Chemische Multiplex-Bildgebung auf Basis einer breitbandstimulierten Raman-Streumikroskopie

Wir präsentieren ein Protokoll zur Aufnahme chemischer Bilder mit breitbandig stimulierter Raman-Streuung (SRS) -Mikroskopie. Basierend auf einem SRS-Mikroskop, das mit differentieller Mehrkanal-Lock-in-Detektion arbeitet, beschreibt das Protokoll die Probenvorbereitung, die Anpassung der SRS-Vorrichtung und die Chemometrie, um verschiedene Bestandteile chemisch heterogener Proben zu entwirren.

Unser Protokoll beschreibt, wie man eine stimulierte Raman-Streumikroskopie baut, die die Messung des Schwingungsspektrums der Moleküle innerhalb von Mikrosekunden ermöglicht. Und wenn es auf die Bildgebung angewendet wird, kann es eine hyperspektrale Mikroskopie bereitstellen, um die chemischen Bestandteile der Materie auf markierungsfreie und nicht-invasive Weise zu lokalisieren und zu quantifizieren. Es gibt mehrere Anwendungen dieses Protokolls, hauptsächlich in den biologischen und biomedizinischen Wissenschaften.

Zum Beispiel, um Zellen oder Gewebe abzubilden. Es gibt zwei wichtige Herausforderungen für unseren Ansatz, die breitbandige optische Quelle und die Detektionskette. Um ersteres anzugehen, kann man einen OPR kaufen oder einen selbst bauen.

Alternativ kann man das Weißlicht-Superkontinuum verwenden, das in Massenkristallen oder in nichtlinearen optischen Fasern erzeugt wird. Die letztere Herausforderung kann angegangen werden, indem jede Spektralkomponente nacheinander mit einer kommerziellen Photodiode und einem Galvoscanner abgetastet wird. Extrahieren Sie zunächst zwei Mikroliter aus einer wässrigen Suspension von Polymethylmethacrylat oder PMMA-Mikrokügelchen und gießen Sie die Suspension auf ein Mikroskop-Deckglas. Extrahieren Sie dann zwei Mikroliter aus einer wässrigen Suspension von Polystyrol-Mikrokügelchen und kombinieren Sie sie mit der PMMA-Suspension auf dem Deckglas.

Mischen Sie die Suspension vorsichtig mit einer Pipettenspitze und lassen Sie sie 24 Stunden trocknen. Eine weiße Perlenschicht erscheint auf dem Deckblatt, wenn das Wasser abtrocknet. Fügen Sie 20 Mikroliter Dimethylsulfoxid und 20 Mikroliter reines Olivenöl auf den Deckzettel hinzu.

Und tragen Sie Nagellack auf die Ränder des zweiten Mikroskop-Deckglases auf. Legen Sie den Deckbeleg mit dem Nagellack nach unten auf die Mischung und üben Sie genügend Druck aus, um sie zu versiegeln. Lassen Sie es trocknen.

Zur Optimierung der Modulationseffizienz des schmalbandigen Stokes-Strahls. Ändern Sie den Abstand zwischen den Linsen F1 und F2 und messen Sie den modulierten Strahl mit einer Fotodiode. Zeichnen Sie dann sein Profil mit einem Oszilloskop auf.

Stellen Sie die Kavitätenlänge des optischen parametrischen Oszillators so ein, dass das resultierende Breitbandpumpenspektrum zusammen mit dem schmalbandigen Stokes bei 1040 Nanometern eine Frequenzoptimierung innerhalb von 2.800 bis 3.100 inversen Zentimetern erzeugen kann. Dieser Spektralbereich deckt die Schwingungen der CH-Dehnungsregion ab. Senden Sie die Breitbandpumpe an einen Prismenkompressor, um die vom Anregungsmikroskopobjektiv enthaltenen Dispersionseffekte auszugleichen.

Geben Sie die Pumpe durch ihren Scheitelpunkt in Prisma A ein und führen Sie die dispergierte Pumpe zum Scheitelpunkt von Prisma B.Definieren Sie die Menge der erforderlichen negativen Dispersion und stellen Sie den Abstand zwischen den Prismen entsprechend ein. Verwenden Sie Brewster-Schnittprismen und stellen Sie sicher, dass die Polarisation des Pumpenstrahls innerhalb der dreieckigen Ebenen der Prismen liegt. Um das Inline-Balanced-Detektionsschema zu optimieren, stellen Sie die schnelle Achse dieses doppelbrechenden Kristalls vertikal ein und führen Sie die polarisierte Pumpe zu einer YV04-Platte mit einer Länge von 13,3 Millimetern.

Verwenden Sie dann eine Halbwellenplatte, um die Polarisation des Pumpstrahls auf 45 Grad einzustellen. Kombinieren Sie die Pumpe und die Stokes-Strahlen mit einem dichroitischen Spiegel und richten Sie sie vorsichtig mit einem Paar fluoreszierender Pinholes aus. Stellen Sie sicher, dass sich beide Balken colinear ausbreiten.

Dämpfen Sie die Strahlen und führen Sie sie auf eine schnelle Fotodiode, um sie vorübergehend zu überlappen. Danach entfernen Sie die Fotodiode. Als nächstes messen Sie die Strahlprofile mit einer kalibrierten Kamera und verwenden Sie eine Infrarotkarte, um die Durchmesser mit dem Auge zu schätzen.

