Name: Intravitale Weitfeldfluoreszenzmikroskopie der pulmonalen Mikrozirkulation bei experimenteller akuter Lungenschädigung mit einem vakuumstabilisierten Bildgebungssystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Erfahren Sie die intravitale Fluoreszenzmikroskopie der pulmonalen Mikrozirkulation bei akuter Lungenschädigung. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung mit minimalem physischem Trauma.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken Dr. Pina Colarusso, die bei der Bearbeitung und Überarbeitung dieses Manuskripts eine bedeutende Expertise zur Verfügung gestellt hat.

Alle hier beschriebenen Verfahren wurden mit vorheriger Genehmigung des Dalhousie University Committee on Laboratory Animals (UCLA) durchgeführt.
1. Vorbereitung
<ol><li>Lungenbildgebungssystem: Um das Fenster vorzubereiten, verabreichen Sie eine dünne Schicht Vakuumfett auf die Oberseite des äußeren Rings, während eine Kontamination des Vakuumkanals vermieden wird. Legen Sie einen sauberen 8 mm Glasabzug auf das Fenster und drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, um eine Abdichtung zu erzeugen.</li>
	<li>Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop: Führen Sie die Bildgebung mit einem herkömmlichen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop durch, das mit einem 20x/0,40-Objektiv mit langem Arbeitsabstand und einer Schwarz-Weiß-CCD-Kamera (Charge-Coupled Device) mit einer Bildrate von 25 FPS ausgestattet ist. Wenden Sie einen 530-550 nm Bandpass-Anregungsfilter an, um Rhodamin-6G anzuregen, und einen 460-490 nm Bandpassfilter, um Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) anzuregen.</li>
	<li>Vakuumsystem: Schließen Sie das Bildfenster an eine Vakuumpumpe an, die mit einem digitalen Manometer ausgestattet ist, das eine konstante Absaugung von 50-60 mmHg liefern kann, wie in Ergänzende Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, schließen Sie das Bildfenster über 1,0 mm I.D. Polyethylenschläuche, 1,0 cm I.D. Polyethylenschläuche, einen Vakuumkolben und einen Inline-0,2-μm-Filter an die Pumpe an.</li>
	<li>Beatmungsgerät: Stellen Sie ein kleines Nagetierbeatmungsgerät ein, um eine druckgesteuerte Belüftung mit einer Rate und einem Volumen bereitzustellen, die auf dem Gewicht der Maus basieren. Geben Sie für die Dauer des Experiments einen positiven endexspiratorischen Druck (PEEP)bei 5 cmH 2 O an und stellen Sie den Zieldruck auf 20 cmH2O ein.</li>
	<li>Anästhesie: Mit einem Low-Flow-Anästhesie-Abgabesystem, Prime eine 5,0 ml Spritze mit 99,9% Isofluran. Verwenden Sie ein Abgasabsaugsystem, um das Risiko einer Inhalation durch den Chirurgen zu minimieren.</li>
</ol>2. Anästhesie
<ol><li>Legen Sie eine 20-25 g 12 Wochen alte männliche C57Bl/6 Maus in die Anästhesie-Induktionskammer. Wenn die Kammer sicher geschlossen ist, beginnen Sie mit der Induktion mit Isoflurangas in einer Konzentration von 3% und einer Durchflussrate von 500 ml/min.</li>
	<li>Sobald die Maus betäubt ist (visualisiert durch verlangsamte Atmungsrate), geben Sie sie auf den Intubationsständer und befestigen Sie die oberen Schneidezähne an der hängenden Naht.</li>
	<li>Ziehen Sie die Naht fest, um die Schnauze im Nasenkegel zu befestigen. Beginnen Sie den Gasfluss durch den Nasenkegel in einer Konzentration von 2,5%.</li>
	<li>Bestätigen Sie eine ausreichende Tiefe der Anästhesie durch Zehenkneifen, bevor Sie zum nächsten Schritt übergehen.</li>
</ol>3. Intubation
<ol><li>Drehen Sie den Ständer so, dass die Rückseite des Ständers und die dorsale Seite der Maus dem Chirurgen zugewandt sind.</li>
	<li>Führen Sie die Spitze eines 20 cm langen Glasfaserkabels durch eine 20 G endotracheale Kanüle und tauchen Sie die Spitze in Lidocain HCl (1%), um den Durchgang des Kabels durch den Kehlkopf zu erleichtern.</li>
	<li>Heben Sie mit stumpfen Pinzetten den Unterkiefer an und verschieben Sie die Zunge, um einen freien Durchgang in die Atemwege zu gewährleisten.</li>
	<li>Setzen Sie ein modifiziertes Otoskop ein (~60° Spekulumfangsumfang entfernt), so dass die oberen Schneidezähne in den Spalt im Spekulum passen. Passen Sie das Zielfernrohr und die Zungenposition an, bis die Epiglottis und die Stimmbänder deutlich sichtbar sind.</li>
	<li>Führen Sie das mit der Endotrachealkanüle beladene Lichtwellenleiter durch den Spalt im Spekulum und in den Kehlkopf ein. Mit kleinen kreisenden Bewegungen führen Sie das Kabel durch die Stimmbänder und in die Luftröhre.</li>
	<li>Schieben Sie die Kanüle entlang des Glasfaserkabels und führen Sie zwischen den Stimmbändern in die Luftröhre.</li>
</ol>4. Belüftung
<ol><li>Holen Sie die Maus aus dem Intubationsständer und legen Sie sie auf ein Heizkissen in der rechten seitlichen Dekubitusposition.</li>
	<li>Schließen Sie die Kanüle an den Beatmungsschlauch an und starten Sie das Beatmungsgerät. Reduzieren Sie die Anästhesiekonzentration auf 1,5% und überwachen Sie die Tiefe, indem Sie auf Pedalreflex testen. Wenn der Reflex anhält, erhöhen Sie die Konzentration schrittweise auf bis zu 2%.</li>
	<li>Geben Sie Tränengel in die Augen der Maus, um ein Austrocknen zu verhindern.</li>
	<li>Befestigen Sie die Kanüle mit medizinischem Klebeband an der Schnauze. Beschriftungsband befestigen Sie die rechte Vorderpfote am Heizkissen in etwa der 9-Uhr-Position. Strecken Sie die linke Hinterpfote kaudal aus und sichern Sie sich ungefähr in der 6-Uhr-Position.</li>
	<li>Dehnen Sie die linke Vorderpfote mit einem Stoffband leicht in die 12-Uhr-Position und befestigen Sie das andere Ende des Bandes an der Oberseite der IVM-Plattform, wie in Abbildung 2A dargestellt (die Aufrechterhaltung einer leichten Spannung erleichtert hier die anschließende Thorakotomie).</li>
	<li>Setzen Sie einen rektalen Temperaturfühler ein und befestigen Sie den Fühler, indem Sie ihn an das Heizkissen kleben. Legen Sie ein Pulsoximeter auf die rechte Hinterpfote und befestigen Sie es am Heizkissen, wobei Sie darauf achten, die Durchblutung nicht zu stören.</li>
	<li>Sobald die Temperatur bei 37,0 ° C ± 0,1 ° C stabil ist, fahren Sie mit der Thorakotomie fort.</li>
</ol>5. Thorakotomie
