Name: Kleine Extraktion von Caenorhabditis elegans Genomischer DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Lernen Sie eine schnelle Methode zur Extraktion genomischer DNA aus Caenorhabditis elegans für PCR-Anwendungen. Dieses robuste Protokoll eignet sich ideal für Forschung und Lehre.

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Der N2-Stamm und E. coli OP50-Bakterien wurden vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) bezogen, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Der Stamm blmp-1(tm548) wurde vom National Bioresource Project, Japan, bezogen. Die Autoren danken WormBase. Diese Arbeit wurde von NIH R01GM097591 an T.L.G., interne Finanzierung durch die Texas Woman's University an T.L.G. und TWU's Center for Student Research an M.F.L. unterstützt.

1. C. elegans Wartung
HINWEIS: N2 (Wildtyp) und blmp-1(tm548) C. elegans Stämme wurden auf Standard-Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) -Platten bei 20 ° C gehalten.
<ol><li>Bereiten Sie NGM-Platten vor, indem Sie 23,005 g NGM-Pulver in 973 ml Wasser in einem 2-Liter-Kolben auflösen. Decken Sie die Kolbenöffnung mit Aluminiumfolie (oder einer autoklavierbaren Kappe, die eine Belüftung ermöglicht) ab und sichern Sie die Abdeckung mit Autoklavband. Autoklav zum Auflösen des Pulvers und Sterilisieren des Inhalts mit einem Sterilisationszyklus von mindestens 30 min.</li>
	<li>Das Medium in einem Wasserbad auf 60 °C abkühlen.</li>
	<li>Zu dem abgekühlten Medium werden 25 ml steriler 1 M Phosphatpuffer (KH2PO4), pH 6,0, zugegeben; 1 ml 1 M Calciumchloridlösung; und 1 ml 1 M Magnesiumsulfatlösung.</li>
	<li>Rühren Sie das Medium auf einer magnetischen Rührplatte um, um eine homogene Mischung zu erhalten und eine ungleichmäßige Abkühlung und Erstarrung zu verhindern (~5 min). Stellen Sie sicher, dass sich der Rührstab schnell genug dreht, um einen Wirbel zu erzeugen, aber nicht so schnell, dass Blasen eingeführt werden (~ 250-300 U / min).</li>
	<li>Gießen Sie ~ 25 ml des Mediums in jede 10 cm Petriplatte (~ 40 Platten insgesamt). Trocknen Sie die Platten bei Raumtemperatur über Nacht (typischerweise 16-25 °C).</li>
	<li>Züchten Sie eine Kolonie Escherichia coli OP50 in 30-50 ml LB-Brühe über Nacht bei 37 ° C.</li>
	<li>Jede Platte mit 500 μL E. coli OP50-Kultur aussaat und vor Gebrauch bei Raumtemperatur trocknen lassen (typischerweise 16-25 °C)8. Lagern Sie die Platten bei 4 °C für bis zu 3 Wochen.</li>
	<li>C. elegans mit einer Drahtpickel oder einer anderen Methode auf ausgesäte Platten übertragen und sie bei der für den Stamm erforderlichen Temperatur auf L4 oder das Erwachsenenstadium wachsen lassen (typischerweise 16-25 °C, 1-2 Tage, wenn Tiere als Dauers verhungert wurden, 3-4 Tage, wenn Tiere als Embryonen plattiert wurden)8.</li>
</ol>2. Einzelwurm-DNA-Extraktion
HINWEIS: Diese Methode ist nützlich, um DNA aus einem einzelnen Wurm (ein Wurm in 1,8 μL Gesamtvolumen) zu extrahieren. Ein Master-Mix kann erstellt werden, wenn mehrere Würmer gleichzeitig lysiert werden.
<ol><li>Programmieren Sie einen Thermocycler für einen Zyklus bei 55 °C für 10 Minuten, gefolgt von 95 °C für 3 min (Lyseprogramm).</li>
	<li>Aliquot 0,8 μL der Extraktionslösung aus dem Kit auf die Innenwand eines 0,2 mL PCR-Röhrchens auf Eis. 0,2 μL der Gewebepräparationslösung aus dem Kit in das Tröpfchen der Extraktionslösung geben. Mischen durch Pipettieren.</li>
	<li>Identifizieren Sie ein L4 oder ein erwachsenes Tier unter einem Seziermikroskop9. Um L4-Hermaphroditen zu identifizieren, suchen Sie nach einer charakteristischen Vulva, die als blasser Halbkreis in der Mitte des Tieres sichtbar ist. Identifizieren Sie erwachsene Hermaphroditen, indem Sie nach den größten Tieren auf dem Teller suchen, die ovale Embryonen in ihrer Gebärmutter sichtbar haben können.</li>
	<li>Übertragen Sie das ausgewählte Tier mit einem Platin-Drahtbesteck in die Lösung10.</li>