Verwenden Sie zwei Teleskope. Eine für die Pumpe und eine andere für den Stokes-Strahl, und versuchen Sie, die Strahldurchmesser an die hintere Öffnung des Anregungsobjektivs anzupassen. Sobald die stimulierte Raman-Streuung oder das SRS-Signal erreicht ist, verwenden Sie das Teleskop am Pumpstrahl, um seinen Durchmesser zu optimieren und den Rayleigh-Bereich und folglich das Interaktionsvolumen am Fokus des Mikroskops zu variieren.

Stoppen Sie, wenn der maximale SRS erreicht ist. Verwenden Sie eine Fotodiode, um die Intensität des Pumpenstrahls zu messen, und berechnen Sie mit der Reaktionsfähigkeit der Fotodiode die mittlere Leistung, die auf den aktiven Bereich des Detektors auftrifft. Um das Rauschen der relativen Intensität des Lasers zu messen, trennen Sie den Tiefpassfilter und schließen Sie den Ausgang einer Fotodiode mit hoher Bandbreite an den Eingang eines Lock-in-Verstärkers an.

Speichern Sie den Lock-in-Ausgang in Volt über der Quadratwurzel von Hertz bei verschiedenen Demodulationsfrequenzen und verwenden Sie die Empfindlichkeit der Fotodioden, um Volt in Watt umzuwandeln. Führen Sie die Pumpe und die Stokes-Strahlen zum Mikroskop. Platzieren Sie die Probe und finden Sie einen Bereich ohne Perlen, um den Pumpenstrahl auszurichten.

Machen Sie dann die Erregungs- und Sammelziele konfokal. Setzen Sie einen Kurzpassfilter ein, um die modulierten Stokes zu entfernen und den Pumpenstrahl zur Planierung zu führen. Platzieren Sie nach dem Grading eine Linse, um den verstreuten Strahl auf die Detektoren zu fokussieren.

Für eine ausgewogene Detektion messen Sie das Spektrum der Referenz und die Signalnachbildungen, die sich entlang des Pumpenstrahls ausbreiten. Platzieren Sie einen kleinen Schlitz oder eine Iris zwischen der Planierung und einem polarisierenden Strahlteiler, um die spektrale Anpassung zwischen den beiden Photodiodenarrays zu gewährleisten und die dispergierte Pumpe räumlich zu filtern. Schneiden Sie alle bis auf eine Spektralkomponente der Pumpe nach, um die übertragenen Strahlen auf dem N-ten Detektor der Referenz- und Signalphotodiodenarrays zu zentrieren.

Verwenden Sie die Lenkspiegel, um die Korrelation der verschiedenen Erfassungskanäle einzustellen. Um die SRS-Mikroskopie zu starten: Modulieren Sie die Stokes, scannen Sie die Probe und erfassen Sie die Modulationsübertragung auf dem Pumpenspektrum mit dem entsprechenden DC-Spektrum, um das normalisierte SRS-Spektrum von jedem Pixel zu erhalten. Erstellen Sie dreidimensionale Matrizen, deren Zeilen und Spalten die gescannten Positionen der Stichprobe enthalten.

Speichern Sie auf jedem Vektor, der orthogonal zur XY-Ebene ist, ein SRS-Spektrum. Zeichnen Sie die Konzentration und die Spektralprofile auf, um die chemischen Bilder und die charakteristischen Spektren der chemischen Bestandteile der Probe zu erfassen. Das repräsentative Bild zeigt die relativen Intensitätsrauschspektren der in diesem Protokoll verwendeten optischen Quellen.

Hier ist die beste Spektralregion für die SRS-Experimente dargestellt. Die Modulation des Stokes-Strahls bei jeder Frequenz innerhalb dieses Bandes garantiert, dass die Auswirkungen des Laserrauschens auf das SRS-Signal so gering wie möglich sind. Hier werden exemplarische Daten der unausgeglichenen und ausgeglichenen Spektren gezeigt.

Die Auswirkungen einer ausgewogenen Detektion wirken sich auf die Endergebnisse der Experimente aus. Nämlich die chemischen Karten. Die zusammengesetzten Bilder unter den unausgeglichenen und ausgeglichenen Bedingungen werden hier gezeigt.

Die repräsentativen Bilder zeigen eine chemometrische Analyse der hyperspektralen SRS-Daten. Hier ist eine Zusammenstellung der Konzentrationskarten der verschiedenen chemischen Bestandteile der Probe und ihrer charakteristischen SRS-Spektren dargestellt. Aus diesen Daten können die verschiedenen Bestandteile der Probe, z. B. Olivenöl, DMSO-Polystyrol und Polymethylmethacrylat, leicht identifiziert werden.

Derzeit kann unsere Technik nur die CH-Schwingungsdehnung untersuchen. Durch die Optimierung der optischen Quelle ermöglicht uns die gleiche Erkennungskette, die informativere Fingerabdruckregion zu erkunden und mehrere Modi gleichzeitig zu erkennen. Unsere Nachweiskette ebnet den Weg für die Integration von Breitband-SRS in die Kliniken und führt eine Technologie ein, die den traditionellen histopathologischen Workflow für die Gewebediagnose ergänzt und verbessert.