Name: Fasertyp- und subzellspezifische Analyse des Lipidtröpfchengehalts in der Skelettmuskulatur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Erfahren Sie die fasertyp-spezifische Analyse von Lipidtröpfchen in der Skelettmuskulatur mit Bodipy-Färbung und Konfokalmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die automatisierte Quantifizierung und Untersuchung von Myosteatose.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) und der Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care) unterstützt.C.M.S. erhält ein Ph.D.-Stipendium der FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. erhielt ein Stipendium des Wallonie-Bruxelles International Excellence Program.
Die Autoren danken Alice Monnier für ihren Beitrag zur Entwicklung dieses Protokolls und Caroline Bouzin für ihre Expertise und technische Hilfe bei der Bildaufnahme. Wir danken auch der Bildgebungsplattform 2IP-IREC für den Zugang zum Kryostaten und den Mikroskopen (2IP-IREC Imaging Platform, Institute of Experimental and Clinical Research, Université Catholique de Louvain, 1200 Brüssel, Belgien). Abschließend möchten sich die Autoren bei Nicolas Dubuisson, Romain Versele und Michel Abou-Samra für ihre konstruktive Kritik am Manuskript bedanken. Einige der Figuren dieses Artikels wurden mit BioRender.com erstellt.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Quantifizierung von LDs, die mit Bodipy auf einer faser- und subzellularspezifischen Basis markiert sind. In den letzten Jahren wurden klassische Lipidfarbstoffe wie ORO oder Sudan Black B durch eine neue Reihe von zelldurchlässigen, lipophilen, fluoreszierenden Farbstoffen ersetzt, die an neutrale Lipide binden (z. B. Bodipy). Bodipy ist als verschiedene Konjugate erhältlich und hat sich als sehr effektiv bei der Markierung von LDs erwiesen, um ihre ...

