Intravitale Weitfeldfluoreszenzmikroskopie der pulmonalen Mikrozirkulation bei experimenteller akuter Lungenschädigung mit einem vakuumstabilisierten Bildgebungssystem

Dieses Protokoll beschreibt detailliert die chirurgische Vorbereitung und Verwendung eines vakuumstabilisierten Systems zur Abbildung der pulmonalen Leukozytenadhäsion und Kapillarperfusion in vivo. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine stabile, hochauflösende intravitale Bildgebung der intakten spiegelnden Lunge mit minimalem körperlichem Trauma ermöglicht. Bereiten Sie zunächst das Bildgebungsfenster vor, indem Sie eine dünne Schicht Vakuumfett auf die Oberseite des äußeren Rings verteilen und dabei eine Kontamination des Vakuumkanals vermeiden.

Legen Sie einen sauberen 8-Millimeter-Glasdeckel auf das Fenster und drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, um eine Dichtung zu erzeugen. Schließen Sie das Bildfenster an eine Vakuumpumpe an, die mit einem digitalen Manometer ausgestattet ist und eine quecksilberkonstante Absaugung von 50 bis 60 Millimetern ermöglicht. Führen Sie ein Stück Glasfaserkabel durch eine 20-Gauge-Endotrachealkanüle und tauchen Sie die Spitze in Lidocain HCL.

Setzen Sie nach der Anästhesie ein modifiziertes Otoskop ein, so dass die oberen Schneidezähne in die Lücke im Spekulum passen. Passen Sie das Zielfernrohr und die Zungenposition an, bis die Epiglottis und die Stimmbänder deutlich sichtbar sind. Stecken Sie das Glasfaserkabel durch den Spalt im Spekulum und verwenden Sie kleine kreisförmige Bewegungen, um das Kabel zwischen den Stimmbändern zu führen, und verwenden Sie dann das Glasfaserkabel als Leitfaden, schieben Sie die Kanüle vorsichtig in die Luftröhre, um die Maus zu intubieren.

Nachdem Sie mit der Beatmung mit 1,5% Isofluran begonnen haben, bestätigen Sie die Anästhesietiefe, indem Sie auf Pedalreflex testen. Befestigen Sie die Kanüle mit medizinischem Klebeband an der Schnauze. Verwenden Sie Beschriftungsband, um die rechte Vorderpfote an der Neun-Uhr-Position am Heizkissen zu befestigen und die linke Hinterpfote kaudal auszufahren und an der Sechs-Uhr-Position zu befestigen.

Dehnen Sie mit einem Stoffband die linke Vorderpfote leicht in die 12-Uhr-Position und befestigen Sie das andere Ende des Bandes an der Oberseite der intravitalen Mikroskopieplattform, dann wenden Sie eine rektale Temperatursonde und ein Pfotenpulsoximeter an, um die Vitalfunktionen während des gesamten Experiments zu überwachen. Um die Maus auf die Operation vorzubereiten, sterilisieren Sie den Thorax und den Bauch mit einem 70% igen Alkoholtuch und tragen Sie eine leichte Schicht Mineralöl auf, um die Haare auf der linken Seite der Maus zu befeuchten. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Nähe des Bodens des Brustkorbs, um die darunter liegende Muskelschicht freizulegen, verlängern Sie dann den ersten Schnitt und verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um den Brustkorb freizulegen.

Greifen Sie mit einer hämostatischen Pinzette das sezierte Epithel- und Fettgewebe und stellen Sie es vom Operationsbereich frei. Um Leukozyten und Blutfluss fluoreszierend zu markieren, verabreichen Sie einen 2,5-Milliliter-Bolus pro Kilogramm Rhodamin 6G und FITC-Albumin über die Schwanzvene. Greifen Sie mit einer Zahnzange die Rippe unmittelbar unterhalb der Position der Lungenbasis am Ende der Inspiration.

Ziehen Sie die Pinzette leicht zurück, um die Rippe von der Lunge wegzuziehen, und schneiden Sie dann die Rippe ab, um einen Pneumothorax zu induzieren. Verlängern Sie den Schnitt seitlich in beide Richtungen und achten Sie darauf, die Lunge nicht zu berühren. Greifen Sie die nächsthöhere Rippe mit stumpfer Pinzette und ziehen Sie sie leicht zurück, damit die Lunge von der Brustwand abfallen kann.

Wenn sich die Lunge nicht löst, drücken Sie die Brustwand leicht gegen die Lunge, damit die Lunge an der darunter liegenden Pleura haftet und somit leichter abfällt. Setzen Sie den ursprünglichen Schnitt schließlich bis zum Brustbein und kranial fort, bis die Spitze der Lunge freigelegt wird. Verwenden Sie Baumwollapplikatoren und Gaze, um auftretende Blutungen zu mildern.

