Name: Identifizierung von RNA-Fragmenten aus dem enzymatischen Abbau mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Lernen Sie die Charakterisierung von RNA-Fragmenten aus enzymatischem Abbau mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Analysen mit geringem Materialbedarf für biochemische Studien.

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Es ist wichtig zu beachten, dass diese Arbeit eine gemeinsame Anstrengung zwischen drei Institutionen, zwei Forschungsgruppen und einer Kerneinrichtung war. Die Verteilung und der Arbeitsaufwand wurden wie folgt durchgeführt: Die Proteinexpression (Xrn-1) wurde an der Universität von Denver (Denver, CO) durchgeführt. Oligonukleotidsynthese, Quantifizierung und Experimente (hauptsächlich enzymatischer Abbau) wurden an der University of Colorado Denver (Denver, CO) durchgeführt. Dort wurde auch eine Optimierung durchgeführt. MALDI-TOF-Spotting, Akquisition und Analyse wurden in der Analytical Resources Core Facility der Colorado State University durchgeführt. (Fort Collins, CO). SS möchte einen UROP Award (CU Denver) und Eureca Grants (CU Denver) für die Unterstützung anerkennen. E. G.C. bestätigt die Unterstützung von NIGMS über R00GM115757. MJER dankt der Unterstützung von NIGMS über 1R15GM132816. K.B. bestätigt die Ressourcen-ID: SCR_021758. Die Arbeit wurde auch durch einen Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, der Henry Dreyfus Foundation unterstützt.

<ol><li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+polymer+analyses+up+to+m%2Fz+100+000+by+laser+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).</li>
<li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10%2C000+daltons%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).</li>
<li>Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+nobel+prize+2002+goes+to+analytical+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia%22%5BJournal%5D)">Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry.</a> Chimia. 57, 73(2003).</li>
<li>Aristri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-based+polyurethane+resins+derived+from+tannin%3A+Source%2C+synthesis%2C+characterization%2C+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Forests%22%5BJournal%5D)">Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application.</a> Forests. 12 (11), 1516(2021).</li>
<li>Pedrazzani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-n-Alkylresorcinol+profiles+in+different+cultivars+of+einkorn%2C+emmer+spelt%2C+common+wheat%2C+and+tritordeum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).</li>
<li>Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+cell+assays+to+determine+compound+uptake+or+drug+action+using+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).</li>
<li>Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).</li>
<li>Kaufmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrix-assisted+laser+desorption+ionization+%28MALDI%29+mass+spectrometry%3A+a+novel+analytical+tool+in+molecular+biology+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology.</a> Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).</li>
<li>Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-Oxo-7%2C8-dihydroguanosine+inhibits+or+changes+the+selectivity+of+the+theophylline+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer.</a> ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).</li>
<li>Chapman, E. G., DeRose, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+processing+of+platinated+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Enzymatic processing of platinated RNAs.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).</li>
<li>Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+strand+scission+in+double+stranded+RNA+via+a+C5-pyrimidine+radical%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).</li>
<li>Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+RNA+cleavage+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), 2(2013).</li>
<li>Ghodke, P. P., Guengerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+%CE%B7+and+%CE%BA+bypass+N2-guanine-O6-alkylguanine+DNA+alkyltransferase+cross-linked+DNA+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124(2021).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2021).</li>
<li>Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+rare+bacterial+pathogens+by+16S+rRNA+gene+sequencing+and+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176(2016).</li>
<li>Su, K. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proofreading+and+DNA+repair+assay+using+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862(2018).</li>
<li>Fagerquist, C. K., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antibacterial+immunity+proteins+in+Escherichia+coli+using+MALDI-TOF-TOF-MS%2FMS+and+Top-Down+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577(2021).</li>
<li>Phillips, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+RNA+containing+8-Oxo-7%2C8-dihydroguanosine+%288-oxoG%29+by+the+exoribonuclease+Xrn-1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315(2021).</li>
<li>Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+solid-phase+synthesis+of+oligomers+of+RNA+containing+a+2%27-O-thiophenylmethyl+modification+and+characterization+via+circular+dichroism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189(2017).</li>
<li>Langeberg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+yeast+Xrn1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of yeast Xrn1.</a> Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).</li>
<li>Stevens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+Saccharomyces+cerevisiae+exoribonuclease+which+yields+5%27-mononucleotides+by+a+5%27+leads+to+3%27+mode+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).</li>
<li>Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+and+alkylation+stresses+activate+ribosome-quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control.</a> Nature Communications. 10 (1), 5611(2019).</li>
<li>Fasnacht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+23S+rRNA+modification+ho5C2501+benefits+Escherichia+coli+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).</li>
<li>Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+to+RNA+is+altered+by+the+presence+of+interacting+proteins+or+modified+nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149(2021).</li>
<li>Tomar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+modulates+the+efficiency+of+NEIL1-catalyzed+excision+of+the+aflatoxin+B1-induced+formamidopyrimidine+guanine+adduct%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct.</a> Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).</li>
<li>Gaffney, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+env-dependent+cell+killing+by+bifunctional+small-molecule%2Fpeptide+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).</li>
<li>Sikorski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+display+of+a+chemoattractant+agonist+on+cancer+cells+activates+the+formyl+peptide+receptor+1+on+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells.</a> ChemBioChem. , 202100521(2022).</li>
<li>Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sixteen+different+types+of+lipid-conjugated+siRNAs+containing+saturated+and+unsaturated+fatty+Acids+and+exhibiting+enhanced+RNAi+potency%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die größte Herausforderung in diesem Arbeitsablauf bestand zwischen dem Abschluss der Experimente und der Durchführung der massenspektrometrischen Analysen. Die Experimente wurden an der University of Colorado Denver durchgeführt und abgeschlossen und (über Nacht) an die Einrichtungen der Colorado State University verschifft. Die Datenerfassung erfolgte nach Erhalt nach Bequemlichkeit. Mehrere unerwartete Umstände führten zu Zeitverzögerungen im Prozess. In einem Fall erforderten unerwartete Fehlfunktionen des Instrument...