Die Lipidinfiltration der Skelettmuskulatur, bekannt als Myosteatose, nimmt mit Fettleibigkeit und Alterung zu. Die Myosteatose korreliert negativ mit Muskelmasse und Kraft und mit der Insulinsensitivität1. Darüber hinaus deuten neuere Studien darauf hin, dass der Grad der Myosteatose als prognostischer Faktor für andere Erkrankungen wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen2, nicht-alkoholische Fettlebererkrankungen3 oder Krebs4 verwendet werden könnte. Lipide können sich in der Skelettmuskulatur zwischen Muskelfasern als extramyozelluläre Lipide oder innerhalb der Fasern, als intramyozelluläre Lipide (IMCLs), ansammeln. IMCLs werden überwiegend als Triglyceride in Lipidtröpfchen (LDs) gespeichert, die als Stoffwechselbrennstoff bei körperlicher Betätigung verwendet werden 5,6. Wenn jedoch das Lipidangebot die Nachfrage übersteigt oder wenn Mitochondrien dysfunktional werden, werden IMCLs an der Muskelinsulinresistenz beteiligt, wie sie bei metabolisch ungesunden, fettleibigen Personen und bei Typ-2-Diabetes-Patientenbeobachtet wird 7. Interessanterweise haben Ausdauersportler ähnliche, wenn nicht sogar höhere IMCLs-Spiegel wie bei adipösen Patienten mit Typ-2-Diabetes mellitus, während sie gleichzeitig eine hohe Insulinsensitivität beibehalten. Dieses Phänomen wird als "Athletenparadoxon"8,9 beschrieben und wird durch eine nuanciertere Bewertung der Muskel-LDs in Bezug auf ihre Größe, Dichte, Lokalisation, Dynamik und Zusammensetzung der Lipidspezies erklärt.
Erstens korreliert die LD-Größe umgekehrt mit der Insulinsensitivität und der körperlichen Fitness10,11. Tatsächlich weisen kleinere LDs eine relativ größere Oberfläche für die Lipasewirkung auf und haben daher möglicherweise eine größere Fähigkeit, Lipide zu mobilisieren12. Zweitens spielt die LD-Dichte (Anzahl/Oberfläche) eine umstrittene Rolle bei der Insulinwirkung 8,10; Dennoch scheint es bei Athleten erhöht zu sein. Drittens ist die subzelluläre Lokalisation von LDs wichtig, da LDs, die sich direkt unter der Oberflächenmembran (subsarkolemmal oder peripher) befinden, eine schädlichere Wirkung auf die Insulinsensitivität ausüben als zentrale 8,9,13. Letztere liefern Brennstoff für zentrale Mitochondrien, die eine größere Atmungsaktivität haben und spezialisierter sind, um den hohen Energiebedarf zu decken, der für die Kontraktionerforderlich ist 14. Im Gegensatz dazu liefern periphere LDs subsarkolämale Mitochondrien, die an membranbezogenen Prozessen beteiligt sind8. Schließlich können über Triglyceride hinaus spezifische komplexe Lipide im Muskel schädlicher sein als andere. Zum Beispiel können sich Diacylglycerin, langkettiges Acyl-CoA und Ceramide im Muskel ansammeln, wenn die Triglycerid-Umsatzrate niedrig ist, wodurch die Insulinsignalisierung 9,15 beeinträchtigt wird. Um auf das "Athletenparadoxon" zurückzukommen: Ausdauersportler haben eine hohe Anzahl kleinerer zentraler LDs mit erhöhten Fluktuationsraten in Typ I (oxidativen) Fasern, während adipöse und diabetische Patienten größere periphere LDs mit niedrigen Fluktuationsraten in Typ II (glykolytischen) Fasern haben 8,15,16. Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der Energiespeicherung und -freisetzung könnten LDs über abgeleitete Fettsäuren (FA) und ein Mantelprotein (Perilipin 5) auch als kritische Akteure fungieren, die an der transkriptionellen Regulation der FA-Oxidation und der mitochondrialen Biogenese beteiligt sind8. Aufgrund ihrer entscheidenden Implikationen in der Physiologie und Pathophysiologie sind eingehende Studien über die Dynamik und Funktionen von LDs gerechtfertigt.
Obwohl es mehrere Techniken gibt, um IMCLs zu untersuchen, sind sie nicht alle geeignet, LD-Größe, -Dichte und -Verteilung auf faserspezifische Weise genau zu quantifizieren. Zum Beispiel bietet die Bewertung von IMCLs durch Magnetresonanzspektroskopie zwar nicht-invasiv, bietet aber eine Auflösung, die nicht ausreicht, um die Größe und genaue Position von LDs innerhalb der Faser zu untersuchen, und sie ist nicht fasertypspezifisch17,18. Ebenso können biochemische Techniken, die an Ganzmuskelhomogenaten19 durchgeführt werden, die Lage und Größe von Lipiden nicht beurteilen. Folglich ist die am besten geeignete Methode zur Analyse der LD-Morphologie und -Ortung die quantitative elektronische Transmissionsmikroskopie13, aber diese Technik ist teuer und zeitaufwendig. Daher hat sich die konfokale Fluoreszenzbildgebung auf Präparaten mit Farbstoffen wie Oil Red O (ORO)20,21, Monodansylpentan (MDH)22 oder Bodipy23,24,25 als das beste Werkzeug für diese Studien herausgestellt.
Hier wird ein vollständiges Protokoll beschrieben, einschließlich Gewebeentnahme und -verarbeitung, Bodipy-Färbung und konfokaler Bildaufnahme und -analyse zur Quantifizierung der LD-Größe, -Anzahl und -Lokalisation in Mausmuskel-Kryosektionen. Da IMCLs nicht gleichmäßig auf oxidative und glykolytische Fasern verteilt sind und jeder Fasertyp die LD-Dynamik unterschiedlich reguliert, muss die Untersuchung von IMCLs fasertypspezifischsein 16,25,26,27. Daher verwendet dieses Protokoll Immunfluoreszenz auf seriellen Abschnitten, um Myosin Heavy Chain (MyHC) Isoform(en) zu identifizieren, die von jeder Faser exprimiert werden. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die gleichzeitige Verarbeitung eines glykolytischen (Extensor digitorum longus, EDL) und eines oxidativen (Soleus) Muskels, die vor dem Einfrieren nebeneinander angeordnet sind (Abbildung 1). Diese gleichzeitige Verarbeitung spart nicht nur Zeit, sondern vermeidet auch Variabilität durch die getrennte Verarbeitung der Proben.