<ol><li>Sterilisieren Sie den Thorax und den Bauch mit einem 70% igen Alkoholtuch. Tragen Sie eine leichte Schicht Mineralöl auf, um das Haar auf der linken Seite der Maus zu befeuchten - vom Brustbein bis zur Wirbelsäule und von der Schulter bis zum Boden des Brustkorbs.</li>
	<li>Machen Sie mit stumpfer Pinzette und gerader Schere einen kleinen Längseinschnitt in der Nähe des Bodens des Brustkorbs, um die darunter liegende Muskelschicht freizulegen.</li>
	<li>Wenn Sie sich ventral bewegen, verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um das Epithel- und Fettgewebe von der Muskelschicht zu trennen. Kauterisieren Sie alle exponierten Blutgefäße. Sobald das Risiko eines Blutverlustes gemindert wurde, verlängern Sie den ursprünglichen Schnitt ventral bis zum xiphoiden Prozess.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang dorsal bis ~ 5 mm seitlich zur Wirbelsäule.</li>
	<li>Wenn Sie sich schädelig bewegen, verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um den Brustkorb freizulegen. Kauterisieren Sie alle exponierten Blutgefäße, um die hämodynamische Stabilität zu erhalten.</li>
	<li>Sobald das Risiko eines Blutverlustes gemindert wurde, verlängern Sie den Einschnitt vom Xiphoid-Prozess auf die Achselhöhle.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der dorsalen Seite des Einschnitts, bis Sie dem linken Ohr ~ 1 cm unterlegen sind.</li>
	<li>Greifen Sie mit einer hämostatischen Pinzette das sezierte Epithel- und Fettgewebe und entfernen Sie das Operationsgebiet (Abbildung 2B).</li>
	<li>Injizieren Sie eine Lösung von Rhodamin-6G (0,5 mg/ml; 1,5 ml/kg) zur Visualisierung von Leukozyten und Rinder-FITC-Albumin (50 mg/ml; 1 ml/kg) zur Visualisierung der Kapillarperfusion über die Schwanzvene.</li>
	<li>Greifen Sie mit einer Zahnzange die Rippe unmittelbar niedriger als die Position der Lungenbasis bei der Endinspiration und ziehen Sie sie leicht zurück, um die Rippe von der Lunge wegzuziehen. Schneiden Sie die Rippe ab, um einen Pneumothorax zu induzieren.</li>
	<li>Verlängern Sie den Schnitt seitlich entlang des Interkostalmuskels in beide Richtungen und achten Sie darauf, die freiliegende Lungenoberfläche nicht zu berühren.</li>
	<li>Greifen Sie mit stumpfer Pinzette die nächsthöhere Rippe und ziehen Sie sie leicht zurück, damit die Lunge von der Brustwand abfallen kann. Wenn sich die Lunge nicht löst, drücken Sie die Brustwand leicht gegen die Lunge, damit die Lunge an der darunter liegenden Pleura haftet und somit leichter abfällt.</li>
	<li>Setzen Sie den ursprünglichen Schnitt ventral bis zum Brustbein und kranial fort, bis die Spitze der Lunge freigelegt wird. Verwenden Sie Baumwollapplikatoren und Gaze, um auftretende Blutungen zu mildern.</li>
	<li>Heben Sie den Brustkorb an, um interkostale Blutgefäße auf dem dorsalen Aspekt der Brusthöhle freizulegen. Achten Sie darauf, die Lunge nicht zu schädigen, kauterisieren Sie das unterlegenste Interkostalgefäß in der Nähe der Wirbelsäule und schneiden Sie dann die Rippe ab. Bewegen Sie sich kranial und ventral, wiederholen Sie den Vorgang, bis ein etwa 1 cm x 1,5 cm großer Teil des Brustkorbs ausgeschnitten ist (Abbildung 2C).</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeitsansammlungen in der Brusthöhle durch Kapillarwirkung mit kleinen Mullstreifen.</li>
	<li>Während Sie mit der Mikroskopie fortfahren, lassen Sie ~ 5 Minuten für die intrapleurale Flüssigkeit zerstreuen, um eine sicherere Schnittstelle zwischen der Lunge und dem Bildgebungsfenster zu schaffen.</li>
</ol>6. Mikroskopie
<ol><li>Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und stellen Sie den Druck auf ~50–60 mmHg ein.</li>
	<li>Übertragen Sie die IVM-Plattform auf die Mikroskopstufe. Positionieren Sie den Metallpfosten und den Mikromanipulator so, dass sich das Bildfenster direkt über der freiliegenden Lunge befindet und sich der Fensterarm der Lunge von ungefähr der 3-Uhr-Position nähert.</li>
	<li>Senken Sie das Bildgebungsfenster vorsichtig mit dem Mikromanipulator ab, bis es an der Lungenoberfläche haftet und diese stabilisiert (Abbildung 3A).</li>
	<li>Identifizieren Sie mit dem 20-fachen Objektiv und dem 460-490-nm-Bandpass-Erregungsfilter eine Lungenvenule basierend auf dem konvergenten Muster des Blutflusses. Zentriere das Schiff im Sichtfeld und zeichne 30 s Video auf.<ol>
<li>Wechseln Sie zum Bandpass-Erregerfilter 530-550 nm und nehmen Sie 30 s Video im selben Sichtfeld auf.</li>
		<li>Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, bis fünf Lungenvenolen abgebildet wurden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifizieren Sie mit dem Bandpass-Erregungsfilter 460-490 nm eine Lungenarteriole basierend auf dem divergenten Muster des Blutflusses. Zentriere das Schiff im Sichtfeld und zeichne 30 s Video auf.<ol>
<li>Wechseln Sie zum Bandpass-Erregerfilter 530-550 nm und nehmen Sie 30 s Video im selben Sichtfeld auf.</li>
		<li>Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, bis fünf Lungenarteriolen abgebildet wurden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lokalisieren Sie mit dem Bandpass-Anregungsfilter 460-490 nm einen Bereich von Alveolen und Kapillaren, der nicht von größeren Gefäßen durchschnitten wird, und zeichnen Sie 30 s Video auf.<ol>
<li>Wechseln Sie zum Bandpass-Erregerfilter 530-550 nm und nehmen Sie 30 s Video im selben Sichtfeld auf.</li>
		<li>Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, bis fünf Kapillarregionen abgebildet sind.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Euthanasie und Reinigungsprotokoll
<ol><li>Entfernen Sie die IVM-Plattform von der Mikroskopstufe und passen Sie die Isofluranabgabe für 5 Minuten auf 5% an, um die Maus einzuschläfern.</li>
	<li>Entsorgen Sie während des Wartens das Deckglas und trennen Sie das Bildfenster von der Plattform. Reinigen Sie das Bildfenster mit einer kleinen Bürste und verwenden Sie eine 30-G-Spritze, die in den Kanal eingeführt wird, um es mehrmals mit destilliertem Wasser zu spülen. Dann mit der Vakuumpumpe mit 95% Ethanol spülen.</li>
	<li>Nach Ablauf von 5 Minuten stoppen Sie das Beatmungsgerät und sorgen Sie für eine vollständige Euthanasie durch Zervixdislokation.</li>
</ol>

