Name: Untersuchung der Mechanosensorik von luminalen Partikeln im murinen Dünndarm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Erfahren Sie, wie das murine Dünndarm mechanosensorische Transitentscheidungen bei verschiedenen Partikelgrößen trifft. Diese modifizierte in-vivo-Methode ermöglicht hochauflösende regionale Analysen kurzer Darmsegmente.

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Wir danken Frau Lyndsay Busby für die administrative Unterstützung und Herrn Joel Pino für die Unterstützung durch die Medien. NIH-Zuschüsse unterstützten diese Arbeit: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 und Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (DK084567).

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Mayo Clinic genehmigt.
1. Einrichtung
<ol><li>Schnelle 8- bis 10 Wochen alte Mäuse für 4 h. Geben Sie Mäusen Zugang zu Wasser. HINWEIS: Wir verwenden männliche Wildtyp-C57BL / 6J-Mäuse für alle hier vorgestellten Experimente, aber sie können an Mäusen aller Stämme, Geschlechter und Genotypen durchgeführt werden.</li>
	<li>Kühlen Sie 15 ml destilliertes Wasser in einem 50 ml konischen Röhrchen in einem 4 °C Kühlschrank.</li>
	<li>Weitere 15 mL destilliertes Wasser werden in einem Becherglas mit einer Heizplatte mit Magnetrührstab auf ca. 80-90 °C erhitzt.</li>
	<li>Messen Sie 0,5% Methylcellulose für insgesamt 30 ml (0,15 g).</li>
	<li>Fügen Sie Methylcellulose vorsichtig zu 15 ml heißem Wasser hinzu, damit es nicht verklumpt. Die Methylcelluloselösung wird während dieses Prozesses trüb.</li>
	<li>Nach dem Auflösen nehmen Sie das Becherglas von der Heizplatte und geben Sie die 15 ml gekühltes Wasser in das heiße Becherglas.</li>
	<li>In einem 4 °C Kühlschrank aufstellen, bis die Lösung klar ist, ca. 15-20 min.</li>
	<li>Wenn klar, 3 mg Rhodaminisothiocyanat (RITC)-Dextran pro 5 ml 0,5% ige Methylcelluloselösung wiegen und mischen, um zu kombinieren. Dies ist der flüssige Zustand im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse .<ol><li>Alternativ können Sie 25 mg fluoreszierende Polyethylen-Mikrokugeln wiegen und mit 200 μL der Methylcelluloselösung mischen, bis sie gut eingearbeitet sind. Die gründliche Einarbeitung der Mikrosphären wird durch den Wirbel vor dem Gavage sichergestellt. Der Experimentator muss die homogene Verteilung der suspendierten Mikrokugeln in der Mischung visualisieren.</li>
		<li>Da die RITC-Dextran-Lösung lichtempfindlich ist, kühlen Sie die Lösung. Bereiten Sie die RITC-Dextran-Lösung und die Mikroshpere-Mischung im Voraus vor und verwenden Sie sie innerhalb von 2 Monaten. Resuspendieren Sie die Mikrokugelmischung vor Gebrauch. HINWEIS: Mikrosphären unterschiedlicher Größe werden verwendet, um den gastrointestinalen Umgang mit verschiedenen Materialien zu untersuchen. Im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse demonstrieren wir die Ergebnisse der Verwendung kleiner (Durchmesser: 75-90 μm) und größerer (Durchmesser: 180-212 μm) Mikrokugeln.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Intraluminale Inhaltssonde
<ol><li>Bereiten Sie die Sonde vor, indem Sie einen 18 Ga x 50 mm großen Ernährungsschlauch an eine 1-ml-Spritze anbringen und 200 μl RITC-Lösung oder Mikrokugellösung aufziehen.</li>
	<li>Halten Sie das nüchterne Tier manuell mit der Einhand-Rückhaltetechnikzurück 25. Beziehen Sie sich auf die Informationen der Institution über die richtigen Maus-Rückhaltetechniken.</li>
	<li>Führen Sie die Ernährungssonde vorsichtig durch den Mund und die Speiseröhre der Maus ein, bis sie in den Magen gelangt. HINWEIS: Der Gavage-Schritt ist entscheidend für ein erfolgreiches Experiment. Es erfordert erfahrene Hände, die den Schlauch konsequent in etwa den gleichen Abstand in jede Maus einführen können. Dieser Schritt muss von Experimentatoren, die das Protokoll durchführen, standardisiert werden. Derselbe Experimentator sollte alle Mäusekohorten untersuchen, die miteinander verglichen werden.</li>