	<li>Zentrieren Sie das Rohr kurz (2-3 s, ≤6.000 U / min / 2.000 × g) bei Raumtemperatur, um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr in den Thermocycler und führen Sie das in Schritt 2.1 eingestellte Lyseprogramm aus.</li>
	<li>Wenn das Programm abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz und legen Sie es auf Eis. 0,8 μL der Neutralisationslösung aus dem Kit in die Mischung geben. Mischen durch Pipettieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr kurz bei Raumtemperatur (2-3 s, ≤6.000 U/min/2.000 × g).</li>
	<li>Verwenden Sie das Lysat direkt für die PCR oder lagern Sie es bei 4 °C oder -20 °C für die zukünftige Verwendung. HINWEIS: Die extrahierte DNA ist bei 4 °C oder -20 °C für mindestens 6 Monate stabil7.</li>
</ol>3. DNA-Extraktion einiger weniger Individuen
HINWEIS: Diese Methode ist nützlich, um DNA aus einigen Würmern zu extrahieren. Ein Master-Mix kann hergestellt werden, wenn mehrere Stämme gleichzeitig lysiert werden.
<ol><li>Programmieren Sie den Thermocycler für einen Zyklus bei 55 °C für 10 Minuten, gefolgt von 95 °C für 3 min (Lyseprogramm).</li>
	<li>Aliquot 2,0 μL der Extraktionslösung aus dem Kit auf die Innenwand eines 0,2 ml PCR-Röhrchens auf Eis. 0,5 μL der Gewebepräparationslösung aus dem Kit in das Tröpfchen der Extraktionslösung geben. Mischen durch Pipettieren.</li>
	<li>Identifizieren Sie L4 oder erwachsene Tiere unter einem Seziermikroskop9. L4-Hermaphroditen haben eine charakteristische Vulva, die als blasser Halbkreis in der Mitte des Tieres sichtbar ist. Erwachsene Hermaphroditen sind die größten Tiere auf dem Teller und können ovale Embryonen in ihrer Gebärmutter sichtbar haben.</li>
	<li>Übertragen Sie mit einem Platin-Drahtbecher einige Tiere in die Lösung: 9 Tiere ergeben 1 tierisches Äquivalent genomischer DNA pro 0,5 μL Lysat und 16 Tiere erhalten ~ 1 tierisches Äquivalent genomischer DNA in 0,25 μL (3,5 Nematoden/μL)10. HINWEIS: Es ist schwierig, mehr als 16 Tiere in diesen Band zu übertragen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr kurz bei Raumtemperatur (2-3 s, ≤6.000 U / min / 2.000 × g).</li>
	<li>Legen Sie das Rohr in den Thermocycler und führen Sie das Lyseprogramm aus, das in Schritt 3.1 eingestellt ist.</li>
	<li>Wenn das Programm abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz und legen Sie es auf Eis. 2 μL der Neutralisationslösung aus dem Kit in die Mischung geben. Mischen durch Pipettieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr kurz bei Raumtemperatur (2-3 s, ≤6.000 U/min/2.000 × g).</li>
	<li>Verwenden Sie die Lyse direkt für die PCR oder lagern Sie sie bei 4 °C oder −20 °C für die zukünftige Verwendung. HINWEIS: Die extrahierte DNA ist bei 4 °C oder -20 °C für mindestens 6 Monate stabil7.</li>
</ol>4. PCR-Reaktion
HINWEIS: Eine nachgelagerte Anwendung dieser Wurmlysetechnik, die eine Deletionsmutation mit einer schnellen Polymerase nachweist, wird beschrieben. Die Wirksamkeit der beiden Wurmlyseprotokolle bei der Herstellung genomischer Vorlagen-DNA für eine erfolgreiche PCR bei Verdünnungen auf 1/50eines Wurms pro Reaktion ist ebenfalls nachgewiesen.
<ol><li>Extrahieren Sie DNA aus einem einzelnen Wurm und 16 Würmern unter Verwendung von Wildtyp-N2- und Mutantenstämmen, wie oben in Schritt 2 und Schritt 3 beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie 2-, 10-, 20- und 50-fache Verdünnungen von Single-Worm-DNA von Wildtyp-N2-Tieren vor.</li>
	<li>Richten Sie PCR-Reaktionen nach dem Protokoll des Herstellers unter Verwendung von Primern ein, die für die interessierende Sequenz und den Hot-Start-PCR-Master-Mix spezifisch sind (Tabelle 1 und Tabelle 2). Verwenden Sie 1 μL unverdünnte DNA oder 2 μL verdünnte DNA als Vorlage für jede Reaktion.</li>
	<li>Bestätigen Sie die PCR-Produkte durch Gelelektrophorese und Bildgebung11.</li>
</ol>

