Name: Massenaufzucht und molekulare Studien an Tortricidae-Schädlingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Lernen Sie Massenaufzucht und molekulare Studien an Tortricidae-Schädlingen. Diese Methode ermöglicht Geschlechtsbestimmung und Nukleinsäureextraktion für Hochdurchsatz-Sequenzierung.

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Die Autoren danken der Unterstützung durch die Forschungsstipendien der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) für junge Wissenschaftler [Fördernummer 19J13123 und 21J00895].

1. Insektensammlung und Massenaufzucht
<ol><li>Sammeln Sie tortricide Insekten von Feldern nach zuvor veröffentlichten Referenzen 8,12. HINWEIS: H. magnanima und A. honmai Larven werden aus beschädigten Teeblättern gesammelt (Abbildung 1A); Erwachsene werden mit tragbarem 4-W-UV-Licht (365 nm Wellenlänge, siehe Materialtabelle, Abbildung 1B) angezogen.</li>
	<li>Züchten Sie die gesammelten Larven (Abbildung 1C, D) einzeln mit einem Stück künstlicher Diät in einer 1/2-Unzen-Tasse für 2-3 Wochen bis zur Eklosion des Erwachsenen (Abbildung 1E, F). Bestätigen Sie das Geschlecht von Puppen und Erwachsenen durch morphologische Merkmale (Abbildung 1G, I).</li>
	<li>Verbinden Sie die Männchen und Weibchen in einer Plastikbox (30 cm x 20 cm x 5 cm) mit Eiablage-Eimassen auf einem Paraffinpapier (Abbildung 1J-L). Legen Sie ein Weibchen und zwei Männer in einen 120 ml Plastikbecher mit einem Stück Paraffinpapier, um eine Matriline zu etablieren. HINWEIS: Es ist wichtig, Falten auf dem Paraffinpapier zu machen. Für H. magnanima muss Paraffinpapier auf der Unterseite des Gehäuses sein. In der Zwischenzeit, für A. honmai, legen Sie ein Papier auf die Gehäuseobergrenze, um Eier zu sammeln (Abbildung 1L), da H. magnanima Eizellmasse auf der Oberseite von Teeblättern ist, aber A. honmai legt Eier auf die Unterseite der Blätter8. Die Verfahren wurden auch bei anderen Tortricid-Arten verifiziert, und es ist besser, Papiere auf beiden Seiten zu platzieren, wenn die Ökologie und das Verhalten der Zielarten ungeklärt sind.</li>
	<li>Die Eiermassen (ca. 100-200 Eier pro Eimasse12, Abbildung 1M) auf dem Paraffinpapier mit einer Schere ausschneiden. Legen Sie die Eier für 5-7 Tage in eine 1/2 Unze Tasse mit abgekipptem Papier. HINWEIS: Der gereifte Embryo weist eine Mitesserkapsel auf (Abbildung 1N). Die Perioden der Embryogenese werden unterschiedlich den Tortricid-Spezies zugeschrieben, aber im Allgemeinen 5 Tage nach der Eiablage (dpo) für H. magnanima und 4 dpo für A. honmai bei 25 ° C mit 60% relativer Luftfeuchtigkeit, 16 h hell / 8 h dunkle Zyklen7.</li>
	<li>Lagern Sie die Eiermassen, die Schwarzkopfkapseln zeigen, 7 Tage lang bei 4-8 ° C.</li>
	<li>Schneiden Sie ~ 60 g künstliche Diäten mit einer Reibe für die Massenaufzucht. Legen Sie die mit reifen Embryonen gefüllte Eimasse auf die in Scheiben geschnittene künstliche Diät in einen Plastikbehälter (23 cm x 16 cm x 8 cm). Legen Sie Paraffinpapiere mit den geschnittenen Diäten auf die Eimasse (Abbildung 10). HINWEIS: Unter 30% relative Luftfeuchtigkeit gilt als zu trocken, während über 70% zu feucht ist. Das Erzeugen von Löchern auf dem Deckel des Kunststoffbehälters ist besser, um eine bessere Belüftung zu ermöglichen. Füllen Sie die Löcher mit Baumwolle, um das Entweichen kleiner Larven zu verhindern.</li>