	<li>Schieben Sie den Spritzeninhalt langsam in den Magen und entfernen Sie den Schlauch vorsichtig von der Maus.</li>
	<li>Nach dem Gavage, bringen Sie die Maus in den Käfig zurück.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Sondenrohr.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf für die gewünschte Anzahl von Tieren.</li>
</ol>3. Darmdissektion
<ol><li>Bevor Sie mit den Dissektionen beginnen, schalten Sie das In-vivo-Bildgebungsinstrument ein, damit es auf Temperatur kommen kann.</li>
	<li>Opfern Sie die Maus 30 Minuten nach dem Gavage. Verwenden Sie Kohlendioxid-Inhalation, um die Maus zu opfern, gefolgt von zervikaler Dislokation, um eine erfolgreiche Euthanasie zu gewährleisten.</li>
	<li>Nachdem Sie eine erfolgreiche Euthanasie bestätigt haben, legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein Sezierstadium und stecken Sie ihre vier Anhängsel auf die Bühne, um Zugang zum Bauch zu haben. Befeuchten Sie die Oberfläche des Bauches mit 70% Ethanol, um die Bauchhaare zu benetzen.</li>
	<li>Verwenden Sie Mikrodissektionszange , um die Haut zu ziehen und eine scharfe chirurgische Schere zu erwerben, um einen Querschnitt 1 cm über dem Anus zu machen. Um die intraperitoneale Höhle freizulegen, setzen Sie den Schnitt vertikal den Bauch hinauf bis zum Brustkorb fort.</li>
	<li>Bewegen Sie den Blinddarm vorsichtig mit der Mikrodissektionszange nach links, um den distalen Dickdarm freizulegen.</li>
	<li>Schneiden Sie den distalen Dickdarm mit einer Mikrodissektionsschere in der Nähe des Rektums ab.</li>
	<li>Entwirren Sie sanft den Dickdarm, den Blinddarm und den Dünndarm, indem Sie langsam in die entgegengesetzte Richtung ziehen. HINWEIS: Die Aufrechterhaltung des sezierten Darms in einem kontinuierlichen Segment wird den Ermittler am einfachsten machen. Risse und Risse entlang des Segments führen dazu, dass nachfolgende Schritte schwieriger werden.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Mikrodissektionschere, um proximal zum Magen zu schneiden.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Pinzette, um den sezierten Darm auf das Messblatt zu übertragen (Abbildung 1). Legen Sie den Magen auf 0 mm und ordnen Sie den Darm entlang des Lineals bis 200 mm an. Verwenden Sie eine Mikrodissektionschere, um bei 200 mm zu schneiden. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie den Darm von 0 mm bis 200 mm entlang der Lineale ausrichten, während Sie sicher sind, dass die Ausrichtung des Darms nicht verwirrt wird.<ol><li>Achten Sie darauf, den Darm nicht zu dehnen, während Sie sich an den Linealen ausrichten.</li>
	</ol></li>
	<li>Sobald das Gewebe auf dem Lineal angeordnet ist, ordnen Sie den Blinddarm so an, dass er parallel zum Gewebe ist, aber nicht in direktem Kontakt mit ihm steht (wenn in diesem Bereich Fluoreszenz gefunden wird, ist eine klare Unterscheidung zwischen Blindblut und Darm erforderlich).</li>
	<li>Legen Sie das Messblatt mit dem sezierten Gewebe in einen dunklen Bereich, damit die Fluoreszenz erhalten bleibt, bis es Zeit für die Aufnahme ist.</li>
</ol>4. Ex-vivo-Bildgebung
<ol><li>Öffnen Sie die In-vivo-Bildgebungssoftware und melden Sie sich an.</li>
	<li>Initialisieren Sie das Bildgebungsinstrument, damit es für die Bildaufnahme bereit ist.</li>
	<li>Stellen Sie die Felder "Anregung" und "Emission" auf die entsprechende Farbe ein, die für die Perle oder den RITC-Gavage verwendet wird. Rot (flüssig): Anregung 535 nm / Emission 600 nm. Grün (Mikrosphären): Anregung 465 nm / Emission 520 nm.</li>
	<li>Stellen Sie die Belichtung auf "Auto".</li>
	<li>Wählen Sie das Sichtfeld aus.</li>
	<li>Bevor Sie das Messblatt in das Instrument legen, stellen Sie sicher, dass sich der Darm während des Transports nicht verschoben hat.</li>
	<li>Legen Sie das Messblatt innerhalb des Sichtfeldes in das Gerät.</li>