MALDI-TOF 1,2,3 ist eine weit verbreitete Technik zur Charakterisierung und/oder Detektion von Molekülen unterschiedlicher Größe und Eigenschaften. Einige seiner Anwendungen umfassen verschiedene Anwendungen wie den Nachweis von Tanninen aus natürlichen Ressourcen4, die Bildgebung von Metaboliten in Lebensmitteln5, die Entdeckung oder Überwachung von zellulären Wirkstoffzielen oder Markern6 und die klinische Diagnostik7, um nur einige zu nennen. Von Relevanz für die vorliegende Arbeit ist die Verwendung von MALDI-TOF mit DNA oder RNA, wobei seine Verwendung auf Oligonukleotiden auf über drei Jahrzehnte zurückgeht8, wo mehrere Einschränkungen festgestellt wurden. Diese Technik hat sich nun zu einem zuverlässigen, häufig verwendeten Mittel entwickelt, um sowohlBiopolymere 9 zu charakterisieren als auch chemische und biochemische Reaktionen zu identifizieren/verstehen, z. B. die Charakterisierung platinierter Stellen in RNA10, die Identifizierung von RNA-Fragmenten nach der Strangspaltung 11,12 oder die Bildung von Protein-DNA-Querverbindungen 13 . Daher ist es wertvoll, wichtige Aspekte der Verwendung dieser Technik zu veranschaulichen und hervorzuheben. Die Grundlagen von MALDI-TOF wurden auch im Videoformat14 beschrieben und werden hier nicht weiter ausgeführt. Darüber hinaus wurde seine Anwendung in einem DNA- oder Proteinkontext zuvor in dem genannten Format15,16,17 beschrieben und veranschaulicht.
Das Protokoll zum Nachweis von RNA-Fragmenten, die nach enzymatischer Hydrolyse gebildet werden, wird hierin berichtet. Das experimentelle Modell wurde auf der Grundlage eines kürzlich von unserer Gruppe18 veröffentlichten Ergebnisses ausgewählt, bei dem MALDI-TOF verwendet wurde, um die einzigartige Reaktivität zwischen der Exoribonuklease Xrn-1 und Oligonukleotiden von RNA zu bestimmen, die die oxidative Läsion 8-OxoG enthalten. Die 20-Nukleotid-Langstränge wurden durch Festphasensynthese19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] und [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] erhalten, während Xrn-1 nach dem zuvor beschriebenen Bericht20 exprimiert und gereinigt wurde. Kurz gesagt, Xrn-121 ist eine 5'-3'-Exoribonuklease mit verschiedenen biologischen Schlüsselrollen, die mehrere Arten von RNA, einschließlich oxidierter RNA22, abbauen. Es wurde festgestellt, dass die Prozessivität des Enzyms bei der Begegnung mit 8-OxoG zum Stillstand kommt, was zu RNA-Fragmenten führte, die 5'-phosphorylierte Enden [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] und [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18 enthielten.
Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass die Massenspektrometrie eine leistungsfähige Methode ist, die durch verschiedene Methoden an andere Zwecke angepasst werden kann23,24; Daher ist die Wahl der richtigen Ionisationsmethode sowie anderer Versuchsaufbauten von größter Bedeutung.