	<li>Um Oberflächenverunreinigungen aus den Eiern zu entfernen, tränken Sie die Eiermasse für 5 min bzw.12 Minuten in 3% Formalin und 0,2% ige Benzalkoniumchloridlösung. Um Darm- oder intrazelluläre Bakterien auszurotten, verwenden Sie eine künstliche Diät, die mit 0,05% (w / w) Tetracyclinhydrochlorid oder 0,06% (w / w) Rifampicin anstelle einer normalen künstlichen Diät ergänzt wird (siehe Tabelle der Materialien). HINWEIS: Dieser Schritt ist optional. Es ist wichtig, Silk Mate 2S und 0,05% (w/w) Tetracyclinhydrochlorid oder 0,06% (w/w) Rifampicin gleichmäßig für Konsistenz zu kneten.</li>
	<li>Sammeln Sie die Puppen aus dem Plastikbehälter und unterscheiden Sie das Geschlecht anhand vonmorphologischen 12 Merkmalen (Abbildung 1G-I). HINWEIS: Im Allgemeinen präsentieren Tortricide 5-6 Stadien bis zur Verpuppung12. Die Larven H. magnanima und A. honmai brauchen 3 Wochen bzw. 2 Wochen, nach dem Schlüpfen bis zur Verpuppung.</li>
	<li>Legen Sie 15 Männchen und 10 Weibchen in eine Plastikbox (30 cm x 20 cm x 5 cm, Abbildung 1K) zur Paarung mit 25 °C, 16 L/8 D. Sammeln Sie Eier pro 5-7 Tage und wiederholen Sie die Schritte 1.4-1.9. für jede Generation. HINWEIS: Wenn das Sammeln neu eiabgelegter Eimasse für die nachfolgende Analyse erforderlich ist, legen Sie den Beginn und das Ende der dunklen Periode fest, z. B. von 9 bis 17 Uhr. In diesem Zustand nehmen H. magnanima und A. honami normalerweise Eier nach 5 h (14 Uhr) oviposit auf.</li>
</ol>2. Trennung von Eiern und Pharatenlarven aus Eiermassen zur Fixierung, Permeabilisierung und Färbung
<ol><li>Die Eimasse in 1.000 μL 1,2% wässriger Natriumhypochloritlösung für 10 min oder in 1.000 μL 5 M Kaliumhydroxid-wässriger Lösung für 30 min einweichen, um die Eier zu trennen.</li>
	<li>Waschen Sie die getrennten Eier in 1.000 μL PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mMNa2HPO 4, 2,68 mM KCl, 1,47 mMKH2PO 4, 0,05% Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonolaurat [Tween-20] pH7,4, siehe Materialtabelle) nach dem zuvor veröffentlichten Bericht7.</li>
	<li>Eier in einer Mischung aus 500 μL 100% Heptan und 500 μL 4% Paraformaldehyd-PBSt-Lösung (w/v) einweichen. Mischen Sie für 10 Minuten bei 1.500 U / min mit einem Wirbelmischer.</li>
	<li>Die Eier in eine Mischung aus 500 μL 100% Heptan und 500 μL 100% Methanol einweichen. Mischen Sie für 10 min bei 1.500 U / min.</li>
	<li>Waschen Sie die Eier zweimal mit 1.000 μL 100% Methanol und lagern Sie sie bei 4 °C in 100% Methanol bis zu weiteren Experimenten (Abbildung 2A). HINWEIS: Die Eier können mindestens 1 Jahr bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>Weichen Sie die Eier nacheinander in 99%, 70%, 50% Ethanol und PBSt für jeweils 5 Minuten zur Hydrophilisierung nach dem zuvor veröffentlichten Bericht7 ein.</li>
	<li>Waschen Sie die Eier mit PBSt, tauchen Sie die Eier für 5 min in 1 μg / ml DAPI-Lösung und waschen Sie die Eier dann zweimal mit 1x PBS. Die Eier in 20 μL 1,25% (w/w) Milch-Essigsäure-Orceinlösung (siehe Materialtabelle)11 einweichen, um Heterochromatin zu visualisieren, bis die Kerne eine leuchtend rote Farbe aufweisen (dies variiert von 5-60 min) (Abbildung 2B,C). HINWEIS: Die Milch-Essigsäure-Orcein-Färbeperioden hängen von Temperatur und Luftfeuchtigkeit ab. Es ist besser, die richtige Färbung mit einem Mikroskop mit 4x-10-facher Vergrößerung zu überprüfen.</li>