	<li>Schließen Sie die Tür zum Instrument sicher und wählen Sie Schnappschuss , um das Sichtfeld zu fotografieren.</li>
	<li>Speichern Sie die gesammelten Bilder zur Analyse auf einem Flash-Laufwerk. Speichern Sie einzelne Aufnahmen der fluoreszierenden und fotografischen Bilder. Eine Überlagerung des Fotos und der Fluoreszenz zeigt die Position von fluoreszierendem Material im GI-Trakt an (Abbildung 1). HINWEIS: Wir empfehlen, die Dateien für die nachgelagerte Verarbeitung im Format Tag-Bilddatei (.tif) zu speichern.</li>
</ol>5. Analyse
<ol><li>Öffnen Sie die fluoreszierenden und fotografierenden Bilddateien in einer Bildbearbeitungssoftware.</li>
	<li>Passen Sie die Pixelgröße beider Bilder so an, dass sie genau die gleichen Abmessungen haben (unsere Konvention war, beide Bilder auf 1280 Pixel x 850 Pixel [Höhe x Breite] einzustellen).</li>
	<li>Schließen Sie die Fotodatei. Die folgenden Schritte betreffen nur das fluoreszierende Bild.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Radiergummi-Werkzeug, um den Hintergrund zu entfernen und transparent zu machen. Ein Radiergummi kann erforderlich sein, um Patches des verbleibenden Hintergrunds zu entfernen.</li>
	<li>Erstellen Sie einen neuen Layer. Machen Sie es zu einem vollständig schwarzen Hintergrund für das fluoreszierende Signal. Dies kann erreicht werden, indem eine schwarze Füllung für die Schicht gewählt und die Schicht so gezogen wird, dass sie unter der Schicht mit dem fluoreszierenden Bild liegt.</li>
	<li>Speichern Sie das neue fluoreszierende Bild, das nur das fluoreszierende Signal auf schwarzem Hintergrund enthält, als neue .tif Datei.</li>
	<li>Öffnen Sie die neuen fluoreszierenden und fotografieren Sie Bilder in ImageJ.</li>
	<li>Wandeln Sie jedes Bild in ein 32-Bit-Bild um, indem Sie Bild > Typ > 32-Bit auswählen.</li>
	<li>Erstellen Sie ein zusammengeführtes Bild beider, indem Sie "Bild> " Farbe> Kanäle zusammenführen" auswählen. Wählen Sie im daraufhin angezeigten Dialogfeld die Fotodatei für den Graukanal und die Fluoreszenzdatei unter beliebigen Farbkanälen aus.</li>
	<li>Deaktivieren Sie die Skalierung des zusammengeführten Bildes, indem Sie Analysieren > Maßstab festlegen auswählen > Klicken Sie hier, um die Skalierung zu entfernen.</li>
	<li>Wählen Sie das Werkzeug "Rechteck" in ImageJ.</li>
	<li>Zeichne ein Rechteck um einen Abschnitt des Dünndarms. Achten Sie genau auf die Breite dieser Region of Interest (ROI), da sie zwischen allen ROIs konstant bleiben sollte. Der Nominalwert ist nicht wesentlich, nur dass er über alle auf diesem Bild gezeichneten ROIs konsistent gehalten wird [da der Dünndarm mehrere Zeilen übernimmt, werden individuelle ROIs über jeden Abschnitt des Dünndarms in einer anderen Reihe gezeichnet (Abbildung 1)]. Abbildung 2 zeigt die Position des Breitenwerts auf der ImageJ-Symbolleiste.</li>
	<li>Duplizieren Sie den ROI, indem Sie Bild > Duplizieren auswählen. Wählen Sie nur den Kanal aus, der dem farbigen Kanal entspricht.</li>
	<li>Verwenden Sie das Rechteckwerkzeug erneut, um einen ROI für das gesamte neue Bild zu zeichnen.</li>
	<li>Rufen Sie ein Profil der Fluoreszenz ab, indem Sie > Plotprofil analysieren auswählen. Das resultierende Diagramm stellt auf der y-Achse die durchschnittliche Intensität für jedes Pixel entlang der Länge des ROI dar. Dies wurde in Schritt 5.12 als Länge des analysierten Abschnitts des Dünndarms ausgewählt</li>
	<li>Öffnen Sie die Liste der Werte und kopieren Sie sie in eine Tabellenkalkulationssoftware.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 5.12-5.16 für jeden Abschnitt des Dünndarms in einer anderen Linealreihe. Fügen Sie die Werte in derselben Tabellenkalkulationsdatei unmittelbar unter jedem vorherigen Satz von Werten ein, sodass alle fortlaufenden Zeilen in dieser Spalte den durchschnittlichen Intensitätswert für die gesamte Länge des Dünndarms enthalten.</li>