<img alt="Protokollschema für das Einfrieren von Gewebe und Kryosektionen; Diagramm mit Immunhistochemie und Mikroskopie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63718/63718fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: Schematische Übersicht des Vorgehens. Nach der Muskeldissektion (1) werden ausgewählte Muskeln ähnlicher Größe vorbereitet und zusammen eingefroren (2). Serielle Querschnitte von 10 μm werden mit einem Kryostaten erhalten und direkt auf Adhäsionsobjektträgern montiert (3). Aus zwei seriellen Objektträgern ist der erste (4A) für Laminin immunmarkiert und mit Bodipy gefärbt, um LDs zu erkennen, und der zweite (4B) ist mit Antikörpern gegen MyHCs zur Erkennung von Muskelfasertypen immunresistent. Die Bilder werden mit einem konfokalen Mikroskop für Bodipy (5A) und einem Epifluoreszenzmikroskop für Muskelfasertypen (5B) aufgenommen. Die Bilder werden in Fidschi analysiert, indem ein Schwellenwert angewendet und Partikel (6A) quantifiziert werden, um die Anzahl, die durchschnittliche Größe, die Dichte und den Prozentsatz der Gesamtfläche zu erhalten, die von LDs (7) oder Zählzellen (6B) eingenommen wird, um den Prozentsatz der Fasern jedes Typs im Abschnitt (7) zu erhalten. Abkürzungen: LDs = Lipidtröpfchen; EDL = Extensor digitorum longus; MyHCs = Myosin-Schwerkettenisoformen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63718/63718fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam 506 mono 6 Mpix Kamera</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm 1.4MPix CCD Kamera&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemical Hood</td><td>Potteau Labo</td><td>EN-14175</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Korkscheiben (&oslash; 20 mm, 3 mm dick)&nbsp;</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences 63305</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-Handschuhe</td><td>Tempshield</td><td>16072252</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Microm Cryo Star HM 560</td><td></td></tr><tr><td>Präparier-Stereomikroskop SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trockeneis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzette</td><td>F.S.T</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Epifluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>AxioImage-Apotome Z1</td><td></td></tr><tr><td>Extra feine Bonner Schere</td><td>F.S.T</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand Einweg Basisformen (0,7 x 0,7 cm)</td><td>ThermoFisher</td><td>22-363-552</td><td>Wird verwendet, um ein Stück zu schneiden, um den Muskel auf dem Korken zum Einfrieren zu halten</td></tr><tr><td>Petrischale aus Glas (H 25&nbsp; mm, &oslash; 150&nbsp; mm)</td><td>MARKE Petrischale, MERK</td><td>BR455751</td><td>Wird verwendet, um die Muskeln während der Dissektion auf Eis zu legen</td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrophobe Barriere PAP</td><td>Pen Vector Labs</td><td>H-4000</td><td>Wird verwendet, um eine hidrophobische Barriere um die Muskelabschnitte</td></tr><tr><td>zu schaffen Inkubator</td><td>MMM Medcenter</td><td>Incucell 707&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckgläser (24x50 mm)</td><td>Assistent&nbsp;</td><td></td><td></td>40990151</tr><tr><td>Objektträgerboxen&nbsp;</td><td>Kartell</td><td>278</td><td>Wird als Feuchtkammer für die Immunhistochemie verwendet</td></tr><tr><td>Halshalter</td><td>Linie zwo</td><td>SB-035X-02</td><td>Wird als Riemen zum Halten des Edelstahlbechers</td></tr><tr><td>verwendet Nr. 15 Steriler Skalpell aus Kohlenstoffstahl</td><td>Klinge Swann-Morton</td><td>0205</td><td></td></tr><tr><td>Pinsel</td><td>Van Bleiswijck</td><td>Amazon B07W7KJQ2X</td><td>Wird zur Handhabung von Kryosektionen</td></tr> verwendet <tr><td>Permanent Marker Pen Schwarz</td><td>Klinipath/VWR</td><td>98307-R</td><td>Zur Beschriftung von Objektträgern</td></tr><tr><td>Pierce Fixation Pinzette</td><td>F.S.T</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol-Box&nbsp;</td><td></td><td></td><td>H 12 cm x L 25 cm x B 18 cm, wird als Behälter für flüssigen Stickstoff und zum Transport der Proben zum Kryostaten</td></tr> verwendet <tr><td>Skalpellgriff, 125 mm (5"), Nr. 3</td><td>Aesculap</td><td>BB073R</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahlbecher 10oz&nbsp;</td><td>Eboxer</td><td>B07GFCBPFH</td><td>Tumbler zum Befüllen mit Isopentene zum Einfrieren von Muskeln</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus Objektträger</td><td>ThermoFisher</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Pinzette 1/2 Zähne</td><td>Medizinischer Fachhandel</td><td>1303152</td><td>Auch "Rattenzahnpinzette" genanntVannas</td></tr> <tr><td>Federschere - 3 mm Schneide</td><td>F.S.T</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wägeschiffchen</td><td>VWR international</td><td>611-2249</td><td></td></tr><tr><td>Ganzobjektträger-Scanner für Fluoreszenz</td><td>Zeiss</td><td>Axio Scan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2b</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4600477</td><td>Wird bei einer Endkonzentration von 1:500</td></tr><tr><td>verwendet Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21121</td><td>Wird bei einer Endkonzentration von 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Ziege Anti-Maus</td><td>IgM Abcam</td><td>ab175702</td><td>Verwendet in einer Endkonzentration von 1:1.