	<li>Die gefärbten Eier mit einer Pipette auf einen Glasschieber geben. Umschließen Sie die gefärbten Eier mit Antifade-Reagenz (siehe Materialtabelle) und einem Deckglas7.</li>
	<li>Extrahieren Sie die Larven von Pharat H. magnanima und A. honmai (4-5 Tage nach der Eiablage (dpo)) aus den Eiermassen mit einer Pinzette (Abbildung 2D). Bisect Larven auf einem Glasobjektträger (Abbildung 2E).</li>
	<li>Fixieren Sie alle Gewebe (z. B. Ganglion subösophageales, Thoraxganglien, Malpich-Tubuli usw.) mit einer Mischung aus 1:3 (v/v) 99,7% Essigsäure/100% Methanol für 5 min. Färben Sie diejenigen mit 1,25% (w/w) Milch-Essigsäure-Orceinlösung11 , bis die Kerne gefärbt sind (dies kann 5-60 Minuten dauern, abhängig von der Temperatur und Luftfeuchtigkeit).</li>
	<li>Bestimmen Sie das Geschlecht jeder Probe, indem Sie das Vorhandensein (weiblich) oder Fehlen (männlich) von Heterochromatin (das W-Chromosom, Abbildung 2F, G) unter einem Mikroskop beobachten. HINWEIS: Das Geschlecht wird durch die Visualisierung des Geschlechtschromatins bestimmt. Jede Zelle stellt das Geschlechtschromatin als Punkt bei Frauen 11,12 dar, während der verbleibende Teil des Pharatenlarvengewebes (nicht fixiert) sofort in Zelllysepuffer 12 (10 mM Tris-HCl,100 mM EDTA und 1% SDS, pH 8,0) oder phenolhaltige RNA-Extraktionsreagenzien für die DNA- oder RNA-Extraktion eingetaucht werden sollte. Vor den Dissektionen 20 μL der Reagenzien im Voraus in 0,2 ml PCR-Röhrchen dosieren (Abbildung 3A). Tauchen und lagern Sie die Proben bei -80 °C bis zur weiteren Extraktion. Die Proben können mindestens 3 Monate gelagert werden, aber es ist besser, mit den nachgeschalteten Experimenten fortzufahren, um den Abbau von Nukleinsäuren zu verhindern.</li>
</ol>3. DNA- und RNA-Extraktionen aus geschlechtsspezifischen Pharatenlarven
<ol><li>Pool 12 geschlechtsspezifische männliche oder weibliche Pharatenlarven (5 dpo Embryo) und entweder Zelllysepuffer oder RNA-Extraktionsreagenzien (siehe Schritt 2.11 und Tabelle der Materialien) in ein 1,5 ml Röhrchen geben. HINWEIS: Befolgen Sie die Schritte 3.2-3.7 für die DNA-Extraktion und die Schritte 3.8-3.11 für die RNA-Extraktion.</li>
	<li>Homogenisieren Sie das Gewebe in 600 μL des Zelllysepuffers (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA und 1% SDS, pH 8,0) und zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Sammeln Sie den Überstand (500 μL) mit einer Pipette und inkubieren Sie bei 50 °C mit 1,5 μL Proteinase K (20 mg/ml, siehe Materialtabelle) für 5 h auf einem Heizblock.</li>
	<li>Behandeln Sie die Proben mit 1,0 μL 10 mg/ml RNase-Lösung (siehe Materialtabelle) bei 37 °C für 30 min.</li>
	<li>200 μL Proteinfällungslösung (siehe Materialtabelle) in die Röhrchen7 geben, gefolgt von einer Zentrifuge bei 17.000 x g für 10 min bei 4 °C.</li>
	<li>Mischen Sie den Überstand (500 μL) mit 500 μL 100% Isopropanol und zentrifugieren Sie dann bei 20.400 x g für 10 min bei 4 °C.</li>
	<li>Waschen Sie die pelletierte DNA zweimal mit 1.000 μL 70% Ethanol. Dann an der Luft trocknen (5-10 min bei Raumtemperatur), lösen Sie die DNA in 30 μL 10 mM Tris-Cl-Puffer (pH 8,5) auf.</li>
	<li>Homogenisieren Sie das Gewebe in 600 μL RNA-Extraktionsreagenzien und fügen Sie 240 μL ultrareines destilliertes Wasser in die Tube hinzu. Zentrieren Sie die Röhrchen bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C.</li>