	<li>Multiplizieren Sie in der Tabellenkalkulationssoftware jeden durchschnittlichen Intensitätswert mit der konstanten Breite des ROI-Rechtecks, das in Schritt 5.12 erstellt wurde. Dies ergibt den tatsächlichen Intensitätswert entlang des Dünndarms an jedem Punkt. HINWEIS: Verschiedene Tiere haben leichte Abweichungen von der Dünndarmlänge. Um zu verhindern, dass die Längenunterschiede das Ergebnis der nachgeschalteten Datenanalyse beeinflussen, muss die Zeichenfolge der Intensitätswerte in eine konsistente Anzahl von Behältern über alle experimentellen Proben verteilt werden (Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5 zeigen die Ergebnisse für drei Behältergrößen an).</li>
	<li>Teilen Sie die Anzahl der Intensitätswerte durch die Anzahl der gewünschten Behälter. Der resultierende Quotient S bestimmt die Anzahl der Intensitätswerte , die in jedem Behälter enthalten sind.</li>
	<li>Bestimmen Sie mithilfe einer Aufrundungsformel den Papierkorb, in dem jeder rohe Intensitätswert abgelegt wird. In diesem Schritt wird jeder rohe Intensitätswert in einen Behälter verschoben. Jeder Rohintensitätswert wird chronologisch mit der ganzen Zahl N indiziert. Der Quotient N/S bestimmt die jedem Rohwert zugeordnete Lagerplatznummer. Die Aufrundungsformel sollte diesen Quotienten auf eine ganze Zahl ohne Dezimalstellen runden.</li>
	<li>Generieren Sie den Wert für jede Ablage mithilfe einer Mittelwertwenn-Formel. Ziel ist es, die Rohwerte, die einem bestimmten Lagerplatz in Schritt 5.20 zugeordnet sind, zu mitteln. Daher sollten die Argumente in der Formel wie folgt lauten: (1) zugewiesene Klassen, die in Schritt 5.20 generiert wurden, (2) Lagerplatznummer, (3) rohe Intensitätswerte. HINWEIS: Die erste Analyse, die wir mit den zusammengefassten Daten durchführen können, ist eine geometrische Mittenanalyse, die quantifiziert, wie weit wir die höchste Fluoreszenzintensität entlang des Dünndarms beobachten (Abbildung 4).</li>
	<li>Normalisieren Sie jeden Intensitätswert über die gesamte Fluoreszenzintensität. Mit anderen Worten, dividieren Sie jeden Intensitätswert durch die Summe aller Intensitäten.</li>
	<li>Multiplizieren Sie jeden normalisierten Wert mit der Lagerplatznummer. Das Produkt spiegelt das relative Gewicht jedes Behälters wider und trägt zur Gesamtfluoreszenzintensität bei.</li>
	<li>Addiert man alle in Schritt 5.23 generierten Werte, erhält man die Bin-Nummer in der Mitte des Fluoreszenzsignals. Teilen Sie durch die Anzahl der Behälter, um das geometrische Zentrum als den Anteil des Dünndarms auszudrücken, der vom fluoreszierenden Zentrum zurückgelegt wird. HINWEIS: Um die räumliche Verteilung des Signals widerzuspiegeln, besteht der nächste Schritt darin, das Leistungsspektrum des Binned Intensity Datensatzes zu generieren (Abbildung 5).</li>
	<li>Öffnen Sie einen FFT-Assistenten (Fast Fourier Transform) in der Tabellenkalkulationssoftware. Wählen Sie die Eingabe als Binned Data Set und die Ausgabe als leeren Satz mit der gleichen Anzahl von Zeilen wie Bins aus.</li>
	<li>Extrahieren Sie die Realwertkomponente der FFT.</li>
	<li>Erhöhen Sie jeden realen Wert der FFT auf die zweite Potenz. Daraus ergibt sich ein Datensatz von Leistungsspektren.</li>
	<li>Wählen Sie die erste Hälfte des Leistungsspektrendatensatzes aus und verschieben Sie sie so, dass sie unter der zweiten Hälfte liegt. Dies hat den Effekt, dass die Leistungsspektren im nächsten Schritt um die Mittenfrequenz zentriert werden.</li>
	<li>Zeichnen Sie die Leistungsspektren auf der y-Achse eines x-y-Graphen, wobei die x-Achsenwerte der Bereich von -1 x (Anzahl der Bins/2) bis (Anzahl der Bins/2) -1 sind. Bei 1000 Lagerplätzen würden die Achsenwerte zwischen -500 und 499 liegen.</li>
	<li>Leistungsspektren für jedes Tier sollten auf der Grundlage der Spreizung von Peaks ungleich Null und der Höhen dieser Peaks ungleich Null verglichen werden.</li>
</ol>