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+window+into+biology%3A+A+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).</li>
<li>Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+mapping+system+in+Caenorhabditis+elegans+based+on+polymorphic+sequence-tagged+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites.</a> Genetics. 131, 609-624 (1992).</li>
<li>Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Caenorhabditis+elegans+genomic+DNA+and+detection+of+deletions+in+the+unc-93+gene+using+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).</li>
<li>Fay, D., Bender, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNPs%3A+introduction+and+two-point+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">SNPs: introduction and two-point mapping.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).</li>
<li>Biron, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiron%2C+D+%22C.+elegans%3A+Methods+and+Applications%22">C. elegans: Methods and Applications</a>. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).</li>
<li>Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf</a> (2013).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , ed. The C. Elegans Research Community, Wormbook (2006).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152(2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293(2011).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923(2012).</li>
<li>Gumienny, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+SMA-10%2FLRIG+is+a+conserved+transmembrane+protein+that+enhances+bone+morphogenetic+protein+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling.</a> PLoS Genetics. 6, 1000963(2010).</li>
<li>Nelson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bow-tie+genetic+architecture+for+morphogenesis+suggested+by+a+genome-wide+RNAi+screen+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, 1002010(2011).</li>
<li>Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLMP-1+contributes+to+collagen-related+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans.</a> Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).</li>
<li>Horn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRE-1%2FFBXO11-dependent+degradation+of+BLMP-1%2FBLIMP-1+governs+C.+elegans+developmental+timing+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation.</a> Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).</li>
<li>Huang, T. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLMP-1%2FBlimp-1+regulates+the+spatiotemporal+cell+migration+pattern+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10, 1004428(2014).</li>
<li>Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interactions+between+the+DBL-1%2FBMP-like+pathway+and+dpy+body+size-associated+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).</li>
<li>Madeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EMBL-EBI+search+and+sequence+analysis+tools+APIs+in+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019.</a> Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die Bestimmung der Genotypen von C. elegans ist ein wichtiger Schritt bei der Durchführung genetischer Kreuzungen, um neue C. elegans-Stämme zu erzeugen. Die genomische DNA-Extraktion mit einem oder wenigen C. elegans ist ein entscheidender Schritt bei der Genotypisierung von C. elegans. Dieses Protokoll beschreibt die genomische DNA-Extraktion aus C. elegans mit einem kommerziellen Kit. Diese Methode ist schnell und funktioniert robust. Die mit dieser Methode extrahierte gen...