<table><tbody><tr><td>0,6 mL MCT Graduiertes Violett</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-127</td><td></td></tr><tr><td>6'-Trihydroxyacetophenon-Monohydrat 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril 99,9%, HPLC-Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Adenosintriphosphat, 10 mM</td><td>New Englang Bioscience</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumcitrat, zweibasisch 98% </td><td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumfluorid 98,0 %, ACS-Qualität</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Bakterienteststandard</td><td>Bruker Daltonics</td><td>8255343</td><td></td></tr><tr><td>Kommerzielle Quelle für Xrn-1</td><td>New England BioLabs</td><td>M0338S</td><td></td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonat, 97 %</td> <td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>Flex-Analyse Software</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>FlexAnalysis Software Version 3.4, Bruker Daltonics</td></tr><tr><td>Lambda 365 UV-Vis-Spektralphotometer</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI Platte: MSP 96 geschliffenes Stahltarget</td><td>Bruker Daltonics</td><td>280799</td><td></td></tr><tr><td>Massenspektrometer</td><td>Bruker</td><td></td><td>Microflex LRFTOF Massenspektrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)</td></tr><tr><td>Mili-Q IQ 7000</td><td>Milipore Sigma</td><td></td><td>A Mili-Q System wurde verwendet, um das gesamte in dieser Arbeit verwendete Wasser zu reinigen</td></tr><tr><td>Nanosep Zentrifugalgeräte mit OmegaTM Membran 10 K, blau (24/Packung)</td><td>Pall Corporation</td><td>OD010C33</td><td>Filtermedien, Omega (modifiziertes Polyethersulfon) 10 K Porengröße</td></tr><tr><td>NEBuffer 3</td><td>New England Biolabs</td><td>B7003S</td><td>Dies ist Lösung B</td></tr><tr><td>Oligo Analyzer Tool</td><td>IDT-DNA</td><td></td><td>https://www.idtdna.com/calc/analyzer</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen P10</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-441</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen P200</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-419</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynukleotidkinase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynukleotidkinase Reaktionspuffer</td><td>Neu England BioLabs</td><td>B0201S</td><td>Dies ist die Lösung A</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>Xrn-1 Exoribonuklease</td><td>Im Haus exprimiert</td><td>Siehe Ref. 20</td><td></td></tr><tr><td>ZipTip Pipettenspitzen für die Probenvorbereitung</td><td>Millipore</td><td>ZTC 18S 096</td><td>10 &micro; L-Pipettenspitzen mit einem C18-Standard 0,6 & Mikro; L-Bett</td></tr></tbody></table>

identifizierung von rna-fragmenten aus dem enzymatischen abbau mittels maldi-tof-massenspektrometrie