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Ziegen Anti-Ratten-IgG (H+L) Sekundärantikörper</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21247</td><td>Verwendet in einer Endkonzentration von 1:500</td></tr><tr><td>BODIPY-493/503 (4,4-Difluor-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3922</td><td>Bei einer Endkonzentration von 1 & Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluor-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacen-3-Dodecansäure)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3835</td><td>Verwendet in einer Endkonzentration von 1 & Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>Verwendet in einer Endkonzentration von 0,5 &μ; g/mL</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8418</td><td>Wird verwendet, um Bodipy für die 1 mg/mL Stammlösung zu lösen. <stark>VORSICHT</stark>: Giftig und brennbar. Dämpfe können zu Reizungen führen. Manipulieren Sie in einem Abzug. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit der Haut. Tragen Sie Gummihandschuhe und eine Schutzbrille.</td></tr><tr><td>Formaldehydlösung 4%, gepuffert, pH 6,9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1004969011</td><td>VORSICHT: Kann allergische Hautreaktionen hervorrufen. Im Verdacht, genetische Defekte zu verursachen. Kann Krebs verursachen. Manipulieren Sie in einem Abzug. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit der Haut. Tragen Sie Gummihandschuhe und eine Schutzbrille.</td></tr><tr><td>Isopentan GPR RectaPur</td><td>VWR international</td><td>24872.298<</td><td>strong>VORSICHT: Flüssigkeit und Dampf extrem entzündlich. Kann tödlich sein, wenn es verschluckt wird und in die Atemwege gelangt. Kann Schläfrigkeit oder Benommenheit verursachen. Wiederholter Kontakt kann zu Hauttrockenheit oder Rissbildung führen. Tragen Sie Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz.</td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff</td><td></td><td></td><td><stark>VORSICHT</stark>:&nbsp; Extrem kalt. Tragen Sie Handschuhe. Langsam handhaben, um Kochen und Spritzen zu minimieren, und in gut belüfteten Bereichen. Verwenden Sie Behälter, die für Flüssigkeiten mit niedriger Temperatur ausgelegt sind.</td></tr><tr><td>Maus auf Maus Blockierungsreagenz&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>MKB-2213-1</td><td>Verwendet in einer Konzentration von 1:30</td></tr><tr><td>Myosin-Schwerkette Typ I (BA-D5-s Primärer Antikörper) Gen: MYH7, monoklonale Rinder-Anti-Maus IgG2b</td><td>DSHB University of Iowa</td><td>BA-D5-Überstand</td><td>Verwendet in einer Endkonzentration von 1:10</td></tr><tr><td>Myosin-Schwerkette Typ IIA (SC-71-s Primärer Antikörper) Gen:&nbsp; MYH2, monoklonaler boviner Anti-Maus-IgG1</td><td>DSHB University of Iowa</td><td>SC-71-Überstand</td><td>Wird in einer Endkonzentration von 1:10</td></tr><tr><td>verwendet Myosin-Schwerkette Typ IIX (6H1-s Primärer Antikörper), Gen:&nbsp; MYH1, monoklonales Kaninchen Anti-Maus IgM</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank, University of Iowa</td><td>6H1-Überstand</td><td>Verwendet in einer Endkonzentration von 1:5</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum (NGS)</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>PBS 0,1 M</td><td></td><td></td><td>Häufig verwendet in Histologielabors</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Eindeckmittel</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Ratten-Anti-Laminin-2 (&alpha;-2-Kette) Primärantikörper (monoklonal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0663</td><td>Verwendet in einer Endkonzentration von 1:1.000</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Verbindung</td><td>Sakura&nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator CC</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>Wird verwendet, um die Figuren</td></tr><tr><td>zu gestalten: Adobe Photoshop</td>, <td>Adobe Inc.</td><td></td><td>Konfokale Software</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>https://biorender.com/</td><td></td> <td>Wird verwendet, um die Figuren</td></tr><tr><td>zu entwerfen Fiji/ImageJ</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td> <td>Wird verwendet, um die aufgenommenen Bilder zu analysieren</td></tr><tr><td>Microsoft PowerPoint</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Wird verwendet, um die Histologie des gesamten Muskels nach dem Scannen der Fasertypen zu rekonstruieren</td></tr><tr><td>Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Wird verwendet, um die Histologie des gesamten Muskels nach dem Scannen der Fasertypen zu rekonstruieren</td></tr></tbody></table>