Hier werden zwei verwandte Protokolle für die Lyse von Caenorhabditis elegans vorgestellt, um DNA für PCR-basierte Anwendungen zugänglich zu machen. PCR ist eine häufig verwendete molekulare Technik, die für viele Anwendungen verwendet wird, einschließlich der Genotypisierung und Amplifikation von DNA-Fragmenten zum Klonen und Sequenzieren, unter anderem. Der kleine (1 mm), freilebende Spulwurm C. elegans ist ein beliebtes Tiersystem für die biologische Forschung. Die Gewinnung geeigneter genomischer DNA von einem einzelnen Tier oder einigen wenigen Tieren reicht aus, um die Sequenz durch PCR zu amplifizieren. Späte L4-Larven und Erwachsene enthalten nur ~ 1.000 somatische Zellen (einschließlich einiger multinuklearer, polyploider Zellen), Keimzellen und (wenn das Tier ein gravider Hermaphrodit ist) Nachkommen in utero1. Diese Tiere sind jedoch durch eine Kutikula geschützt, die gestört werden muss, um die genomische DNA2 zu extrahieren. Standardmethoden zur Vorbereitung der genomischen DNA-Vorlage für Nematoden für die PCR umfassen mehrere Schritte und dauern mehrere Stunden. Die Tiere werden zunächst in Wurmlysepuffer eingefroren, der Proteinase K (−70 °C oder weniger) für mindestens 15-45 min enthält (längere wird von einigen Protokollen empfohlen)3,4,5,6. Dieser Schritt reißt die Tiere auf.
Nach dem Einfrieren werden die Tiere für 1 h bei 60-65 °C inkubiert, damit die Proteinase K funktioniert, dann wird das Enzym für 15-30 min bei 95 °C inaktiviert. Die Proteinase K zerstört die Nukleasen, die DNA abbauen. Die Inaktivierung der Proteinase K vor der PCR ist wichtig, um zu verhindern, dass die Proteinase K die DNA-Polymerase abbaut. Die beiden hier beschriebenen Kit-basierten Protokolle sind schnelle, zuverlässige und kostengünstige Methoden, um genomische DNA aus einem einzelnen Tier oder einigen Nematoden für alltägliche Forschungs- und Lehrlaboranwendungen zu extrahieren. Das verwendete Kit wurde ursprünglich vom Hersteller optimiert, um DNA aus tierischem Gewebe, Speichel und Haaren zu extrahieren7. Es verwendet eine proprietäre Gewebepräparationslösung und Extraktionslösung, um Zellen zu lysieren und genomische DNA zugänglich zu machen. Eine proprietäre Neutralisationslösung neutralisiert dann die Komponenten, die die PCR hemmen können (z. B. Salze, Ionen und Mg2+-bindende Moleküle).
Bei der Genotypisierung kann ein einzelnes Tier getestet werden. Bei der Bestimmung, ob ein Stamm homozygot ist, gibt das Testen von sechs oder mehr Nachkommen eines einzelnen Tieres eine hohe Sicherheit, dass eine Linie homozygot ist oder nicht (es besteht eine Wahrscheinlichkeit von 0,02%, dass zufällig sechs homozygote mutierte Nachkommen von einem heterozygoten Elternteil ausgewählt werden [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Diese Methode 1) ist einfach, mit weniger Schritten als die Proteinase K-Methode, und 2) verringert die Vorlagenvorbereitungszeit auf 15 min. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das entwickelte Protokoll robust bei der Extraktion genomischer DNA aus einzelnen oder wenigen Würmern funktioniert, die zuverlässig für nachgelagerte Anwendungen verwendet werden kann, die keine hochgereinigte DNA benötigen, einschließlich PCR.

