wie zuvor von Ray und Dittle beschrieben.

Resuspendiert das Zellpellet aus Peritonealspülflüssigkeit in 1 ml RPMI, ergänzt mit 10% FBS. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in der Peritonealspülung mit einem Hämozytometer auf. Stellen Sie die Zellzahl so ein, dass jede Röhre zwei bis fünf multipliziert mit 10 angehobenen fünf Zellen erhält.

Drehen Sie die Zellen bei 200 G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten nach unten. Verwerfen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1XPBS.

Zentrifen Sie die Zellen bei 200 G für 10 Minuten. Blockieren Sie die Fc-Rezeptoren mit dem FcR-Blocker. Eine ist zu 400 Verdünnung, hergestellt in Blockpuffer, bestehend aus 5% FBS und 0,02% Natriumazid in PBS.

15 Minuten auf Eis inkubieren. Zentrifen Sie die Zellen bei 200 G für 10 Minuten. Verwerfen Sie den Überstand.

Verdünnen Sie die fluorochromkonjugierten Antikörper, die im Blockpuffer von Interesse sind. Hier verwenden wir eine 500-Verdünnung von Anti-Maus-Ly6G, um Neutrophile zu färben. Beachten Sie, dass auch andere Immunzellpopulationen gezeigt werden können, wobei Anti-Maus-B220 für B-Zellen, Anti-Maus-CD3 für T-Zellen, Anti-Maus-F4 / 80 für Makrophagen usw. verwendet werden.

Inkubieren Sie etwa 0,2 Millionen Zellen in 200 Mikrolitern verdünnter Lösungen von Antikörpern in separaten Röhrchen. Als Negativkontrolle sollten Sie bei jedem Fluorochromtyp eine Röhre für eine unverfärbte Kontrolle beiseite legen. Inkubieren Sie in diesem Röhrchen die Zellen mit 200 Mikroliter blockierendem Puffer ohne Antikörper.

Inkubieren Sie die Proben 45 Minuten lang auf Eis, wobei alle 15 Minuten intermittierend geklopft wird. Zentrifen Sie die Zellen bei 200 G für 10 Minuten, bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Überstand.

Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur, falls erforderlich, um sie mehrere Tage zu lagern. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikroliter FACS-Färbepuffer, 2% FBS in PBS. Erfassen Sie die Daten im Durchflusszytometer.

Die hier gezeigten Bilder von SS-Agarplatten zeigen die Organ-CFU-Belastung in Leber und Milz von septischen Mäusen. Das homogenisierte Organ Lys6 wurde bei einer Verdünnung von 10 auf die Potenz minus eins verteilt und bei 37 Grad Celsius inkubiert. Die schwarz pigmentierten S.Typhimurium-Kolonien erschienen nach etwa 12 Stunden nach der Inkubation.

Ein Teil der Platte ist hier als vergrößerter Einschub dargestellt, um die Kolonien hervorzuheben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich der Erreger erfolgreich systemisch verbreitet und die inneren Organe besiedelt hat. Diese Abbildung zeigt die Seren, die von gesunden und septischen Mäusen isoliert wurden.

Das Volumen des sammelbaren Blutes von septischen Mäusen ist geringer als bei gesunden Kontrollen, so dass das erhaltene Serum geringer ist. Dies geschieht aufgrund einer erhöhten Gerinnung bei Sepsis. Auch die Seren von septischen Mäusen zeigen eine deutliche rote Färbung, was auf das Auftreten einer ausgedehnten Hämolyse hinweist.

Die Abbildung zeigt zytometrische Diagramme von Peritonealzellen von gesunden und septischen Mäusen, die mit Anti-Ly6G-Antikörpern gefärbt sind. Diese Bilder sind repräsentativ für eine gesunde und zwei infizierte Mäuse. Septische Mäuse sahen eine erhöhte Infiltration von Neutrophilen in die Peritonealhöhle.

In diesem Video haben wir eine Methode zur Induktion einer bakteriellen Sepsis bei Mäusen durch intraperitoneale Injektion von Salmonella Typhimurium gezeigt. Dies ist ein nützliches Modell, um die Auswirkungen therapeutischer Interventionen bei der Abschwächung der Sepsis zu untersuchen. In diesem Modellsystem ändert sich die zelluläre Zusammensetzung der Peritonealhöhle dramatisch, um den Erreger zu bekämpfen.

Daher ist es ein nützliches Modell, um die kinetischen Veränderungen der Zusammensetzung und Funktionen von Immunzellen während der Sepsis zu untersuchen. Das Modell ist auch nützlich, um den Anstieg der interzellulären reaktiven Sauerstoffspezies, der entzündungsfördernden Zytokinspiegel, der Hämolyse und der Blutgerinnung zu verstehen, die alle während der Sepsis auftreten.