fasertyp- und subzellspezifische analyse des lipidtröpfchengehalts in der skelettmuskulatur

Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle

Die Lipidinfiltration der Skelettmuskulatur, bekannt als Myosteatose, nimmt mit Fettleibigkeit und Alterung zu. Myosteatose wurde kürzlich auch als negativer prognostischer Faktor für mehrere andere Erkrankungen wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs entdeckt. Übermäßige Lipidinfiltration verringert die Muskelmasse und Kraft. Es führt auch zu Lipotoxizität und Insulinresistenz in Abhängigkeit vom gesamten intramyozellulären Lipidgehalt, der Lipidtröpfchenmorphologie (LD) und der subzellulären Verteilung. Der Fasertyp (oxidativ vs. glykolytisch) ist ebenfalls wichtig, da oxidative Fasern eine größere Kapazität zur Nutzung von Lipiden haben. Aufgrund ihrer entscheidenden Implikationen in der Pathophysiologie sind eingehende Studien zur LD-Dynamik und -Funktion in einer fasertypspezifischen Weise gerechtfertigt.
Hierin wird ein vollständiges Protokoll für die Quantifizierung des intramyozellulären Lipidgehalts und die Analyse der LD-Morphologie und der subzellulären Verteilung in einer fasertypspezifischen Weise vorgestellt. Dazu wurden serielle Muskelkryosektionen mit dem fluoreszierenden Farbstoff Bodipy und Antikörpern gegen Myosin-Schwerkettenisoformen angefärbt. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung verschiedener Muskeln, spart Zeit und vermeidet mögliche Artefakte und dank eines personalisierten Makros, das in Fidschi erstellt wurde, ist auch die Automatisierung der LD-Analyse möglich.