	<li>Mischen Sie den Überstand (600 μL) mit 600 μL 100% Isopropanol und übertragen Sie das Gemisch auf eine Silica-Spinsäule (siehe Materialtabelle). Die Röhrchen bei 17.900 x g für 1 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule mit 750 μL 70% Ethanol und zentrifugieren Sie die Säule zweimal bei 17.900 x g für jeweils 1 min bei 4 °C.</li>
	<li>Laden Sie 15 μL ultrareines destilliertes Wasser in die Säule. Zentrieren Sie die Röhrchen bei 17.900 x g für 1 min bei 4 °C, um die RNA zu eluieren.</li>
	<li>Berechnen und verifizieren Sie die Qualität und Quantität von DNA und RNA mit einem UV-basierten Spektralphotometer. Beurteilen Sie die Reinheit von Nukleinsäuren unter Verwendung der Verhältnisse A260/A280 (Nukleinsäuren/Protein) und A260/A230 (Nukleinsäuren/Salze und andere Verunreinigungen)13. HINWEIS: Für die RNA-Extraktion wurde das zuvor veröffentlichte Verfahren12 befolgt, das zu einer Phenolkontamination führte (Tabelle 1). Die extrahierte DNA und RNA aus einem einzelnen Embryo oder einer Rastratlarve liefert Proben mit geringer Menge und geringer Qualität. Typischerweise ergibt die DNA-Extraktion aus 12 Pharatarven 100-600 ng, während die RNA-Extraktion mit der aktuellen Methode 900-1.500 ng erzeugt, wie in Tabelle 1 gezeigt. HINWEIS: Die Schritte 3.13-3.15 sind für weitere Assays von Hochdurchsatz-Sequenzierungen optional.</li>
	<li>Berechnen Sie die Mengen an DNA und RNA mit einem fluoreszenzbasierten Spektralphotometer. HINWEIS: Das Verhältnis der RNA-Mengen (UV-basierte Konzentration (ng/μL)/fluoreszenzbasierte Konzentration (ng/μL)) wurde berechnet, um die Qualität für die weitere experimentelle Anwendung zu beurteilen. Wenn beispielsweise UV- und fluoreszenzbasierte Konzentrationen 80 ng / uL bzw. 60 ng / uL betragen, beträgt das Verhältnis 1,5 (80/60). In der Regel weisen Verhältnisse unter 1,5 auf eine ausreichende Reinheit für nachgelagerte Anwendungen mit Hochdurchsatzsequenzierung13 hin.</li>
	<li>Analysieren Sie die Qualität der RNA mit Hilfe der Mikrochip-Elektrophorese14.</li>
	<li>Verwenden Sie die qualifizierten RNAs, um die RNA-Bibliothek mit einem RNA-Bibliotheksvorbereitungskit vorzubereiten (siehe Materialtabelle). Sequenzieren Sie die Bibliotheken mit einer Plattform, die für die vorbereiteten Bibliotheken geeignet ist.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Tortricid umfasst mehrere land- und forstwirtschaftliche Schädlinge; Die vorliegende Studie präsentierte Methoden zur Aufzucht von Tortrix über Generationen, zur Beobachtung der Embryogenese und des Geschlechts der Insekten und zur Durchführung molekularer Analysen mit reifen Embryonen.
Eines der Hindernisse für die Schädlingsinsektenforschung ist die Etablierung von Aufzuchtmethoden. Vor allem Inzucht wirkt sich manchmal negativ auf die Fitness der Art aus. Die Fitnessverringerung durch die I...

Lepidoptera-Insekten machen mehr als 10% aller beschriebenen lebenden Artenaus 1, und bestimmte Taxaarten verursachen schwere Schäden an Pflanzen und schwere landwirtschaftliche Verluste 2,3. Obwohl molekulare und genetische Studien mit Modellinsekten wie der Seidenraupe Bombyx mori4,5 entwickelt wurden, bleiben Schädlingsinsekten unerforscht, teilweise wegen der Schwierigkeiten bei der Aufzucht und Handhabung 6,7. Daher sind grundlegende Studien und Techniken notwendig, um die Biologie solcher Nicht-Modell-Schädlingsinsekten zu verstehen.