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Der Magen-Darm-Trakt benötigt wie andere röhrenförmige Organe wie Blutgefäße mechanische Sensoren und Effektoren, um die Homöostaseaufrechtzuerhalten 26,27,28. Der GI-Trakt ist jedoch insofern einzigartig, als die physikalischen Eigenschaften der Materialien, die ihn durchqueren, über die Mahlzeiten hinweg nicht konstant sind. Intraluminale Gehalte verschiedener physikalischer Eigenschaften (fest, flüssig und gasförmig) passiere...

Der menschliche Magen-Darm-Trakt (GI) ist ein mehrere Fuß langes Organsystem, grob angenähert als Röhre mit unterschiedlichen Abmessungen und physikalischen Eigenschaften1. Während sich der Inhalt durch seine Länge bewegt, besteht die Hauptfunktion des Magen-Darm-Trakts darin, lebenswichtige Substanzen aufzunehmen. Der Dünndarm ist speziell für die Nährstoffaufnahme verantwortlich. Der Transit des Dünndarms ist streng reguliert, um den Verdauungs- und Absorptionsfunktionen zu entsprechen, was zu verschiedenen Motilitätsmustern führt. Bayliss und Starling beschrieben 1899 das "Gesetz des Darms"2 und zeigten das kontraktile Antriebsprogramm im Darm, das heute als peristaltischer Reflex bekannt ist; Das Segment in der Nähe des Nahrungsbolus zieht sich zusammen, um es vorwärts zu treiben, und das distale Segment entspannt sich, um es zu empfangen. Theoretisch könnte dieses Muster allein ausreichen, um Material aboral zu transportieren, aber über ein Jahrhundert Forschung hat ein komplexeres Bild der kontraktilen Aktivität im Magen-Darm-Trakt gezeichnet. Beim Menschen werden drei Dünndarmmotilitätsperioden erkannt: der wandernde motorische Komplex (MMC), die Fastenperiode und die postprandiale Periode3. Die gleichen Muster wurden bei Mäusenberichtet 4,5. Die MMC ist ein zyklisches motorisches Muster, das bei den meisten Säugetieren erhalten bleibt 6,7. Die MMC hat ein charakteristisches Vier-Phasen-Muster, das als nützlicher klinischer Marker bei funktionellen GI-Störungen dient7. Die vier Phasen, in der Reihenfolge ihres Auftretens, sind (I) Ruhe, (II) unregelmäßige, niedrige Amplitudenkontraktionen, (III) regelmäßige Kontraktionen mit hoher Amplitude und (IV) Ramp-down-Periode abnehmender Aktivität7. Die MMC markiert das wichtigste motorische Muster der Fastenperiode3. MMCs der Fastenzeit klären den Inhalt des Dünndarms in Vorbereitung auf die nächste Mahlzeit.
Die motorischen Muster der postprandialen Periode sind für die Verdauungs- und Absorptionsfunktionen optimiert3. Unabhängig von der kalorischen Zusammensetzung ist der anfängliche Transit schnell entlang des Dünndarms, der Inhalt wird entlang der Länge des Darms verteilt und der Transit verlangsamt sich anschließend8. Die Absorption wird optimiert, indem die Kontaktfläche vergrößert und verlangsamt wird, um die Verweilzeit zu verlängern. Sobald sich die Nährstoffe im Lumen befinden, besteht das dominante Muster aus engen (<2 cm auseinander) unkoordinierten Kontraktionen (segmentierende Kontraktionen), mit einigen überlagerten Kontraktionen mit großer Amplitude, die sich über die gesamte Länge des Dünndarms erstrecken (peristaltische Kontraktionen)9. Segmentierende Kontraktionen mischen die intraluminalen Inhalte an Ort und Stelle. Die gelegentlichen großen peristaltischen Kontraktionen treiben den Inhalt in Richtung Dickdarm.
Der Zeitpunkt dieses Übergangs zurück zu MMCs hängt vom Nahrungsvolumen und der Kalorienzusammensetzung ab10. So probiert der Dünndarm luminale Hinweise, um zu regulieren, wann zwischen den Motilitätsperioden übergegangen werden soll. Mechanische Hinweise, wie physikalische Eigenschaften des luminalen Inhalts11, des luminalen Volumens und der Wandspannung, greifen Mechanorezeptorzellen in der GI-Wand 12,13,14,15,16 ein. In der Tat führt die Erhöhung der festen Komponente einer Mahlzeit zu einer Zunahme des Dünndarmtransits17. Wir spekulieren, dass physikalische Eigenschaften, wie der flüssige oder feste Zustand von intraluminalen Inhalten, aufgrund der verschiedenen Kräfte, die sie an der GI-Wand erzeugen, verschiedene Mechanorezeptoren aktivieren müssen18.
Der Goldstandard für die Messung des In-vivo-GI-Transits beim Menschen wie bei Mäusen ist die Verwendung radioaktiver Tracer, die durch Szintigraphie gemessen werden, wenn sie den Magen verlassen oder entlang des Dickdarms19,20 gelangen. Bei Säugetieren schlingt sich der Dünndarm auf unvorhersehbare Weise, so dass der Dünndarm in vivo schwer zuverlässig abgebildet werden kann, aber es werden Fortschritte erzielt21. Darüber hinaus fehlen derzeit Werkzeuge, um zu quantifizieren, wie der Dünndarm mit Partikeln unterschiedlicher Eigenschaften und Größen umgeht. Ausgangspunkt war hier eine Goldstandardtechnik, die die Untersuchung des Dünndarmtransits 22,23,24 und der Barrierefunktion 22 standardisiert. Es besteht darin, Mäuse mit einem fluoreszierenden Material zu glätten, auf die GI-Motilität zu warten, um das Material zu transportieren, den GI-Trakt zu entfernen, ihn in mehrere Abschnitte vom Magen zum Dickdarm zu segmentieren, intraluminale Inhalte zur Fluoreszenzquantifizierung zu schneiden und zu homogenisieren. Wir haben zwei Verbesserungen vorgenommen. Zuerst änderten wir die Zusammensetzung des gavaged Inhalts, um fluoreszierende mikroskopische Perlen einzubeziehen, um zu bestimmen, wie der Dünndarm physikalische Partikel verteilt. Zweitens verbesserten wir die räumliche Auflösung, indem wir den gesamten GI-Trakt vom Magen bis zum Dickdarm ex vivo abbildeten und Binning variabler Größe verwendeten, um unsere Analyse über Tiere hinweg zu standardisieren. Wir postulieren, dass dies neue Einblicke in das Gleichgewicht von propulsiven versus segmentierenden Kontraktionen während der postprandialen Phase liefert.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>andere Mäuse können mit diesem Protokoll verwendet werden</td></tr><tr><td>Präparierwerkzeuge</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Excel-Software</td><td>Microsoft</td><td>n/a</td><td>wird für die Analyse von Tabellenkalkulationen verwendet</td></tr><tr><td>Fluoreszierende grüne Polyethylen-Mikrosphären 1,00 g/cm³ 75-90um - 10 g</td><td>Cosphäric</td><td>UVPMS-BG-1,00 75-90um - 10 g</td> <td>"kleinere Kügelchen" in der </td></tr><tr><td>Manuskript Fluoreszierende grüne Polyethylen-Mikrosphären 1,00 g/cc 180-212um - 10 g</td><td>Cospheric</td><td>UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10 g</td> <td>"größere Kügelchen" im Manuskript</td></tr><tr><td>Gavage-Nadeln</td><td>Instech</td><td>FTP-18-50-50</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>zur Extraktion des Fluoreszenzprofils</td></tr><tr><td>Laminiertes Linealpapier (im eigenen Haus hergestellt)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose (Viskosität: 400 cP)</td><td>Sigma</td><td>M0262</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop Software</td><td>Adobe</td><td>n/a</td><td>für die Bildverarbeitung verwendet</td></tr><tr><td>Rhodamin B Isothiocyanat-Dextran</td><td>Sigma</td><td>r8881-100mg</td><td>"flüssiger" Zustand im Manuskript</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>In-vivo-Bildgebungssystem</td></tr></tbody></table>