<ol><li>Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+pulmonary+immune+response+in+inflammation+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471(2021).</li>
<li>Gaertner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+interpretation+of+intravital+microscopy+images+in+studies+of+lung+tissue+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009(2015).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Looney, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).</li>
<li>Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+intravital+two-photon+excitation+microscopy+reveals+absence+of+pulmonary+vasoocclusion+in+unchallenged+sickle+cell+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice.</a> IntraVital. 3 (2), 29748(2014).</li>
<li>Blueschke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+measurement+of+microcirculatory+blood+flow+velocity+in+pulmonary+metastases+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630(2014).</li>
<li>Tabuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precapillary+oxygenation+contributes+relevantly+to+gas+exchange+in+the+intact+lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).</li>
<li>Rodriguez-Tirado, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+high-resolution+intravital+microscopy+in+the+lung+with+a+vacuum+stabilized+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603(2016).</li>
<li>Fiole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+intravital+imaging+of+lungs+during+anthrax+infection+reveals+long-lasting+macrophage-dendritic+cell+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts.</a> Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).</li>
<li>Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iNKT+cell+emigration+out+of+the+lung+vasculature+requires+neutrophils+and+monocyte-derived+dendritic+cells+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation.</a> Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).</li>
<li>Neupane, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patrolling+alveolar+macrophages+conceal+bacteria+from+the+immune+system+to+maintain+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis.</a> Cell. 183 (1), 110-125 (2020).</li>
<li>Tschernig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualisation+of+microparticles+in+the+living+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Direct visualisation of microparticles in the living lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).</li>
<li>Mertens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+dynamics+in+acute+lung+injury%3A+Heterogeneous+distension+rather+than+cyclic+opening+and+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse.</a> Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).</li>
<li>Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilation+and+perfusion+at+the+alveolar+level%3A+Insights+from+lung+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy.</a> Frontiers in Physiology. 11, 291(2020).</li>
<li>Margraf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6%25+Hydroxyethyl+starch+%28HES+130%2F0.4%29+diminishes+glycocalyx+degradation+and+decreases+vascular+permeability+during+systemic+and+pulmonary+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice.</a> Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).</li>
<li>Roller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo+observations+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1-mediated+leukocyte-endothelial+cell+interactions+in+the+pulmonary+microvasculature+in+abdominal+sepsis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice.</a> Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).</li>
<li>Marques, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+increases+endothelial+CXCL16-leukocyte+CXCR6+adhesion+in+vitro+and+in+vivo.+Potential+consequences+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1766(2017).</li>
<li>Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+an+erythrocyte+population+with+decreased+deformability+and+hemoglobin+content+following+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).</li>
<li>Trzeciak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+microcirculatory+perfusion+derangements+in+patients+with+severe+sepsis+and+septic+shock%3A+Relationship+to+hemodynamics%2C+oxygen+transport%2C+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Emergency+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival.</a> Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).</li>
<li>Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+intravital+imaging+of+leukocyte+migration+during+inflammation+in+the+respiratory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acute+and+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system.</a> Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li>
<li>Orthgiess, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+exhibit+Lyz2+promoter+activity+in+vivo%3A+Implications+for+using+LysM-Cre+mice+in+myeloid+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research.</a> European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).</li>
<li>Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+lung+injury%3A+A+clinical+and+molecular+review%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute lung injury: A clinical and molecular review.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).</li>
<li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786(2019).</li>
<li>Kim, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+tracheal+epithelial+cells+in+mice+during+airway+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).</li>
<li>Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopic+optical+coherence+tomography+imaging+to+assess+mucus-mobilizing+interventions+for+muco-obstructive+lung+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).</li>
<li>Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopic+observations+of+15-%C2%B5m+microspheres+lodging+in+the+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li>
<li>Amato, M. B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+protective-ventilation+strategy+on+mortality+in+the+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).</li>
<li>Looney, M. R., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the lung.</a> Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).</li>
</ol>

Dr. Kamala D. Patel ist Präsidentin und Mitbegründerin von Luxidea, dem Unternehmen, von dem das in diesem Experiment verwendete Bildgebungsfenster gekauft wurde.

Das hier vorgestellte Protokoll erfordert Übung und Aufmerksamkeit für einige kritische Schritte. Zunächst ist es wichtig, das Bildgebungsfenster vor Beginn der Intubation und Operation vorzubereiten. Verwenden Sie eine minimale Menge an Vakuumfett, um den äußeren Ring des Bildfensters zu beschichten, tragen Sie das Deckglas auf und testen Sie die Absaugung mit einem Tropfen destilliertem Wasser. Wenn Sie dies im Voraus vorbereiten, wird verhindert, dass die exponierte Lunge während des Setups austrocknet. Während es mög...