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

RNA ist ein Biopolymer, das in allen Bereichen des Lebens vorkommt, und seine Wechselwirkungen mit anderen Molekülen und/oder reaktiven Spezies, z. B. DNA, Proteinen, Ionen, Medikamenten und freien Radikalen, sind allgegenwärtig. Infolgedessen durchläuft RNA verschiedene Reaktionen, einschließlich ihrer Spaltung, ihres Abbaus oder ihrer Modifikation, was zu biologisch relevanten Spezies mit unterschiedlichen Funktionen und Implikationen führt. Ein Beispiel ist die Oxidation von Guanin zu 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG), die in Gegenwart von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) auftreten kann. Insgesamt sind Verfahren, die solche Produkte und Transformationen charakterisieren, für die wissenschaftliche Gemeinschaft weitgehend wertvoll. Zu diesem Zweck ist die matrixgestützte Laserdesorptionsionisations-Time-of-Flight-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) eine weit verbreitete Methode. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie RNA-Fragmente, die nach enzymatischer Behandlung gebildet werden, charakterisiert werden können. Das gewählte Modell verwendet eine Reaktion zwischen RNA und der Exoribonuklease Xrn-1, bei der die enzymatische Verdauung an oxidierten Stellen gestoppt wird. Zwei 20-Nukleotid lange RNA-Sequenzen [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] und [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] wurden durch Festphasensynthese erhalten, quantifiziert durch UV-Vis-Spektroskopie und charakterisiert durch MALDI-TOF. Die erhaltenen Stränge wurden dann (1) 5'-phosphoryliert und mittels MALDI-TOF charakterisiert; (2) mit Xrn-1 behandelt; (3) gefiltert und entsalzt; (4) analysiert über MALDI-TOF. Dieser Versuchsaufbau führte zur eindeutigen Identifizierung der Fragmente, die mit dem Abwürgen von Xrn-1 verbunden sind: [5'-H2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] und [5'-H2 PO 4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Die beschriebenen Experimente wurden mit 200 Picomolen RNA (20 pmol für MALDI-Analysen) durchgeführt; Geringere Mengen können jedoch zu nachweisbaren Spitzen mit Spektrometern führen, die Laserquellen mit mehr Leistung als die in dieser Arbeit verwendete verwenden. Wichtig ist, dass die beschriebene Methodik verallgemeinert und möglicherweise auf die Produktidentifizierung für andere Prozesse mit RNA und DNA ausgedehnt werden kann und bei der Charakterisierung / Aufklärung anderer biochemischer Signalwege helfen kann.

Die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide wurden vor der Verwendung synthetisiert, charakterisiert und quantifiziert. Die Konzentration aller Oligonukleotide wurde mittels UV-Vis-Spektroskopie bei 90 °C bestimmt, um fehlerhafte Messwerte zu vermeiden, die sich aus der möglichen Bildung der Sekundärstrukturen ergeben. Abbildung 3 zeigt die Spektren der in dieser Arbeit verwendeten Modelloligonukleotide der RNA, die bei Raumtemperatur und nach Anwendung von Wärme aufgenommen wu...

MALDI-TOF wurde verwendet, um Fragmente zu charakterisieren, die aus der Reaktivität zwischen oxidierter RNA und der Exoribonuklease Xrn-1 erhalten wurden. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methodik, die auf andere Prozesse mit RNA und/oder DNA angewendet werden kann.

Identifizierung von RNA-Fragmenten aus dem enzymatischen Abbau mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