<table><tbody><tr><td>Autoklavenband</td><td>Defend</td><td>43237-2</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie,</td><td>strapazierfähiges Reynolds Wrap</td><td>2182934</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Millipore Sigma</td><td>102382 (CAS 10035-04-8)</td><td></td></tr><tr><td>Extract-N-Amp Kit (enthält Gewebevorbereitungslösung, Extraktionslösung und Neutralisationslösung)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>XNAT2-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Heizplatte/Rührer</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-495H</td><td></td></tr><tr><td>LB Medien, Lennox, Kapseln</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>3002-131</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat, 97% rein, wasserfrei</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC413485000 (CAS 7487-88-9)</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Labnet International, Inc.</td><td>PrismR, C2500-R</td><td></td></tr><tr><td>NEB Q5U Heißstart High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>M0515S</td> <td>"Pol E", verwendet in Supplemental Figure S1, eine Hochgeschwindigkeitspolymerase mit hoher Genauigkeit (20&ndash; 30 s/kb)</td></tr><tr><td>NGM-Medienpulver</td><td>US Biological Life Sciences</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix mit HF-Puffer</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>M0531S</td><td>"Pol D" in Abbildung 1B, eine Hochgeschwindigkeitspolymerase mit hoher Genauigkeit (15&ndash; 30 s/kb)</td></tr><tr><td>primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>kundenspezifische DNA-Oligos</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL Polymerase</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>R050B</td> <td>"Pol C" in Abbildung 1B, eine High-Fidelity-Polymerase (1 min/kb) für GC-reiche Templates und Templates bis zu 30 kb</td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0,1&ndash; 10,0 kb)</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>N0550S</td><td></td></tr><tr><td>SapphireAmp Schnelle PCR-Mastermischung</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR350A</td> <td>"Pol A" in Abbildung 1B, Polymerase in Abbildung 1A, C, D, eine Hochgeschwindigkeits-Polymerase (10 s/kb) für Ziele bis zu 5 kb</td></tr><tr><td>Sigma ReadyMix Taq PCR-Reaktionsmix</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>P4600</td><td>"Pol B" in Abbildung 1B, eine Polymerase (1 min/kb) für Ziele bis zu 7 kb</td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>A24812</td><td></td></tr><tr><td>Rührstab</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-126</td><td></td></tr><tr><td>Wirbelmischer</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Wurmpicker</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>59-AWP</td><td></td></tr></tbody></table>

kleine extraktion von caenorhabditis elegans genomischer dna

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Die genomische DNA-Extraktion aus einer oder wenigen Caenorhabditis elegans hat viele nachgelagerte Anwendungen, einschließlich PCR für Genotypisierungslinien, Klonen und Sequenzierung. Die traditionellen Proteinase-K-basierten Methoden zur genomischen DNA-Extraktion aus C. elegans dauern mehrere Stunden. Kommerzielle Extraktionskits, die die Cuticula von C. elegans effektiv aufbrechen und genomische DNA extrahieren, sind begrenzt. Eine einfache, schnellere (~ 15 min) und kostengünstige Methode zur Extraktion von C. elegans genomischer DNA, die sich gut für Unterrichts- und Forschungsanwendungen eignet, wird hier berichtet. Diese DNA-Extraktionsmethode ist optimiert, um einzelne oder einige spätlarven (L4) oder erwachsene Nematoden als Ausgangsmaterial für die Gewinnung einer zuverlässigen Vorlage für die Durchführung einer PCR zu verwenden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die DNA-Qualität geeignet ist, Genziele unterschiedlicher Größe durch PCR zu amplifizieren, was die Genotypisierung einzelner oder weniger Tiere auch bei Verdünnungen auf ein Fünfzigstel der genomischen DNA von einem einzelnen Erwachsenen pro Reaktion ermöglicht. Die berichteten Protokolle können zuverlässig verwendet werden, um DNA-Template aus einer einzelnen oder einer kleinen Probe von C. elegans für PCR-basierte Anwendungen schnell herzustellen.