Das hierin beschriebene Protokoll bietet eine effiziente Methode zur einfachen Quantifizierung von LDs in einer faserartigen und subzellularspezifischen Weise. Es zeigt, wie durch das Einfrieren von zwei Muskeln ähnlicher Größe, wie dem EDL und dem Soleus, die Zeit und die Ressourcen, die für die folgenden Schritte aufgewendet werden, um die Hälfte reduziert werden.
Es wird ein vollständiges Protokoll für die Immunfärbung, Bildaufnahme und Analyse der verschiedenen MyHC-Isoformen bereitgestell...

Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass eine übermäßige Infiltration von Lipiden in der Skelettmuskulatur zu Lipotoxizität und Diabetes führt. Hier präsentieren wir ein vollständiges Protokoll, einschließlich Gewebeverarbeitung, Färbung mit Bodipy, Bildaufnahme und Analyse, um die Größe, Dichte und subzelluläre Verteilung von Lipidtröpfchen auf fasertypspezifische Weise zu quantifizieren.

Fasertyp- und subzellspezifische Analyse des Lipidtröpfchengehalts in der Skelettmuskulatur

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Quantifizierung von Lipidtröpfchen und die Analyse ihrer Morphologie und subzellulären Verteilung in einer fasertypspezifischen Weise. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung verschiedener Muskeln, spart Zeit und vermeidet Artefakte, die bei unabhängiger Verarbeitung auftreten könnten. Es ermöglicht auch die Automatisierung der Lipidtröpfchenquantifizierung.Myosteatose wurde in Meeresmuskeln beurteilt, aber dieses Protokoll konnte unter verschiedenen Bedingungen wie Fettleibigkeit, Altern und Krebs auf Menschen übertragen werden. Es könnte schwierig sein, die gleichen Fasern im parallelen Abschnitt zu erkennen, aber bemerkenswerte Strukturen wie Axonoptimierungen oder Muskelspindeln sind gute Orientierungspunkte, die dem Forscher helfen, die gleichen Fasern auf beiden Objektträgern zu lokalisieren. Legen Sie zunächst zwei serielle kryogefrorene Querschnitte der Muskelprobe auf zwei vorbeschriftete Adhäsionsobjektträger.Ein Objektträger zur Bestimmung der Fasertypen und der andere zur Quantifizierung des Lipidgehalts. Für den immunhistochemischen Nachweis des Muskelfasertyps umgeben Sie die Abschnitte mit einem Umriss, der mit einem hydrophoben Pen gezeichnet wurde. Legen Sie es in eine feuchte Kammer und spülen Sie es mit eiskalten 0,1 molaren PBS für eine Minute bei Raumtemperatur ab.Entfernen Sie als Nächstes den PBS, fügen Sie die blockierende Lösung zum Objektträger hinzu und inkubieren Sie 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie später die blockierende Lösung und inkubieren Sie die Objektträger für 90 Minuten bei 37 Grad Celsius mit der Lösung, die die primären Antikörper enthält. Waschen Sie die Dias dreimal mit PBS für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur.Fügen Sie die Lösung hinzu, die die sekundären Antikörper enthält, und inkubieren Sie die Objektträger im Dunkeln für eine Stunde bei Raumtemperatur, stellen Sie anschließend sicher, dass der Objektträger vom Licht ferngehalten wird, und fahren Sie mit den drei Wäschen in PBS für jeweils fünf Minuten fort, spülen Sie dann den Objektträger in doppelt destilliertem Wasser ab, nachdem Sie das überschüssige Wasser entfernt haben, montieren Sie den Objektträger mit Antifadenreagenz und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius, geschützt vor Licht. Um das Lipidtröpfchen mit Bodipy zu färben, umgeben Sie den Muskelabschnitt mit einem Umriss, der von einem hydrophoben Pen gezeichnet wird, bevor Sie ihn 10 Minuten lang mit eiskaltem 0,1 molaren PBS spülen. Beide Folien müssen gleichzeitig gebeizt werden.Fixieren Sie den Abschnitt mit kaltem vierprozentigem Paraformaldehyd ohne Methanol für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem ersten schnellen Spülen die Dias dreimal mit PBS für fünf Minuten waschen. Blockieren Sie den Objektträger mit 5% normalem Ziegenserum in PBS für eine Stunde in der menschlichen Kammer.Anschließend wird der Objektträger mit der Lösung des primären Antikörpers, bestehend aus 2% normalem Ziegenserum und Ratten-Antilaminin in PBS, für 90 Minuten inkubiert. Nachdem Sie die Objektträger dreimal in PBS gewaschen haben, führen Sie die nächste Inkubation mit der sekundären Antikörperlösung, die Ziege, Antiratte, Alexa Fluor 647-Antikörper in PBS enthält, bei Raumtemperatur für eine Stunde durch. Stellen Sie sicher, dass die Folie vor dem Licht geschützt ist.Nach der Inkubation den Objektträger dreimal mit PBS waschen. Als nächstes inkubieren Sie den Abschnitt für 20 Minuten mit dapi und bodipy Lösung. Nach einem schnellen Spülen dreimal mit PBS waschen und einmal mit doppelt destilliertem Wasser, dann entfernen Sie das überschüssige Wasser und montieren Sie den Abschnitt mit einem Anti-Fade-Reagenz.Sobald der Muskel gescannt ist, laden Sie die aufgenommenen digitalen Bilder zur Rekonstruktion in eine beliebige Bildverarbeitungssoftware hoch. Speichern Sie das Bild basierend auf der Fasermorphologie und der Histologie des Muskelabschnitts in einem geeigneten Format, in dem alle Kanäle zusammengeführt sind. Stellen Sie für die Beobachtung und Aufnahme von bodipy Bildern die Parameter für ein konfokales Mikroskop mit einer 40-fachen Öl-Tauchobjektivlinse und einer numerischen Blende von 1,4 ein, wie im Manuskript beschrieben.Um Übersprechen zwischen Bodipy und 558, 568 und Laminin Alexa Fluor 647 zu vermeiden; Verwenden Sie den sequentiellen Scanmodus der konfokalen Software. Excite Bodipy und 493, 503 mit der 488-Nanometer-Laserlinie oder Argon-Laserlinie und Anregung von Bodipy und 555, 568 mit der 561-Nanometer-Diodenlaserlinie. Schließlich erkennen Sie Laminin Alexa Fluor 647 mit einer 640-Nanometer-Diodenlaserlinie, je nach gewähltem Farbstoff, legen Sie die Emissionsraten auf 570 bis 650 Nanometer für Bodipy und 493, 503 fest.Und bei 565 bis 620 Nanometern für Bodipy und 558, 568. Legen Sie den Emissionsbereich für Laminin auf 656 bis 700 Nanometer fest. Stellen Sie als Nächstes die Verstärkung und die digitale Verstärkung entsprechend ein, um zu vermeiden, dass gesättigte Pixel auf der Bereichsanzeige erkannt werden.Korrigieren Sie das Hintergrundsignal, indem Sie den Versatz anpassen. Um die Art der Faser auf dem konfokalen Mikroskop zu identifizieren, verwenden Sie einen Laptop, auf dem das Bild des zuvor rekonstruierten Objektträgers mit der Fasertyp-Immundetektion überprüft werden kann. Sobald eine Gruppe von Fasern korrekt identifiziert ist, erfassen Sie das Bild mit den Bodipy- und Laminin-Kanälen.