Die intravitale Mikroskopie (IVM) ist ein nützliches bildgebendes Werkzeug zur Visualisierung und Untersuchung verschiedener biophysikalischer Prozesse in vivo. Die Lunge ist aufgrund ihrer geschlossenen Lage, der zerbrechlichen Natur ihres Gewebes und der durch Atmung und Herzschlag induzierten Bewegungsartefakte sehr schwierig in vivo abzubilden 1,2. Verschiedene intravitale Mikroskopie-Setups (IVM) wurden für die Echtzeit-Bildgebung von Leukozyten-Endothel-Interaktionen in der pulmonalen Mikrozirkulation entwickelt, um diese Herausforderungen zu meistern. Solche Ansätze basieren auf der chirurgischen Freilegung und Stabilisierung der Lunge für die Bildgebung.
Tiere werden typischerweise durch chirurgische Eingriffe auf die Lungen-IVM vorbereitet. Zuerst werden die Tiere intubiert und beatmet, was die chirurgische Exzision eines Thoraxfensters und nachfolgende Eingriffe zur Stabilisierung der Lunge für die Bildgebung ermöglicht. Eine Technik besteht darin, das Parenchym auf ein Glasdeckglas3 zu kleben, ein Verfahren, das ein erhebliches körperliches Trauma für das abgebildete Gewebe riskiert. Fortgeschrittener ist die Verwendung eines Vakuumsystems zur Stabilisierung der Lunge unter einem Glasfenster4. Dieser Aufbau erleichtert die lose Haftung der Lungenoberfläche am Deckglas über ein reversibles Vakuum, das über einen großen lokalen Bereich verteilt ist, und dehnt die Lunge aus, während die Bewegung in den x-, y- und z-Dimensionen4 begrenzt wird. Das Vakuum wird gleichmäßig durch einen Kanal aufgetragen, der den Bildgebungsbereich des Aufbaus umgibt, und zieht das Gewebe in einen flachen konischen Bereich, der dem bildgebenden Deckglas4 zugewandt ist. Durch dieses Sichtfenster kann die Mikrozirkulation der Lunge mit verschiedenen optischen Bildgebungsmodalitäten untersucht werden.
Lung IVM ermöglicht die quantitative Bildgebung einer Vielzahl von mikrozirkulatorischen Parametern. Dazu gehören Messungen wie Leukozytenspurgeschwindigkeit und -länge5, Flussgeschwindigkeit der roten Blutkörperchen6 und Oxygenierung7, Tumormetastasen8, die Unterscheidung von Immunzellsubpopulationen 9,10,11, Visualisierung von Mikropartikeln12, Alveolardynamik 13,14, Gefäßpermeabilität 15 und Kapillarfunktion 16 . Der Fokus liegt dabei auf der Leukozytenrekrutierung und Kapillarfunktion. Die Einleitung der Leukozytenrekrutierung in der pulmonalen Mikrozirkulation beinhaltet transiente Rollwechselwirkungen und fest adhäsive Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und Endothelzellen, die beide unter entzündlichen Bedingungen erhöht sind16,17. Typischerweise wird das Rollen durch die Anzahl der Leukozyten quantifiziert, die eine vom Betreiber definierte Referenzlinie passieren, während die Adhäsion durch die Anzahl der Leukozyten quantifiziert wird, die auf dem Endothel16 unbeweglich sind. Die Kapillarfunktion kann auch in entzündlichen Zuständen beeinträchtigt sein, was oft zu einer verminderten Perfusion führt. Dies kann auf mehrere Faktoren zurückgeführt werden, darunter eine Verringerung der Verformbarkeit roter Blutkörperchen18 und eine vielfältige Expression der induzierbaren NO-Synthase durch Endothelzellen, was zu einem pathologischen Rangieren19 führt. Typischerweise wird die Gesamtlänge der perfundierten Kapillaren pro Fläche gemessen und als funktionelle Kapillardichte (FCD) angegeben.
Die Untersuchung der Leukozytenrekrutierung in der Lunge in Echtzeit erfordert die Markierung biologischer Ziele mit Fluoreszenzfarbstoffen oder fluoreszenzmarkierten Antikörpern20. Alternativ können verschiedene transgene Mausstämme wie Lysozym M-grün fluoreszierendes Protein (LysM-GFP) verwendet werden, um spezifische Immunzelluntergruppen wie Neutrophile21,22 abzubilden. Die fluoreszenzmarkierten Leukozyten können dann mittels Weitfeldfluoreszenzmikroskopie, konfokaler Mikroskopie oder Multiphotonenmikroskopie sichtbar gemacht werden. Diese Techniken erreichen Kontrast, indem sie spezifische Anregungswellenlängen verwenden und emittierte Fluoreszenz detektieren, während sie gleichzeitig die Detektion der Anregungswellenlänge blockieren und so das markierte Objekt hervorheben.
Bestehende Forschungen zur Quantifizierung von Leukozytenrollen, Adhäsion und funktioneller Kapillardichte in der murinen Lunge stützten sich hauptsächlich auf die manuelle Videoanalyse. Möglich wird dies durch Open-Source-Software wie Fiji6,23, proprietäre Software wie CapImage12 oder maßgeschneiderte Bildverarbeitungssysteme 24. Umgekehrt ermöglichen verschiedene proprietäre Softwareplattformen (z. B. NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) die automatisierte Messung einer Vielzahl anderer physiologischer Parameter, einschließlich vieler der zuvor hier genannten 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Wichtige Beobachtungen wurden in Bezug auf die Pathologie der akuten Lungenschädigung (ALI) und des akuten Atemnotsyndroms (ARDS) unter Verwendung von Lungen-IVM gemacht. ARDS ist durch eine Vielzahl von pathophysiologischen Prozessen in der Lunge gekennzeichnet, einschließlich Lungenödem und Alveolarschäden, die durch eine Funktionsstörung des Endothels und der Epithelbarriereverursacht werden 25. Unter Verwendung eines murinen Modells wurde festgestellt, dass Sepsis-induzierte ALI mit signifikanten schädlichen Veränderungen des Immunzelltransports in der Lungenumgebung assoziiert ist26. Es wurde festgestellt, dass Neutrophile, die in den Kapillaren von Mäusen mit Sepsis-induziertem ALI rekrutiert wurden, die Mikrozirkulation behindern und dadurch die Hypoxie bei ALI26 erhöhen. Darüber hinaus wurde IVM verwendet, um Einblicke in den zugrunde liegenden Reparaturmechanismus nach dem Einsetzen von ARDS27 zu gewinnen. Die Lungen-IVM war auch ein wertvolles Werkzeug zum Verständnis pathophysiologischer Veränderungen bei verschiedenen obstruktiven Lungenerkrankungen. Zum Beispiel hat die Visualisierung des Schleimtransports bei Krankheiten wie Mukoviszidose (CF) und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) die Untersuchung neuartiger und bestehender Behandlungen für die Schleimentfernungerleichtert 28. Der Leukozytenhandel unter diesen Bedingungen wurde ebenfallsanalysiert 17.
Dieses Protokoll erweitert den ursprünglich von Lamm et al.29 beschriebenen Ansatz, Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen unter Verwendung herkömmlicher Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen. Die beschriebenen Verfahren verwenden ein In-vivo-Lungenbildgebungssystem , das eine 16,5 cm x 12,7 cm große Metallbasis, einen Mikromanipulator und ein Vakuumbildgebungsfenster umfasst (Abbildung 1). Das System ist in einer 20 cm x 23,5 cm großen 3D-gedruckten Plattform (Supplemental File 1) montiert, um eine sichere Befestigung für den Ventilatorschlauch und das Heizkissen zu gewährleisten. Diese Methode bietet eine reproduzierbare und quantifizierbare Bildgebung der murinen pulmonalen Mikrozirkulation in vivo. Wichtige Aspekte der chirurgischen Vorbereitung sowie der ordnungsgemäße Einsatz eines vakuumstabilisierten Lungenbildgebungssystems werden ausführlich erläutert. Schließlich wird ein experimentelles Modell von ALI verwendet, um eine repräsentative Bildgebung und Analyse des veränderten Leukozytenrollens, der Leukozytenadhäsion und der Kapillarperfusion im Zusammenhang mit Entzündungen bereitzustellen. Die Verwendung dieses Protokolls soll weitere wichtige Untersuchungen zu pathophysiologischen Veränderungen der pulmonalen Mikrozirkulation während akuter Krankheitszustände erleichtern.