Genomische DNA von einem einzelnen oder wenigen Wildtyp-Erwachsenen wurde mit dem kommerziellen Kit oder dem traditionellen Lyseprotokoll extrahiert, um die Wirksamkeit dieser beiden Methoden zu vergleichen. Diese Lysate wurden dann als Vorlagen für die PCR verwendet, um entweder ein größeres Ziel von ~ 2.100 bp (Kodierung von blmp-1) oder ein kleineres Ziel von ~ 500 bp (Kodierung eines Teils von sma-10) zu verstärken. Beide Methoden lieferten erfolgreich geeignete PCR-Produkte (Ab...

Hier wird eine Beschreibung der einfachen und relativ schnellen Isolierung der genomischen DNA von Caenorhabditis elegans aus einem oder wenigen Tieren unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Gewebekits vorgestellt. Die resultierende gDNA-Präparation ist eine geeignete Vorlage für die PCR.

Kleine Extraktion von Caenorhabditis elegans Genomischer DNA

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

Wir haben eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Extraktion der genomischen DNA von C.elegans entwickelt, die sich hervorragend für Unterrichts- und Forschungsanwendungen eignet. Diese Protokolle können zuverlässig verwendet werden, um DNA-Vorlagen aus einer einzigen oder einer kleinen Probe von C.elegance für PCR-basierte Anwendungen schnell herzustellen. Benutzer, die keine Erfahrung mit dem Pflücken von Würmern oder der Verwendung eines Mikropipetters haben, können mit Schritten kämpfen, die diese Fähigkeiten erfordern.Einen erfahrenen Praktiker zu beobachten und zu üben, kann helfen. Das Verfahren wird Farhan Lakdawala, ein Senior-Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Um DNA aus einem einzelnen Caenorhabditis elegans-Wurm zu extrahieren, stellen Sie zuerst das Lyseprogramm ein, das aus einem Zyklus bei 55 Grad Celsius für 10 Minuten besteht, gefolgt von 95 Grad Celsius für drei Minuten in einem Thermocycler.Um die Lyselösung vorzubereiten, fügen Sie zunächst 0,8 Mikroliter Extraktionslösung aus dem Kit an die Innenwand eines 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchens auf Eis hinzu. Dann fügen Sie 0,2 Mikroliter Gewebepräparationslösung aus dem Kit in das Tröpfchen der Extraktionslösung hinzu und mischen Sie es durch Streicheln. Bei der Auswahl eines Wurms für die DNA-Extraktion identifizieren Sie zunächst ein L4- oder erwachsenes Tier unter einem Seziermikroskop.Ein L4-Hermaphrodit kann durch eine charakteristische Vulva identifiziert werden, die als blasser Halbkreis in der Mitte des Tieres sichtbar ist. Um einen erwachsenen Hermaphroditen zu identifizieren, wählen Sie eines der größten Tiere auf der Platte aus, das ovale Embryonen in seiner Gebärmutter sichtbar haben kann. Als nächstes übertragen Sie das ausgewählte Tier mit einem Platin-Drahtbesteck in die Lösung.Um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln, zentrifugieren Sie das Röhrchen für zwei bis drei Sekunden bei 2000 x g bei Raumtemperatur. Legen Sie dann die Röhre in den Thermocycler und führen Sie das zuvor eingestellte Lyseprogramm aus. Nachdem dieses Lyseprogramm beendet ist, zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz und legen Sie es auf Eis.Dann fügen Sie 0,8 Mikroliter Neutralisationslösung aus dem Kit hinzu und mischen Sie es durch Pipettieren. Auch hier zentrieren Sie das Röhrchen für zwei bis drei Sekunden bei 2000 x g bei Raumtemperatur. Wenn