Die Tortricidae (Lepidoptera), allgemein bekannt als Tortrix oder Blattwickler, umfassen viele land- und forstwirtschaftliche Schädlinge8. Von den Insektentaxa sind die orientalische Teetortrix Homona magnanima Diakonoff und die Sommerfruchttortrix Adoxophyes honmai Yasuda schwere polyphage Schädlinge, von denen bekannt ist, dass sie Teebäume in Ostasien schädigen7. Die beiden Arten legen flache und ovale schuppenartige Eierhaufen (oder Eiermassen), die aus dünnen, weichen und zerbrechlichen Eiern bestehen, die von mütterlichen Sekreten bedeckt sind. Obwohl Embryogenesestadien für die Insektenentwicklung und die Geschlechtsbestimmung entscheidend sind9, verhindern Strukturen der Eier, dass weitere Analysen die Biologie der Insekten verstehen. Es ist wichtig, die Schwierigkeiten für weitere Studien über Schädlinge, die eine solche komplexe Eimasse ovipositieren, zu überwinden.
Um die Biologie der Tortricide zu verstehen, wurden Methoden zur Massenaufzucht, Beobachtungen und molekularen Studien mit A. honmai und H. magnanima entwickelt. Erstens erhalten Massenaufzuchtmethoden beide Tortrizide über 100 Generationen nach Inzucht. Die Trennung der Eier von der verketteten, schuppenartigen Eimasse erleichterte die embryonale Beobachtung der Tortricide mit alkalischen und organischen Lösungsmitteln, die zuvor aus Techniken entwickelt wurden, die bei Fliegen10 verwendet wurden. Darüber hinaus stellte die vorliegende Studie die geschlechtsspezifische Diskriminierung kleiner Embryonen fest, indem sie Färbemethoden für das Geschlechtschromatin von Lepidoptera-Weibchen unter Verwendung von Milch-Essig-Orcein11 entwickelte. Durch die Kombination dieser Methoden wurden qualitativ hochwertige und quantitative Nukleinsäuren aus geschlechtsbestimmten Embryonen extrahiert, was ansonsten schwer zu etablieren war6. Die extrahierte RNA wurde für die Sequenzierung der nächsten Generation verwendet. Insgesamt gelten die hier vorgestellten Methoden für andere Lepidoptera-Insekten und andere Insektentaxa.

<table><tbody><tr><td>1/2 Unze Tasse</td><td>FP CHUPA</td><td>CP070009</td><td>Insektenzucht;</td></tr> <tr><td>https://www.askul.co.jp/p/6010417/ 1/2 Unze Becherdeckel</td><td>FP CHUPA</td><td>CP070011</td><td>Insektenzucht; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether</td></tr><tr><td>99,7% Essigsäure</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>36289</td><td>Fixierung; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalysator</td><td>Agilent Technologies</td><td>nicht dargestellt</td><td>Quantifizierung von Nukleinsäuren; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument</td></tr><tr><td>Agilent RNA6000 Nanokit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td>Quantifizierung von Nukleinsäuren; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG .pdf</td></tr><tr><td>Benzalkoniumchlorid-Lösung</td><td>Nihon Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>Nr.4987123116046</td><td>Sterilisation; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html</td></tr><tr><td>Cotton</td><td>AOUME</td><td>8-1611-02</td><td>Insektenzucht; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1</td></tr><tr><td>DAPI-Lösung</td><td>Dojindo, Tokio, Japan</td><td>340-07971</td><td>Färbungen; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/</td></tr> <tr><td>Dinatriumhydrogenphosphat</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html</td></tr><tr><td>dsDNA HS-Quantifizierungskit</td><td>Invitrogen</td><td>Q33231</td><td>Quantifizierung von Nukleinsäuren; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230</td></tr><tr><td>Econospin RNA II-Säule</td><td>Epoch Life Science Inc.</td><td>EP-11201</td><td>RNA-Extraktion; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>4.98748E+12</td><td>Fixierung; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html</td></tr><tr><td>Ethylendiamin-N,N,N',N'-Tetraessigsäure Tetranatriumsalztetrahydrat (4NA)</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Zelllysepuffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html</td></tr><tr><td>Pergaminpapier</td><td>HEIKO</td><td>2100010</td><td>die Insektenzucht; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla&amp; utm_medium=cpc& utm_source= Adw</td></tr><tr><td>Heizblock WSC-2620 PowerBLOCK</td><td>ATTO, Tokio, Japan</td><td>4002620</td><td>Inkubation; https://www.attoeng.site/</td></tr> <tr><td>heptan</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>4.98748E+12</td><td>Fixierung; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html</td></tr><tr><td>INSECTA LF</td><td>Nosan Co., Ltd</td><td>nicht gezeigt</td><td>Künstliche