<table><tbody><tr><td>1 mL BD Luer Slip Tip Spritze steril, Einmalgebrauch</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td>1 mL Spritze</td></tr><tr><td>ADSON Verbandzange, Spitzenbreite 0,6 mm, Zahnlänge 11,5 mm, 12 cm</td><td>RWD Life Science Co.</td><td>F12002-12</td><td>Stumpfe Pinzette</td></tr><tr><td>Albumin-Fluorescein Isothiocyanat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9771-1G</td><td>FITC-Albumin</td></tr><tr><td>Alkohol Tupfer Isopropylalkohol 70% v/v</td><td>Canadian Custom Packaging Company</td><td>80002455</td><td>Alkohol Tuch</td></tr><tr><td>AVDC110 Advanced Digital Video Converter</td><td>Canopus</td><td>00631069602029</td><td>Digital Video Converter</td></tr><tr><td>S/W - CCD - Camera</td><td>Horn Imaging</td><td>BC-71</td><td>Kamera</td></tr><tr><td>Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit</td><td>Fine Science Tools</td><td>18010-00</td><td>Cauterizer</td></tr><tr><td>C57BL/6 Mäuse</td><td>Charles River Laboratories International</td><td>C57BL / 6NCrl</td><td>C57BL / 6 Mäuse</td></tr><tr><td>Applikatoren mit Baumwollspitze</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td>Baumwollapplikator</td></tr><tr><td>CS-8R 8mm Rundglas Deckglas</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0701</td><td>Glas-Deckglas</td></tr><tr><td>Digitales Manometer</td><td>ITM Instruments Inc.</td><td>DG2551L0NAM02L0IM& V</td><td>Digitales Manometer</td></tr><tr><td>Dr Mom Slimline Edelstahl LED Otoskop</td><td>Dr. Mom Otoskope</td><td>1001</td><td>Otoskop</td></tr><tr><td>Ethylalkohol 95% vol</td><td>Kommerzielle Alkohole</td><td>P016EA95</td><td>95% Ethanol</td></tr><tr><td>Feinschere - Martensitischer Edelstahl</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Schere</td></tr><tr><td>Fisherbrand Farbiges Beschriftungsband</td><td>Fisher Scientific</td><td>1590110</td><td>Beschriftungsband</td></tr><tr><td>Gast DOA-P704-AA Hochleistungs-Vakuumpumpe</td><td>Cole-Parmer Canada Company</td><td>ZA-07061-40</td><td>Vakuumpumpe</td></tr><tr><td>Hartman Hemostats</td><td>Fine Science Tools</td><td>13003-10</td><td>Hämostatische Pinzette</td></tr><tr><td>Hochvakuumfett</td><td>Dow Corning</td><td>DC976VF</td><td>Vakuumfett</td></tr><tr><td>Isofluran USP</td><td>Fresenius Kabi</td><td>CP0406V2</td><td>Isofluran</td></tr><tr><td>LIDOcain HCl Injektion 1% 50 mg/5 mL</td><td>Teligent Deutschland</td><td>0121AD01</td><td>Lidocain HCl 1%</td></tr><tr><td>LungenchirurgieBoard</td><td>Luxidea, Inc.</td><td>IMCH-0001</td><td>Entwickelt für die intravitale Mikroskopie der Lunge</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Teva Canada</td><td>00485802</td><td>Mineralöl</td></tr><tr><td>Maus Endotracheales Intubationskit</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>ETI-</td><td>Intubationsständer, Anästhesiemaske, 20 G endotracheale Kanüle, Glasfaserkabel</td></tr><tr><td>MST49 Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>10 450 022</td><td>Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>N Plan L 20x/0,40 Mikroskop mit langem Arbeitsabstand Objektiv</td><td>Leica Microsystems</td><td>566035</td><td>20x Objektiv</td></tr><tr><td>Vliesschwämme 2" x 2"</td> <td>AMD-Ritmed</td><td>A2101-CH</td><td>Gaze</td></tr><tr><td>Optixcare Augenschmiermittel Plus</td><td>Aventix</td><td>5914322</td><td>Tränengel</td></tr><tr><td>Original Prusa i3 MK3S+ 3D-Drucker</td><td>Prusa Research</td><td>PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI</td><td>3D-Drucker</td></tr><tr><td>Sauerstoff, Komprimiert</td><td>Linde Canada Inc.</td><td></td><td>Oxygen</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Nadel 30 G x 1/2 (0,3 mm x 13 mm)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td>305106 30 G Nadel</td></tr><tr><td>Pyrex 5340-2L 5340 Filterkolben, 2000 mL</td><td>Cole-Parmer Canada Company</td><td>5340-2L</td><td>Isolierflasche</td></tr><tr><td>Rhodamin 6 G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252433 Rhodamin</td><td>6G</td></tr><tr><td>Secure Soft Cloth Medical Tape - 3"</td> <td>Grundiert</td><td>PM5-630709</td><td>Gewebeband</td></tr><tr><td>Silastic Medical Grade Schlauch .040 in. ID x .085 Zoll OD</td><td>Dow Corning</td><td>602-205</td><td>1,0 mm Innendurchmesser Polyethylen-Schlauch</td></tr><tr><td>Somnosuite Low-Flow Anästhesiesystem</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SS-01, SS-04-Modul</td><td>Kleines Nagetierbeatmungsgerät, Low-Flow-Anästhesiesystem, Heizkissen, Rektale Temperatursonde, Pulsoximeter</td></tr><tr><td>Gewebezange, 12,5 cm lang, gebogen, 1 x 2 Zähne</td><td>World Precision Instruments</td><td>501216</td><td>Zahnzange</td></tr><tr><td>Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 Zoll x 10 yd (2,5 cm x 9,1 m)</td><td>3M</td><td>7000002795</td><td>Medizinisches Klebeband</td></tr><tr><td>Schlauch, transparent, 3/8 Zoll Innendurchmesser</td><td>Grainger Canada</td><td>USSZUSA-HT3314</td><td>1,0 cm Innendurchmesser Polyethylen-Schlauch</td></tr><tr><td>Whatman 6720-5002 50 mm Inline-Filter, PTFE, 0,2 & Mikro; m</td><td>Cole-Parmer Canada Company</td><td>6720-5002</td><td>Inline 0,2&Mikro; m Filter</td></tr></tbody></table>