untersuchung der mechanosensorik von luminalen partikeln im murinen dünndarm

Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates

Die gastrointestinale Motilität (GI) ist entscheidend für eine normale Verdauung und Resorption. Im Dünndarm, der Nährstoffe aufnimmt, optimiert die Motilität die Verdauung und Absorption. Aus diesem Grund umfassen einige der Motilitätsmuster im Dünndarm Segmentierung zum Mischen von luminalen Inhalten und Peristaltik für ihren Antrieb. Physikalische Eigenschaften des luminalen Inhalts modulieren die Muster der Dünndarmmotilität. Die mechanische Stimulation mechanosensorischer GI-Schaltkreise durch den Transit von luminalen Inhalten und der zugrunde liegenden Darmmotilität initiiert und moduliert komplexe GI-Motormuster. Die mechanosensorischen Mechanismen, die diesen Prozess antreiben, sind jedoch noch wenig verstanden. Dies ist vor allem auf einen Mangel an Werkzeugen zurückzuführen, um zu analysieren, wie der Dünndarm mit Materialien unterschiedlicher physikalischer Eigenschaften umgeht. Um zu untersuchen, wie der Dünndarm mit Partikeln unterschiedlicher Größe umgeht, haben wir eine etablierte in vivo-Methode zur Bestimmung des Dünndarmtransits modifiziert. Wir gördern lebende Mäuse mit fluoreszierender Flüssigkeit oder winzigen fluoreszierenden Perlen. Nach 30 Minuten sezieren wir den Darm, um die Verteilung des fluoreszierenden Inhalts über den gesamten GI-Trakt abzubilden. Zusätzlich zu hochauflösenden Messungen des geometrischen Zentrums verwenden wir Binning variabler Größe und Spektralanalysen, um zu bestimmen, wie verschiedene Materialien den Dünndarmtransit beeinflussen. Wir haben untersucht, wie ein kürzlich entdeckter "Darmberührungsmechanismus" die Dünndarmmotilität mit diesem Ansatz beeinflusst.