Die Massenspektrometrie ist für verschiedene Anwendungen weit verbreitet. Die Methodik in diesem Artikel bietet die eindeutige Charakterisierung von RNA-Fragmenten, die aus einem enzymatischen In-vitro-Prozess gewonnen wurden. Zu den Vorteilen dieser Technik gehört, dass das Molekül Eisenpeak erhalten wird, dass die Experimente mit kleinen Materialmengen für In-vitro-Anwendungen durchgeführt werden können und dass das Protokoll mit minimalem Training durchgeführt werden kann.Die beschriebene Methodik kann weitgehend auf die Untersuchung von Prozessen mit DNA, RNA oder Proteinen angewendet werden. Beispiele hierfür sind biochemische Umwandlungen wie Kreuzinformation, Identifizierung chemischer Modifikationen oder andere Biopolymerwechselwirkungen und -reaktivitäten. Eine Schwierigkeit kann sich aus der Zugänglichkeit zu einem MALDI-Spektrometer oder Kerneinrichtungen ergeben, die diesen Service anbieten.Ein weiterer Aspekt ist die Festlegung der Nachweisgrenze, die je nach Gerät höher oder niedriger sein kann. Schalten Sie zunächst das UV-Vis-Spektralphotometer ein und klicken Sie dann auf das PerkinElmer UV WinLab-Symbol, um das Fenster zur Steuerung der Gerätebedienung zu öffnen. Schalten Sie das Spektralphotometer des Peltier-Temperaturreglers mit dem Schalter rechts des Instruments ein und klicken Sie auf Scan-Lambda 365, das unter Basismethoden angezeigt wird.Ein weiterer Bildschirm wird geöffnet und der Benutzer wird aufgefordert, sicherzustellen, dass die Zellenhalter leer sind. Klicken Sie auf OK und lassen Sie das Gerät seine Systemprüfungen durchführen. Passen Sie nun die Scanparameter an, indem Sie Datenerfassung auswählen.Ändern Sie im neuen Fenster unter Scaneinstellungen den Anfang auf 350 Nanometer und das Ende auf 215 Nanometer. Aktivieren Sie den Peltier, indem Sie das Plus links neben dem Zubehör auswählen. Klicken Sie dann auf Multiple Cell Peltier, ändern Sie die Temperatur Grad Celsius auf 25 und klicken Sie auf Peltier On.Navigieren Sie zur Registerkarte Probeninfo und geben Sie die Anzahl der gewünschten Proben, Namen und Zellpositionen ein.Klicken Sie auf AutoNull und legen Sie die Küvette ein, die die Hintergrundlösung enthält. Klicken Sie auf Start und setzen Sie die Küvette in die gewünschte Zelle ein und stellen Sie sicher, dass das Küvettenfenster parallel zur Vorderseite des Instruments ausgerichtet ist. Klicken Sie nun auf OK, um den ersten Scan bei 25 Grad Celsius zu starten.Für Messungen bei höheren Temperaturen klicken Sie auf Multiple Cell Peltier, ändern Sie die Temperatur auf die gewünschte Probentemperatur und wiederholen Sie das Scannen. Klicken Sie auf Datei, Exportieren und wählen Sie den gewünschten Dateispeicherort und wählen Sie XY-Daten, um eine Textdatei zu erhalten. Um eine 5'Phosphorylierung von RNA durchzuführen, bereiten Sie eine Lösung in einem 0,6-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor, indem Sie 33,5 Mikroliter RNase-freies Wasser, fünf Mikroliter Lösung A, sechs Mikroliter 10 millimolar Adenosintriphosphat, einen Mikrolite von 200 mikromolaren RNA-wässrigen Lösungen und 4,5 Mikroliter Polynukleotidkinase hinzufügen und die Lösung vorsichtig mischen.Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten, indem Sie es in ein Wasserbad geben. Dann inaktivieren Sie das Enzym, indem Sie das Reaktionsrohr in einen Wärmeblock legen, der bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten vorgewärmt wird. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, um eine endgültige 5'phosphorylierte RNA-Lösung zu erhalten.Verwenden Sie nach der Inkubation 50 Mikroliter dieser Lösung, fügen Sie fünf Mikroliter Lösung B und fünf Mikroliter 1-Femtomollösung von Xrn-1 hinzu, um eine RNA-Hydrolyse durchzuführen. Inkubieren Sie das Reaktionsrohr bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Übertragen Sie diese Reaktionsmischung auf ein porengroßes 10-Kilodalton-Zentrifugalgerät und filtern Sie die Enzyme durch Zentrifugieren für 10 Minuten bei 700 mal G.Geben Sie das Filtrat in ein 0,6-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Dann fügen Sie 20 Mikroliter RNase-freies Wasser hinzu, um die restliche RNA auf dem Zentrifugalröhrchen zu waschen, gefolgt von einer Zentrifugation. Kombinieren Sie schließlich dieses Filtrat mit dem resultierenden Filtrat, das zuvor durch Zentrifugation in einer porengroßen 10-Kilodalton-Zentrifugalvorrichtung erhalten wurde, und frieren Sie die Lösung bei null Grad Celsius ein oder versenden Sie sie zur Analyse. Um die Probe zu entsalzen und zu konzentrieren, verwenden Sie handelsübliche C18-Pipettenspitzen für den Kationenaustausch, die an ihrem Ende mit einem Bett aus C18-Chromatographiemedien beladen sind.Positionieren Sie dazu die 10-Mikroliter-Pipettenspitze auf einer 10-Mikroliter-Pipette und waschen Sie diese Spitze zweimal mit 50% wässriger Acetylnitrillösung. Entsorgen Sie die verbrauchten Volumina jedes Mal in ein separates Abfallröhrchen und gleichen Sie die C18-Spitze zweimal mit 10 Mikrolitern 0,1% wässriger Trifluoressigsäurelösung aus. Entfernen Sie die C18-Spitze manuell aus der Pipette und befestigen Sie sie auf einer 200-Mikroliter-Pipette mit einer P200-Pipettenspitze.Dann tauchen Sie die C18-Spitze in die resultierende Lösung ein, die während der Hydrolyse von Oligonukleotiden der RNA durch Xrn-1 hergestellt wurde, und aspirieren Sie die Lösung 10 Mal durch die C18-Spitze. Lösen Sie nun die C18-Spitze von der P200-Pipette, positionieren Sie sie auf eine 10-Mikroliter-Pipette und waschen Sie die C18-Spitze zweimal mit einer wässrigen Lösung von 0,1% Trifluoressigsäurelösung. Entsorgen Sie die verbrauchten Mengen jedes Mal in ein separates Abfallrohr.Waschen Sie die C18-Spitze zweimal mit 10 Mikrolitern RNase-freiem Wasser. Um die MALDI-Platte zu entdecken, eluieren Sie das RNA-Oligonukleotid aus der C18-Spitze, indem Sie die Probe in die gewünschte Matrix eintauchen und die Lösung 10 Mal wieder in das Röhrchen dosieren. Pipettieren Sie diese Lösung auf zwei separate Spots von je einem Mikroliter auf der Platte und lassen Sie die Spots an der Luft trocknen.Die Konzentration der in dieser Arbeit verwendeten RNA wurde mittels UV-Visible-Spektroskopie bestimmt, die bei 90 Grad Celsius aufgezeichnet wurde, um fehlerhafte Messwerte zu vermeiden, die sich aus der möglichen Bildung der Sekundärstrukturen ergeben. Die Gesamtabfolge der Ereignisse bestand aus zwei Teilen. Erstens, die effiziente 5'Phosphorylierung von RNA, nachgewiesen durch das Auftreten von nur einem Peak, der dem erwarteten Produkt entspricht.Und zweitens das Stalling-Fragment, das sich aus der Behandlung der Probenmischung mit Xrn-1 ergibt. Die gleichen Ergebnisse wurden mit einer anderen Sequenz erzielt, die zwei oxidative Läsionen enthielt. Zu den möglichen Änderungen, die in Betracht gezogen werden sollten, gehören die Eliminierung der Verwendung des Filtergeräts oder die Berücksichtigung verschiedener Matrizen für MALDI-Flecken.Zum Beispiel Sinapinsäure oder Picolinsäure. Die RNA-Fragmente wurden aus einem enzymatischen Prozess gewonnen. Dieser Prozess wurde durch Kopplung von MALDI, elektrophoretischer Analyse, Festphasensynthese und Zirkulardichroismus etabliert.Das beschriebene Protokoll hat das Potenzial, in verschiedenen Bereichen eingesetzt zu werden, von der Forschung in den chemischen Wissenschaften bis hin zu Anwendungen im biomedizinischen Bereich.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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