intravitale weitfeldfluoreszenzmikroskopie der pulmonalen mikrozirkulation bei experimenteller akuter lungenschädigung mit einem vakuumstabilisierten bildgebungssystem

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

Die intravitale Bildgebung von Leukozyten-Endothel-Interaktionen bietet wertvolle Einblicke in immunvermittelte Erkrankungen bei lebenden Tieren. Die Untersuchung von akuten Lungenverletzungen (ALI) / akutem Atemnotsyndrom (ARDS) und anderen Atemwegserkrankungen in vivo ist aufgrund der begrenzten Zugänglichkeit und der inhärenten Bewegungsartefakte der Lunge schwierig. Nichtsdestotrotz wurden verschiedene Ansätze entwickelt, um diese Herausforderungen zu meistern. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur intravitalen Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von Echtzeit-Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen in der pulmonalen Mikrozirkulation in einem experimentellen Modell von ALI. Ein In-vivo-Lungenbildgebungssystem und eine 3D-gedruckte intravitale Mikroskopieplattform werden verwendet, um die betäubte Maus zu sichern und die Lunge zu stabilisieren, während verwirrende Lungenverletzungen minimiert werden. Nach der Vorbereitung wird die Weitfeldfluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Leukozytenadhäsion, das Leukozytenrollen und die Kapillarfunktion zu untersuchen. Während sich das hier vorgestellte Protokoll auf die Bildgebung in einem akuten Modell einer entzündlichen Lungenerkrankung konzentriert, kann es auch angepasst werden, um andere pathologische und physiologische Prozesse in der Lunge zu untersuchen.

Um die durch dieses Protokoll erreichbaren Ergebnisse zu veranschaulichen, wurde die akute Lungenverletzung (ALI) 6 h vor der Bildgebung unter Verwendung eines Modells der intranasalen bakteriellen Lipopolysaccharid-Instillation (LPS) induziert. Kurz gesagt, Mäuse (n = 3) wurden mit Isofluran betäubt, und kleine Tröpfchen von LPS aus Pseudomonas aeruginosa in steriler Kochsalzlösung (10 mg / ml) wurden in einer Dosierung von 5 mg / kg in die linke Naris pipettiert. Dies wurde mit naiven Mäusen verglichen (n = 3;...

Die intravitale Fluoreszenzmikroskopie kann verwendet werden, um Leukozyten-Endothel-Interaktionen und Kapillarperfusion in Echtzeit zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Abbildung und Quantifizierung dieser Parameter im pulmonalen Mikrokreislauf mit einem vakuumstabilisierten Lungenbildgebungssystem.

Intravitale Weitfeldfluoreszenzmikroskopie der pulmonalen Mikrozirkulation bei experimenteller akuter Lungenschädigung mit einem vakuumstabilisierten Bildgebungssystem