Wir zeigen repräsentative Ergebnisse ab Schritt 3. Abbildung 1 zeigt den intakten explantierten Darm, wobei fluoreszierende Messungen überlagert sind. Der Magen (lila) liegt entlang der gleichen Achse wie der Dünndarm (orange), aber wir ziehen es vor, den Blinddarm (blau) zur Seite zu bewegen, um eine Überlappung mit dem Dickdarm (orange) zu vermeiden. Wie im linken Bild zu sehen ist, ist dies aufgrund der Organgröße nicht immer möglich. Wir schneiden den Dünndarm bei ~ 200 mm, um die Abdeck...

Um zu untersuchen, wie der Dünndarm mit Partikeln unterschiedlicher Größe umgeht, haben wir eine etablierte in vivo-Methode zur Bestimmung des Dünndarmtransits modifiziert.

Untersuchung der Mechanosensorik von luminalen Partikeln im murinen Dünndarm

Gastrointestinal (GI) motility is critical for normal digestion and absorption. In the small bowel, which absorbs nutrients, motility optimizes digestion ...

Dies ist ein Protokoll, das untersucht, wie der Dünndarm mit Materialien unterschiedlicher physikalischer Eigenschaften umgeht und wie er diese Materialien im Raum verteilt. Es ist ein ergänzendes Werkzeug in unserer Studie der Darmmechanosensitivität. Die Hauptvorteile dieses Protokolls bestehen darin, dass es verwendet werden kann, um Materialien oder Mischungen mit unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften zu untersuchen, und dass die Auflösung es uns ermöglicht, regionale Transite über kurze Darmsegmente aufzulösen.Diese Technik trägt zu unserem Verständnis der Darmmechanosensitivität bei. Es hilft uns zu verstehen, wie der Dünndarm Transitentscheidungen trifft, basierend auf den mechanischen Hinweisen, die er von den intraluminalen Inhalten erhält. Um zu beginnen, bereiten Sie die Sonde vor, indem Sie ein Zuführrohr von 18 Gauge Dicke und 50 Millimeter Länge an eine 1-Milliliter-Spritze anbringen und 200 Mikroliter RITC-Lösung oder Mikrokugellösung ziehen.Als nächstes halten Sie das nüchterne Tier manuell mit der einhändigen Rückhaltetechnik zurück und führen Sie dann die Ernährungssonde vorsichtig durch den Mund und die Speiseröhre der Maus ein, bis sie in den Magen gela

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Postoperativen Ileus (POI) ist eine Komplikation der Bauchchirurgie führt zu einer erhöhten Morbidität und einen längeren Krankenhausaufenthalt. Da prophylaktische oder therapeutische Strategien fehlen verstärkte Forschung notwendig ist. Deshalb haben wir eine standardisierte und machbar Mausmodell, um die Pathophysiologie von POI zu untersuchen und mögliche therapeutische Optionen zu studieren.

Functional Assessment of Darmmotilität und Darmwand Entzündung in Nagetiere: Analysen in einem standardisierten Modell der intestinalen Manipulation

Dieses Video zeigt die Generierung eines Ileumschleifenmodells zur Untersuchung der Darmpermeabilität in einem Mausmodell. Diese Methode bietet ein Live-Modell, um die Funktion der epithelialen Barriere und die daraus resultierende Immunantwort zu verstehen.

Maus-Ileumschleifenmodell: Ein chirurgisches Modell zur Untersuchung der Darmpermeabilität bei der Maus

In diesem Video beschreiben wir ein chirurgisches Verfahren zur Erzeugung einer proximalen Dickdarmschleife oder eines pcLoop-Segments der Maus, gefolgt von einer intraluminalen Injektion von fluoreszierenden Markern in das Segment, um die intestinale Epithelpermeabilität zu untersuchen.