das Lysat nicht sofort verwendet wird, lagern Sie das Rohr bei vier Grad Celsius für die zukünftige Verwendung.Um DNA aus einem einzelnen Würmer zu extrahieren, stellen Sie zuerst das Lyseprogramm eines Zyklus auf 55 Grad Celsius für 10 Minuten ein, gefolgt von 95 Grad Celsius für drei Minuten in einem Thermocycler. Als nächstes bereiten Sie die Lyselösung vor, indem Sie zuerst zwei Mikroliter der Extraktionslösung aus dem Kit an die Innenwand eines 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchens auf Eis geben, gefolgt von der Zugabe von 0,5 Mikrolitern der Gewebepräparationslösung aus dem Kit zum Tröpfchen der Extraktionslösung, dann mischen Sie den Inhalt durch Pipettieren. Nachdem Sie L4 oder erwachsene Tiere identifiziert haben, verwenden Sie einen Platin-Drahtpicker, um eine ausreichende Anzahl von Tieren in die Lösung zu übertragen.Als nächstes zentrifugieren Sie das Röhrchen für zwei bis drei Sekunden bei 2000 x g bei Raumtemperatur, legen Sie dann das Röhrchen in den Thermocycler und führen Sie das zuvor eingestellte Lyseprogramm aus. Nach Abschluss des Programms das Röhrchen kurz zentrifugieren und auf Eis legen. Dann zwei Mikroliter der Neutralisationslösung aus dem Kit in das Rohr geben und durch Pipettieren mischen.Auch hier zentrieren Sie das Röhrchen für zwei bis drei Sekunden bei 2000 x g bei Raumtemperatur. Wenn es nicht sofort verwendet wird, lagern Sie das Lysat bei vier Grad Celsius für die zukünftige Verwendung. Die genomische DNA, die durch das Protokoll extrahiert wurde, konnte erfolgreich als PCR-Vorlage verwendet werden, sowohl das kommerzielle Kit als auch die traditionelle Proteinase-K-Methode produzierten DNA mit ähnlichen PCR-Amplifikationsstufen eines 2100-Basenpaar-Produkts und eines 500-Basenpaar-Produkts.Die Kit-Methode für die DNA-Lyse lieferte auch PCR-Vorlagen, die für eine Vielzahl von DNA-Polymerase-Enzymen wirksam sind. Selbst bei verschiedenen Verdünnungen unterstützte die DNA, die von einem einzigen Tier durch das kommerzielle Kit extrahiert wurde, die PCR-Amplifikation eines 2100-Basenpaar-DNA-Fragments mit gleichwertiger Effizienz. Die Amplifikation eines DNA-Fragments mit 500 Basenpaaren variierte jedoch mit der Vorlagenkonzentration.Die Eignung der DNA, die entweder von einem einzelnen Tier oder von mehreren Tieren als PCR-Vorlage zur Bestimmung des Genotyps extrahiert wurde, wurde durch die erfolgreiche Amplifikation eines Gens und seiner mutierten Variante weiter nachgewiesen. Da dieses Protokoll das Pipettieren kleiner Mengen von Reagenzien beinhaltet, verwenden Sie zur Sicherstellung der Konsistenz eine Mastermischung für mehrere Reaktionen, eine gute Rohrleitungstechnik und gut kalibrierte Pipetten. Auch das Drehen des Inhalts des Röhrchens sorgt für eine ordnungsgemäße Lyse.Diese Methode könnte ausgeweitet, angepasst werden, um genomische C.elegans-DNA für andere nachgelagerte Anwendungen zu extrahieren, und könnte verwendet werden, um DNA von anderen Nematodenarten zu extrahieren. Angesichts der Einfachheit, Geschwindigkeit, Robustheit und niedrigen Kosten des Protokolls eignet es sich sowohl für Forschungs- als auch für Klassenzimmeranwendungen, bei denen Zeit und Ressourcen begrenzt sind.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Microarray-Analyse wurde durchgeführt, um genetische Expression Profile in...