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

Dieses Protokoll beschreibt detailliert die chirurgische Vorbereitung und Verwendung eines vakuumstabilisierten Systems zur Abbildung der pulmonalen Leukozytenadhäsion und Kapillarperfusion in vivo. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine stabile, hochauflösende intravitale Bildgebung der intakten spiegelnden Lunge mit minimalem körperlichem Trauma ermöglicht. Bereiten Sie zunächst das Bildgebungsfenster vor, indem Sie eine dünne Schicht Vakuumfett auf die Oberseite des äußeren Rings verteilen und dabei eine Kontamination des Vakuumkanals vermeiden.Legen Sie einen sauberen 8-Millimeter-Glasdeckel auf das Fenster und drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, um eine Dichtung zu erzeugen. Schließen Sie das Bildfenster an eine Vakuumpumpe an, die mit einem digitalen Manometer ausgestattet ist und eine quecksilberkonstante Absaugung von 50 bis 60 Millimetern ermöglicht. Führen Sie ein Stück Glasfaserkabel durch eine 20-Gauge-Endotrachealkanüle und tauchen Sie die Spitze in Lidocain HCL.Setzen Sie nach der Anästhesie ein modifiziertes Otoskop ein, so dass die oberen Schneidezähne in die Lücke im Spekulum passen. Passen Sie das Zielfernrohr und die Zungenposition an, bis die Epiglottis und die Stimmbänder deutlich sichtbar sind. Stecken Sie das Glasfaserkabel durch den Spalt im Spekulum und verwenden Sie kleine kreisförmige Bewegungen, um das Kabel zwischen den Stimmbändern zu führen, und verwenden Sie dann das Glasfaserkabel als Leitfaden, schieben Sie die Kanüle vorsichtig in die Luftröhre, um die Maus zu intubieren.Nachdem Sie mit der Beatmung mit 1,5% Isofluran begonnen haben, bestätigen Sie die Anästhesietiefe, indem Sie auf Pedalreflex testen. Befestigen Sie die Kanüle mit medizinischem Klebeband an der Schnauze. Verwenden Sie Beschriftungsband, um die rechte Vorderpfote an der Neun-Uhr-Position am Heizkissen zu befestigen und die linke Hinterpfote kaudal auszufahren und an der Sechs-Uhr-Position zu befestigen.Dehnen Sie mit einem Stoffband die linke Vorderpfote leicht in die 12-Uhr-Position und befestigen Sie das andere Ende des Bandes an der Oberseite der intravitalen Mikroskopieplattform, dann wenden Sie eine rektale Temperatursonde und ein Pfotenpulsoximeter an, um die Vitalfunktionen während des gesamten Experiments zu überwachen. Um die Maus auf die Operation vorzubereiten, sterilisieren Sie den Thorax und den Bauch mit einem 70% igen Alkoholtuch und tragen Sie eine leichte Schicht Mineralöl auf, um die Haare auf der linken Seite der Maus zu befeuchten. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Nähe des Bodens des Brustkorbs, um die darunter liegende Muskelschicht freizulegen, verlängern Sie dann den ersten Schnitt und verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um den Brustkorb freizulegen.Greifen Sie mit einer hämostatischen Pinzette das sezierte Epithel- und Fettgewebe und stellen Sie es vom Operationsbereich frei. Um Leukozyten und Blutfluss fluoreszierend zu markieren, verabreichen Sie einen 2,5-Milliliter-Bolus pro Kilogramm Rhodamin 6G und FITC-Albumin über die Schwanzvene. Greifen Sie mit einer Zahnzange die Rippe unmittelbar unterhalb der Position der Lungenbasis am Ende der Inspiration.Ziehen Sie die Pinzette leicht zurück, um die Rippe von der Lunge wegzuziehen, und schneiden Sie dann die Rippe ab, um einen Pneumothorax zu induzieren. Verlängern Sie den Schnitt seitlich in beide Richtungen und achten Sie darauf, die Lunge nicht zu berühren. Greifen Sie die nächsthöhere Rippe mit stumpfer Pinzette und ziehen Sie sie leicht zurück, damit die Lunge von der Brustwand abfallen kann.Wenn sich die Lunge nicht löst, drücken Sie die Brustwand leicht gegen die Lunge, damit die Lunge an der darunter liegenden Pleura haftet und somit leichter abfällt. Setzen Sie den ursprünglichen Schnitt schließlich bis zum Brustbein und kranial fort, bis die Spitze der Lunge freigelegt wird. Verwenden Sie Baumwollapplikatoren und Gaze, um auftretende Blutungen zu mildern.Heben Sie den Brustkorb an, um die interkostalen Blutgefäße auf dem dorsalen Aspekt der Brusthöhle freizulegen, achten Sie darauf, die Lunge nicht zu beschädigen, kauterisieren Sie das unterlegenste Interkostalgefäß in der Nähe der Wirbelsäule und schneiden Sie dann die angrenzende Rippe ab. Bewegen Sie sich schädelförmig und verwenden Sie schließlich ein wiederholtes Muster der Kauterisation und des Schneidens, um einen etwa zwei mal zwei Zentimeter großen Teil des Brustkorbs zu entfernen. Um sich auf die Bildgebung vorzubereiten, übertragen Sie die intravitale Mikroskopieplattform auf die Mikroskopstufe und positionieren Sie das Bildgebungsfenster direkt über der exponierten Lunge.Verwenden Sie den Mikromanipulator, um das Bildgebungsfenster vorsichtig abzusenken, bis es an der Lungenoberfläche haftet und diese stabilisiert. Um die pulmonale Mikrozirkulation zu visualisieren, verwenden Sie ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop, das mit einem 20-fachen Objektiv und Standard-FITC- und Rhodamin-Filtersätzen ausgestattet ist. Verwenden Sie eine Schwarz-Weiß-CCD-Kamera, um die Videos mit optimalem Kontrast aufzunehmen.Identifizieren Sie mit dem FITC-Filterset einen Lungenort basierend auf dem konvergenten Muster des Blutflusses, nehmen Sie ein 30-Sekunden-Video mit dem Veranstaltungsort im Fokus auf, dann wiederholen Sie die Aufnahme im selben Sichtfeld mit dem Rhodamin-Filterset zur Visualisierung von Leukozyten. Um eine Lungenarterie zu lokalisieren, verwenden Sie das FITC-Filterset, um ein Gefäß mit einem abweichenden Muster des Blutflusses zu identifizieren und ein 30-Sekunden-Video aufzunehmen. Wiederholen Sie die Aufnahme im selben Sichtfeld mit dem Rhodamin-Filterset zur Visualisierung von Leukozyten.Um die Kapillarregionen von Interesse zu lokalisieren, verwenden Sie das FITC-Filterset, um einen Bereich von Alveolen und Kapillaren zu identifizieren, der nicht von größeren Schiffen durchschnitten wird, und zeichnen Sie ein 30-Sekunden-Video auf. Wiederholen Sie die Aufnahme im selben Sichtfeld mit dem Rhodamin-Filterset zur Visualisierung von Leukozyten. Dieses Video zeigt FITC-Bildgebung des Blutflusses innerhalb eines Lungenortes, wie durch den grünen Pfeil angezeigt.Die Rhodamin-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung von Leukozyten am selben Ort mit zwei adhärenten Leukozyten, die durch die roten Pfeile gekennzeichnet sind. Diese Methoden wurden auch angewendet, um die gleichen Phänomene und Lungenarterien und Kapillarregionen von Interesse zu visualisieren. Um die Quantifizierung mikrozirkulatorischer Parameter zu demonstrieren, wurden Mäuse mit intranasalem LPS behandelt, um eine Lungenentzündung zu induzieren.Der Leukozytentransport in pulmonalen Zentren wird hier mit umrissenen Bereichen gezeigt, die die analysierten Endothelregionen bei naiven und LPS-behandelten Mäusen darstellen. Leukozytenadhäsion und -rollen waren bei LPS-behandelten Mäusen erhöht. Der Leukozytentransport in pulmonalen Arterien wird hier mit umrissenen Bereichen gezeigt, die die analysierten Endothelregionen bei naiven und LPS-behandelten Mäusen darstellen.Die Leukozytenadhäsion war bei LPS-behandelten Mäusen höher. Diese Abbildung zeigt die Leukozytenadhäsion in Lungenkapillaren bei naiven und LPS-behandelten Mäusen. Es wurde gezeigt, dass die Leukozytenadhäsion bei LPS-behandelten Mäusen höher war als bei naiven.Diese Abbildung zeigt die Perfusion von Lungenkapillaren bei naiven und LPS-behandelten Mäusen. Es wurde gezeigt, dass die funktionelle Kapillardichte bei LPS-behandelten Mäusen niedriger ist als bei naiven. Es gibt viele herausfordernde Aspekte dieses Protokolls.Die Optimierung der Positionierung der Maus auf der Plattform ist ein einfacher Schritt, der die chirurgischen und bildgebenden Schritte viel reproduzierbarer machen kann. Dieses Verfahren ist an eine Vielzahl von Studienparametern und Mikroskopieansätzen anpassbar. Daher sollte es die weitere Erforschung der pulmonalen Mikrozirkulation sowohl in gesunden als auch in kranken Zuständen erleichtern.