Generierung eines proximalen Dickdarmschleifenmodells der Maus: ein chirurgisches Verfahren zur Erzeugung einer proximalen Dickdarmschleife und zur Messung der intestinalen Permeabilität durch Nachweis von Fluoreszenzmarkern im Serum nach intraluminaler Injektion

Die in vivo Messung von Kontraktionen der glatten Muskulatur entlang des Magen-Darm-Trakts von Versuchstieren ist nach wie vor eine leistungsfähige, wenn auch wenig genutzte Technik. Flexible Dehnungsmessstreifen mit zwei Elementen sind nicht im Handel erhältlich und müssen hergestellt werden. Dieses Protokoll beschreibt die Konstruktion von zuverlässigen, kostengünstigen Dehnungsmessstreifen für die akute oder chronische Implantation bei Nagetieren.

Herstellung und Implantation von Miniatur-Zweielement Dehnungsmessstreifen für Mess<em&gt; In Vivo</em&gt; Magen-Darm-Kontraktionen in Nagetiere.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von exzidierten Darmgewebepräparaten oder "Darmsäcken" als ex vivo Modell der Darmbarrierefunktion. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Integrität sowohl der Epithelbarriere als auch der Schleimhautgelschicht an spezifischen Darmstellen in Tiermodellen für Verdauungserkrankungen zu beurteilen.

Ex vivo-Darm-Sacs zu beurteilen Durchlässigkeit der Schleimhaut in Modelle von Magen-Darm-Krankheit

Dieser Artikel beschreibt eine Videobildgebungstechnik und hochauflösende raumzeitliche Kartierung, um Veränderungen in der neuronalen Regulation der Dickdarmmotilität bei erwachsenen Mäusen zu identifizieren. Subtile Auswirkungen auf die gastrointestinale Funktion (GI) können mit diesem Ansatz in isolierten Gewebepräparaten nachgewiesen werden, um unser Verständnis von GI-Erkrankungen zu verbessern.

Video Imaging und Raum-Zeit-Karten zur Analyse Gastrointestinale Motilität bei Mäusen

Unter Ausnutzung der intravitalen Mikroskopie ermöglicht die hier vorgestellte Methode die Echtzeit-Visualisierung des Darmepithelzellvergießens bei lebenden Tieren. Daher wird topisch gefärbte Darmschleimhaut (Acriflavine und RhodamineB-Dextran) von anästhesierten Mäusen bis zur einzelzelligen Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet.

Ein intravitaler, auf Mikroskopie basierender Ansatz zur Bewertung der Darmdurchlässigkeit und der Epithelzellvergießen-Performance

Dysregulierte intestinale epitheliale Barrierefunktion und Immunantworten sind Kennzeichen entzündlicher Darmerkrankungen, die aufgrund fehlender physiologischer Modelle noch schlecht untersucht sind. Hier beschreiben wir ein Maus-Darmschleifenmodell, das ein gut vaskularisiertes und exteriorisiertes Darmsegment verwendet, um die Schleimhautpermeabilität und die Leukozytenrekrutierung in vivo zu untersuchen.

Funktionelle Beurteilung der Intestinalpermeabilität und der neutrophilen transepithelialen Migration bei Mäusen mit einem standardisierten Darmschleifenmodell

In dieser Studie wird eine 3D-Bildgebungsmethode vorgestellt, bei der das gesamte Darmgewebe und die Multiphotonenmikroskopie zur Quantifizierung des sezernierten Schleims verwendet werden, was eine präzise volumetrische Analyse und Visualisierung der Schleimdynamik als Reaktion auf Reize wie Carbamoylcholinchlorid ermöglicht.

Dreidimensionale Quantifizierung von Darmschleim mittels Whole-Mount Tissue Imaging

Dieser Artikel beschreibt: (1) die orale Abgabe von Testmolekülen an Neugeborenenmäuse bereits ab DOL 6; und (2) ex-vivo-Bewertung der Funktion der Colonepithelbarriere in Biopsien von DOL 10 bis zum Abstillen (DOL 20) Jungen durch Bewertung der parazellulären und transzellulären Permeabilität mit Ussing-Kammern.

Orale Gavage bei neonatalen Mauswelpen und funktionelle Beurteilung der Integrität der Darmbarriere mittels Ussing-Kammern

Erfahren Sie, wie das murine Dünndarm mechanosensorische Transitentscheidungen bei verschiedenen Partikelgrößen trifft. Diese modifizierte in-vivo-Methode ermöglicht hochauflösende regionale Analysen kurzer Darmsegmente.

Untersuchung der Mechanosensorik von luminalen Partikeln im murinen Dünndarm

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