Heben Sie den Brustkorb an, um die interkostalen Blutgefäße auf dem dorsalen Aspekt der Brusthöhle freizulegen, achten Sie darauf, die Lunge nicht zu beschädigen, kauterisieren Sie das unterlegenste Interkostalgefäß in der Nähe der Wirbelsäule und schneiden Sie dann die angrenzende Rippe ab. Bewegen Sie sich schädelförmig und verwenden Sie schließlich ein wiederholtes Muster der Kauterisation und des Schneidens, um einen etwa zwei mal zwei Zentimeter großen Teil des Brustkorbs zu entfernen. Um sich auf die Bildgebung vorzubereiten, übertragen Sie die intravitale Mikroskopieplattform auf die Mikroskopstufe und positionieren Sie das Bildgebungsfenster direkt über der exponierten Lunge.

Verwenden Sie den Mikromanipulator, um das Bildgebungsfenster vorsichtig abzusenken, bis es an der Lungenoberfläche haftet und diese stabilisiert. Um die pulmonale Mikrozirkulation zu visualisieren, verwenden Sie ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop, das mit einem 20-fachen Objektiv und Standard-FITC- und Rhodamin-Filtersätzen ausgestattet ist. Verwenden Sie eine Schwarz-Weiß-CCD-Kamera, um die Videos mit optimalem Kontrast aufzunehmen.

Identifizieren Sie mit dem FITC-Filterset einen Lungenort basierend auf dem konvergenten Muster des Blutflusses, nehmen Sie ein 30-Sekunden-Video mit dem Veranstaltungsort im Fokus auf, dann wiederholen Sie die Aufnahme im selben Sichtfeld mit dem Rhodamin-Filterset zur Visualisierung von Leukozyten. Um eine Lungenarterie zu lokalisieren, verwenden Sie das FITC-Filterset, um ein Gefäß mit einem abweichenden Muster des Blutflusses zu identifizieren und ein 30-Sekunden-Video aufzunehmen. Wiederholen Sie die Aufnahme im selben Sichtfeld mit dem Rhodamin-Filterset zur Visualisierung von Leukozyten.

Um die Kapillarregionen von Interesse zu lokalisieren, verwenden Sie das FITC-Filterset, um einen Bereich von Alveolen und Kapillaren zu identifizieren, der nicht von größeren Schiffen durchschnitten wird, und zeichnen Sie ein 30-Sekunden-Video auf. Wiederholen Sie die Aufnahme im selben Sichtfeld mit dem Rhodamin-Filterset zur Visualisierung von Leukozyten. Dieses Video zeigt FITC-Bildgebung des Blutflusses innerhalb eines Lungenortes, wie durch den grünen Pfeil angezeigt.

Die Rhodamin-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung von Leukozyten am selben Ort mit zwei adhärenten Leukozyten, die durch die roten Pfeile gekennzeichnet sind. Diese Methoden wurden auch angewendet, um die gleichen Phänomene und Lungenarterien und Kapillarregionen von Interesse zu visualisieren. Um die Quantifizierung mikrozirkulatorischer Parameter zu demonstrieren, wurden Mäuse mit intranasalem LPS behandelt, um eine Lungenentzündung zu induzieren.

Der Leukozytentransport in pulmonalen Zentren wird hier mit umrissenen Bereichen gezeigt, die die analysierten Endothelregionen bei naiven und LPS-behandelten Mäusen darstellen. Leukozytenadhäsion und -rollen waren bei LPS-behandelten Mäusen erhöht. Der Leukozytentransport in pulmonalen Arterien wird hier mit umrissenen Bereichen gezeigt, die die analysierten Endothelregionen bei naiven und LPS-behandelten Mäusen darstellen.

Die Leukozytenadhäsion war bei LPS-behandelten Mäusen höher. Diese Abbildung zeigt die Leukozytenadhäsion in Lungenkapillaren bei naiven und LPS-behandelten Mäusen. Es wurde gezeigt, dass die Leukozytenadhäsion bei LPS-behandelten Mäusen höher war als bei naiven.

Diese Abbildung zeigt die Perfusion von Lungenkapillaren bei naiven und LPS-behandelten Mäusen. Es wurde gezeigt, dass die funktionelle Kapillardichte bei LPS-behandelten Mäusen niedriger ist als bei naiven. Es gibt viele herausfordernde Aspekte dieses Protokolls.

Die Optimierung der Positionierung der Maus auf der Plattform ist ein einfacher Schritt, der die chirurgischen und bildgebenden Schritte viel reproduzierbarer machen kann. Dieses Verfahren ist an eine Vielzahl von Studienparametern und Mikroskopieansätzen anpassbar. Daher sollte es die weitere Erforschung der pulmonalen Mikrozirkulation sowohl in gesunden als auch in kranken Zuständen erleichtern.