intravital-widefield-fluorescence-microscopy-pulmonary

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video demonstriert die intravitale Fluoreszenzmikroskopie-Technik zur Untersuchung der Thrombusbildung in einem Mausmodell. Der Maus wird ein mit Fluorophor markiertes Polysaccharid injiziert, um die Durchblutung zu überwachen. Bei Beleuchtung mit einem hochintensiven Licht führt die phototoxische Induktion einer Verletzung in den Mikrogefäßen des Ohrs zur Bildung eines Thrombus, was durch die Visualisierung der Obstruktion im Blutfluss bestätigt wird.

Intravitale Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der mikrovaskulären Thrombusbildung

Die isolierten durchbluteten Lungenpräparat macht es möglich, Mikrogefäßnetzwerken auf der Lungenoberfläche zu visualisieren. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Durchlässigkeit der einzelnen Mikrogefäße in isolierten Lungen quantifizieren mit Echtzeit-Fluoreszenz-Bildgebung.

Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung

Es wird eine Methode vorgestellt, um die mikrozirkulatorische Blutflussgeschwindigkeit bei Lungenkrebsmetastasen der Pleuraoberfläche bei Ratten automatisiert unter Verwendung der geschlossenen Lungen-Intravitalmikroskopie zu messen. Dieses Modell hat das Potenzial, als weit verbreitetes Werkzeug für die physiologische Forschung an Lungenmetastasen bei Nagetieren eingesetzt zu werden.

Automatisierte Messung der Mikrozirkulation Blutflußgeschwindigkeit in Lungenmetastasen von Ratten

Wir beschreiben ein relativ einfaches Verfahren zur ex vivo Echtzeit-Bildgebung der Tumorzell Stroma Wechselwirkungen innerhalb Lungenmetastasen unter Verwendung fluoreszierenden Reportern in Mäusen. Verwendung von Spinnplatten konfokale Mikroskopie, ermöglicht diese Technik Visualisierung von lebenden Zellen für mindestens 4 h und angepasst werden könnten andere entzündliche Lungenerkrankungen zu untersuchen.

Ex-vivo-Live-Imaging von Lungenmetastasen und deren Mikromilieu

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Multiphotonenmikroskopie zur Durchführung einer langfristigen hochauflösenden Einzelzellbildgebung der intakten Lunge in Echtzeit unter Verwendung eines vakuumstabilisierten Bildgebungsfensters.

Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster

In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur zwei-Photon intravitalen Bildgebung und Zelle Interaktionsanalyse in der murinen trachealen Schleimhaut nach Infektion mit Influenza-Virus führen. Dieses Protokoll wird für Forscher Immunzelle Dynamik bei Atemwegsinfektionen relevant sein.

Bildgebung Zelle Interaktion in Trachealen Schleimhaut während der Influenza-Virus-Infektion mit Intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie

Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht Charakterisierung von homing Lungenkapazität von primären menschlichen Lymphozyten unter in-vivo entzündlichen Erkrankungen. Pulmonale Infiltration der adoptively übertragenen menschlichen Immunzellen in einem Mausmodell der allergische Entzündung kann abgebildet und durch Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie von chemisch ausgeglichenen Lungengewebe quantifiziert werden.

Erweiterte Bildgebung der Lunge Homing menschlichen Lymphozyten in einem experimentellen In Vivo Modell der allergische Entzündung basierend auf Licht-Blatt Mikroskopie

Die Rekrutierung von Leukozyten und Blutplättchen stellt eine wesentliche Komponente dar, die für das effektive Wachstum von Kollateralarterien während der Arteriogenese notwendig ist. Die Multiphotonenmikroskopie ist ein effizientes Werkzeug zur Verfolgung der Zelldynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo und geringerer Phototoxizität, um die Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten während der Arteriogenese zu untersuchen.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem die transplantierte linke Lunge der Maus mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie intravital abgebildet werden kann. Dies stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die zelluläre Dynamik und Wechselwirkungen in Echtzeit nach einer Lungentransplantation von Mäusen zu untersuchen.

Intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie der transplantierten Mauslunge

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die intravitale Bildgebung einer abgeschwächten, BSL-2-zugelassenen Mycobacterium tuberculosis. Spannung in der Mauslunge unter Verwendung eines permanenten Lungenfensters. Dieser Ansatz ermöglicht eine longitudinale, einzelzellige Auflösungsanalyse früher Wirts-Pathogen-Interaktionen, einschließlich bacillärer Lokalisation, vaskulärer Dynamik und Makrophagenaufnahme innerhalb derselben Lungenmikroumgebung.

Intravitale Bildgebung der abgeschwächten auxotrophen Mycobacterium tuberculosis in der Mauslunge während früher intravaskulärer Infektion

Erfahren Sie die intravitale Fluoreszenzmikroskopie der pulmonalen Mikrozirkulation bei akuter Lungenschädigung. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung mit minimalem physischem Trauma.

Intravitale Weitfeldfluoreszenzmikroskopie der pulmonalen Mikrozirkulation bei experimenteller akuter Lungenschädigung mit einem vakuumstabilisierten Bildgebungssystem (Video) | JoVE Journal

Intravitale Weitfeldfluoreszenzmikroskopie der pulmonalen Mikrozirkulation bei experimenteller akuter Lungenschädigung mit einem vakuumstabilisierten Bildgebungssystem

Weitere Videos entdecken