Öffnen Sie jedes Bild mit Hilfe des Importeurs des Bioformats aus Fidschi. Wählen Sie unter dem Ansichtsstapel mit Option Hyperstapel, dann Farbmodus und Standard. Stellen Sie sicher, dass das Fenster Automatische Skalierung ausgewählt ist.Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug für freie Hand, um das Sarkolemma der Faser basierend auf dem Lamininkanal manuell auszuwählen. Drücken Sie T auf der Tastatur, um den interessierenden Bereich im ROI-Fenster aufzuzeichnen. Gehen Sie zum Hauptfenster von Fidschi und klicken Sie auf Analysieren und Messungen einstellen.Wählen Sie dann im Popup-Fenster den Bereich aus, und lassen Sie für den erhöhten Durchmesser die verbleibenden Kontrollkästchen deaktiviert und andere Parameter so, wie sie standardmäßig angezeigt werden. Klicken Sie im ROI-Fenster auf Messen, um den Bereich und das Minimum für den erhöhten Durchmesser der ausgewählten Faser zu erhalten, und notieren Sie sie für die spätere Verwendung. Berechnen Sie den Wert von einem Sechstel des minimal für den erhöhten Durchmesser, um den zentralen Teil der Faser abzugrenzen.Klicken Sie auf das ROI-Fenster, klicken Sie auf Hinzufügen, um ein Duplikat des ersten ROI zu erhalten, und wählen Sie den zweiten ROI aus, der im Fenster angezeigt wird. Klicken Sie im Hauptfenster von Fidschi auf Bearbeiten, dann auf Auswählen und Vergrößern. Um den zuvor berechneten Wert mit einem Minuszeichen vor der Zahl einzugeben und klicken Sie auf okay.Klicken Sie im ROI-Fenster auf Hinzufügen, Ein dritter ROI muss angezeigt werden, und löschen, um den zweiten ROI zu löschen. Wählen Sie im ROI-Fenster beide ROIs aus und klicken Sie auf mehr als ZOR und hinzufügen, warten Sie, bis ein dritter ROI angezeigt wird, der der Peripherie der Faser entspricht. Wenn eine erneute Analyse der gleichen Fasern erforderlich ist, speichern Sie die ROIs, indem Sie auf Mehr klicken und dann speichern.Wählen Sie den bodipy-Kanal aus und öffnen Sie das Schwellenwertwerkzeug, indem Sie im Hauptfenster von Fidschi auf die Registerkarten Bild, Anpassung und Schwellenwert klicken. Stellen Sie im Schwellenwert-Popup-Fenster die Werte auf 70 und 255 ein. Wählen Sie dann YEN und Schwarz-Weiß-Methode.Bevor Sie auf dunklen Hintergrund klicken. Klicken Sie abschließend auf die Registerkarte Anwenden. Gehen Sie zum Hauptfenster von Fidschi und klicken Sie auf Analysieren und Messungen einstellen.Wählen Sie im Popup-Fenster Bereich, Flächenanteil und Schwellenwert begrenzen aus. Lassen Sie die verbleibenden Felder und Parameter als Standard. Gehen Sie zum ROI-Fenster und wählen Sie den ersten ROI aus.Klicken Sie im Hauptfenster von Fidschi auf das Werkzeug Analysieren und dann auf das Werkzeug Partikel analysieren. Stellen Sie im Fenster Analysierte Partikel die Werte von zwei auf unendlich ein und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Pixel. Behalten Sie den Standardwert für die Zirkularität bei, und wählen Sie Zusammenfassen aus, bevor Sie auf OK klicken.Um die Werte des Mittelpunkts und der Peripherie der Faser zu erhalten, wiederholen Sie jedes Mal die Auswahl des zweiten und dritten ROI. Speichern Sie dann die Ergebnisse, indem Sie auf Datei klicken, und speichern Sie dann im Zusammenfassungsfenster unter. Geben Sie den Typ der Verbindungslinie in den Namen der Datei ein.Dieses immunhistochemische Protokoll ermöglicht die Erkennung von Mäusen, langsamen oxidativen Fasern wie Typ 1 und 2A, schnellen glykolytischen Fasern wie Typ 2X und 2B und dem Vorhandensein von Hybridfasern. Durch die Messung der Fläche und des minimal für den erhöhten Durchmesser der Muskelfaser wurde eine größenabhängige Reduktion angewendet, um die zentralen und peripheren Bereiche jeder Faser zu erhalten. Bemerkenswerte Strukturen jedes Muskelabschnitts, wie Axonzweige oder Muskelspindeln, sind gute Landmarken, die helfen könnten, die gleichen Fasern auf beiden Seiten zu lokalisieren.Die beschriebenen Einstellungen für die Aufnahme von bodipy Laminin Färbung durch konfokale Mikroskopie. Erlaubt ist die Visualisierung und Analyse der Größe, Anzahl und Verteilung von Lipidtröpfchen von drei bis sechs Fasern gleichzeitig. Die Methode ermöglichte auch die Quantifizierung von drei wichtigen Parametern, nämlich dem Prozentsatz der Faserfläche, die von den Lipidtröpfchen besetzt ist, der Dichte und der durchschnittlichen Größe der Lipidtröpfchen.Unsachgemäßes Einfrieren und das Versäumnis, die richtige Temperatur von Isopentan zu erreichen, führten zu einer Eiskristallbildung in den Muskelfasern. Wenn die Abschnitte nicht quer ausgerichtet waren, konnte die Lipidtröpfchenquantifizierung und der Vergleich zwischen Fasern, Muskeln oder Tieren nicht durchgeführt werden. Die Bearbeitung der zweiten Folie muss gleichzeitig mit der ersten erfolgen.Wenn Sie den Objektträger nach der Kryosektion für 15 Minuten an der Luft trocknen, wird die Größe und Anzahl der Lipidtröpfchen erheblich reduziert. Bodipy kann verwendet werden, um die Wechselwirkung von Lipidtröpfchen mit anderen subzellulären Organellen oder Proteinstapeln mit Fluoreszenz eines anderen Spektrums oder mit gentechnisch veränderten GFP-Modellen zu untersuchen. Es wurde berichtet, dass Myosteatose ein schlechter prognostischer Faktor für mehrere Krankheiten ist.Daher könnte diese Technik verwendet werden, um das Fortschreiten einer Krankheit zu überwachen oder die Wirkung einer Behandlung zu bewerten.