Bestimmung genetischer Expressionsprofile in C. elegans Verwenden Microarray-und Real-time PCR

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Einzelwurm-PCR: Eine Methode zur Extraktion und Amplifikation genomischer DNA

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung von RNA, DNA und Proteine aus der gleichen Probe in einer Bemühung zu reduzieren Variation, Verbesserung der Reproduzierbarkeit und Interpretationen zu erleichtern.

Kombinierte Nukleotid- und Protein Extraktionen in Caenorhabditis elegans

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Proteinextrakt-Präparation und Co-Immunpräzipitation von Caenorhabditis elegans

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von aktivem Kernextrakt aus Larvenstadium 4 C. elegans und visualisierung der Transkriptionsaktivität in einem in vitro System.

Isolierung von aktivem Caenorhabditis elegans Kernextrakt und Rekonstitution für in vitro Transkription

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um groß angelegte ökologische Untersuchungen von sich selbst lebenden Caenorhabditis-Nematoden durchzuführen. Der Hauptvorteil dieser Methode ist die effiziente Organisation und Analyse von ökologischen und molekularen Daten, die mit den aus der Natur gesammelten Nematoden verbunden sind.

Ein hochgradig skalierbarer Ansatz zur Durchführung ökologischer Untersuchungen von selbstsüchtigen Caenorhabditis-Nematoden

Es wird ein Protokoll beschrieben, das Laser-Mikrodissektion verwendet, um einzelne Nematodengewebe für die RNA-Sequenzierung zu isolieren. Das Protokoll erfordert keine artspezifischen genetischen Toolkits, so dass Genexpressionsprofile zwischen verschiedenen Spezies auf der Ebene von Einzelgewebeproben verglichen werden können.

Laser-Mikrodissektion für speziesunabhängige Einzelgewebeanwendungen

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von Darm aus adulten Caenorhabditis elegans-Nematodenwürmern von Hand zur Eingabe in Genomik, Proteomik, Mikrobiom oder anderen Assays.

Handdissektion von Caenorhabditis elegans Darm

Caenorhabditis elegans ist eine der wichtigsten Modellarten in der Biologie, aber fast alle Forschungen werden in Abwesenheit ihrer natürlich assoziierten Mikroben durchgeführt. Die hier beschriebenen Methoden werden dazu beitragen, die Vielfalt assoziierter Mikroben als Grundlage für zukünftige funktionelle C. elegans-Forschung besser zu verstehen.

Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans

Kompost-Mikrokosmen bringen die mikrobielle Vielfalt der Natur ins Labor, um die Mikrobiomforschung bei Caenorhabditis elegans zu erleichtern. Hier sind Protokolle für den Aufbau von Mikrokosmos-Experimenten, wobei die Experimente die Fähigkeit demonstrieren, die mikrobielle Vielfalt der Umwelt zu modulieren, um die Beziehungen zwischen der mikrobiellen Vielfalt der Umwelt und der Zusammensetzung des Mikrobioms des Wurmdarms zu untersuchen.

Kompostmikrokosmen als mikrobiell vielfältige, naturähnliche Umgebungen für die Mikrobiomforschung bei Caenorhabditis elegans

Hier stellen wir ein schnelles und einfaches ATAC-seq-Protokoll vor, das im L4-Stufen-Caenorhabditis elegans-Ganzwurm mit nur 30 μL Wurmpellet implementiert werden kann.

Chromatin-Barriereprofilierung bei ganzen L4-Larven von Caenorhabditis elegans

Lernen Sie eine schnelle Methode zur Extraktion genomischer DNA aus Caenorhabditis elegans für PCR-Anwendungen. Dieses robuste Protokoll eignet sich ideal für Forschung und Lehre.

Kleine Extraktion von Caenorhabditis elegans Genomischer DNA

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