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In diesem Video demonstrieren wir die Probenvorbereitung von menschlichem Skelettmuskelgewebe und dessen Färbung für die Transmissionselektronenmikroskopie, um die subzelluläre Glykogenverteilung zu visualisieren und zu quantifizieren.

Transmissionselektronenmikroskopie zur Quantifizierung der Glykogenverteilung in der menschlichen Skelettmuskulatur

Die wichtigsten adhärenten Zelltypen, die aus dem menschlichen Muskel stammen, sind myogene Zellen und Fibroblasten. Hierbei werden Zellpopulationen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung auf Basis des CD56-Antigens angereichert. Die anschließende Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern und der Einsatz von Bildanalysetechniken ermöglicht die Quantifizierung der zytoplasmatischen und nukleären Eigenschaften in einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

Lipidtröpfchen sind wichtige Organellen für die Replikation von mehreren Erregern, einschließlich der Hepatitis C-Virus (HCV). Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Lipidtröpfchen-Massenspektrometrie assoziierter Proteine ​​zu isolieren; es kann unter einer Vielzahl von Bedingungen, wie zum Beispiel Virusinfektion, Umweltstress, oder medikamentöse Behandlung verwendet werden.

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Immunhistochemische Färbung des Myosin schwere Kette Isoformen als State-of-the-Art-Diskriminator des skelettartigen Muskels Fasertyp entstanden (d.h., Typ I, Typ IIA, Typ IIX, Typ IIB). Hier präsentieren wir Ihnen eine Färbung Protokoll sowie eine neuartige semi-automatischen Algorithmus, der erleichtert die schnelle Beurteilung der Fasertyp und Faser Morphologie.

Semi-automatische Analyse von Maus Skelettmuskulatur Morphologie und Fasertyp Zusammensetzung

Ein modifiziertes Postfixationsverfahren erhöht den Kontrast von Glykogenpartikeln im Gewebe. Dieses Papier bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, das beschreibt, wie man mit dem Gewebe umgeht, die Bildgebung durchführt und sterelorische Methoden verwendet, um unvoreingenommene und quantitative Daten über die fasertypspezifische subzelluläre Glykogenverteilung in der Skelettmuskulatur zu erhalten.

Quantifizierung der subzellulären Glykogenverteilung in Skelettmuskelfasern mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Die auf Schrotflinten-Massenspektrometrie basierende Lipidomik liefert eine empfindliche quantitative Momentaufnahme eines breiten Spektrums von Lipidklassen gleichzeitig in einer einzigen Messung aus verschiedenen Nagetiergeweben.

Schrotflinten-Lipidomik von Nagetiergewebe

Der Ersatz von gesundem Muskelgewebe durch intramuskuläres Fett ist ein herausragendes Merkmal menschlicher Krankheiten und Zustände. Dieses Protokoll beschreibt, wie intramuskuläres Fett visualisiert, abgebildet und quantifiziert werden kann, und ermöglicht die rigorose Untersuchung der Mechanismen, die der intramuskulären Fettbildung zugrunde liegen.

Ein Leitfaden zur Untersuchung der intramuskulären Fettbildung und ihres zellulären Ursprungs in der Skelettmuskulatur

In dieser Arbeit demonstrieren wir ein optimiertes BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basiertes Protokoll zur Charakterisierung von Lipidtröpfchen in Lebergewebe. Durch die Verwendung von orthogonalen Projektionen und 3D-Rekonstruktionen ermöglicht der Fluorophor eine erfolgreiche Unterscheidung zwischen mikrovesikulärer und makrovesikulärer Steatose und kann einen komplementären Ansatz zu den klassischen histologischen Protokollen zur Beurteilung der hepatischen Steatose darstellen.

Analyse fluoreszenzgefärbter Lipidtröpfchen mit 3D-Rekonstruktion zur Beurteilung der Lebersteatose

Die vorliegende Studie beschreibt dezellularisierungsbasierte Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung der Ablagerung von intramuskulärem Fettgewebe (IMAT) durch intaktes Muskelvolumen sowie zur Quantifizierung von Metriken einzelner Adipozyten, aus denen IMAT besteht.

Dezellularisierungsbasierte Quantifizierung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur

Dieses Protokoll demonstriert die Einzelfaserisolierung aus gefriergetrocknetem menschlichem Skelettmuskel und die Klassifizierung von Fasertypen gemäß der Myosin-Schwerketten-Isoform (MHC) unter Verwendung der Dot-Blotting-Technik. Identifizierte MHC I- und II-Faserproben können dann mittels Western Blot weiter auf fasertypspezifische Unterschiede in der Proteinexpression analysiert werden.

Identifizierung des Fasertyps der menschlichen Skelettmuskulatur

Wir beschreiben ein Protokoll zur Gewinnung enzymatisch dissoziierter Fasern unterschiedlicher Länge und Art aus sechs Muskeln erwachsener Mäuse: drei davon bereits beschrieben (Flexor digitorum brevis, Extensor digitorum longus, soleus) und drei von ihnen erstmals erfolgreich dissoziiert (Extensor hallucis longus, Peroneus longus, Peroneus digiti quarti).

Intakte kurze, mittlere und lange Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden: Jenseits des Flexor Digitorum brevis

Erfahren Sie die fasertyp-spezifische Analyse von Lipidtröpfchen in der Skelettmuskulatur mit Bodipy-Färbung und Konfokalmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die automatisierte Quantifizierung und Untersuchung von Myosteatose.

Fasertyp- und subzellspezifische Analyse des Lipidtröpfchengehalts in der Skelettmuskulatur

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