Nahrung; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm</td></tr><tr><td>ISOGENII</td><td>Nippon Gene</td><td>311-07361</td><td>RNA-Extraktion; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>Extraktion von 4.98748E+12</td><td>Nukleinsäuren; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html</td></tr><tr><td>Milchsäure</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Färbemittel; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>4.98748E+12</td><td>Fixierung; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html</td></tr><tr><td>MSV-3500 Vortex</td><td>Biosan</td><td>BS-010210-TAK</td><td>Voltex Mischer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/</td></tr><tr><td>Nano Photometer NP 80</td><td>Implen</td><td>nicht gezeigt</td><td>Quantifizierung von Nukleinsäuren; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/</td></tr> <tr><td>Natürliches Rudel breit</td><td>Inomata Chemikalie</td><td>1859</td><td>Insektenzucht; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3% 82%A4%E3%83%89</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit für Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7770S</td><td>Bibliotheksvorbereitung; https://www.nebj.jp/products/detail/2039</td></tr><tr><td>Orcein</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Flecken; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>160-16061</td><td>Fixierung; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html</td></tr><tr><td>Polyoxyethylen(20)-Sorbitanmonolaurat</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html</td></tr><tr><td>Tragbares UV-Schwarzlicht (4W, 365nm Wellenlänge)</td><td>Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan</td><td>nicht gezeigt</td><td>Insektensammlung; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html</td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Eindeckmittel</td><td>Invitrogen, MA, USA</td><td>P36965</td><td>Antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965</td></tr><tr><td>Proteinase K Lösung</td><td>Merck</td><td>71049-4CN</td><td>DNA-Extraktion; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049</td></tr><tr><td>Proteinfällungslösung</td><td>Qiagen</td><td>158912</td><td>DNA-Extraktion; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC</td></tr><tr><td>Qubit V4</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>Quantifizierung von Nukleinsäuren; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>4.98748E+12</td><td>Sterilisation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html</td></tr><tr><td>RNA HS-Quantifizierungskit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32855</td><td>Quantifizierung von Nukleinsäuren; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852</td></tr><tr><td>RNase-Lösung</td><td>Nippon Gene</td><td>313-01461</td><td>RNA-Extraktion; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html</td></tr><tr><td>Silk Mate 2S</td><td>Nosan Co., Ltd</td><td>nicht gezeigt</td><td>Künstliche Ernährung; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Zelllysepuffer (SDS);</td></tr><tr><td>wässrige Natriumhypochloritlösung</td><td>https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>4.98748E+12</td><td>Trennung von Eiern; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html</td></tr><tr><td>Tetracyclinhydrochlorid</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td><td>4.98748E+12</td><td>Sterilisation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Puffer für die Zelllyse; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html</td></tr><tr><td>hochreines destilliertes Wasser</td><td>Invitrogen</td> 10977023 <td>RNA-Extraktion; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015</td><td></td></tr></tbody></table>

massenaufzucht und molekulare studien an tortricidae-schädlingen

Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects

Tortricidae (Lepidoptera), allgemein bekannt als Tortrix oder Blattwickler, umfassen viele land- und forstwirtschaftliche Schädlinge, die schwere landwirtschaftliche Verluste verursachen. Um die Biologie solcher Schädlingsmotten zu verstehen, waren grundlegende Techniken sehr gefragt. Hier werden Methoden zur Massenaufzucht, Beobachtungen und molekulare Studien mit zwei Teetortrix, Homona magnanima und Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae), entwickelt. Insekten wurden mit in Scheiben geschnittener künstlicher Nahrung massenhaft gezüchtet und durch Inzucht über 100 Generationen unter Berücksichtigung ihrer biologischen Eigenschaften aufrechterhalten. Insekten haben verschiedene Geschlechtsdimorphismen; Daher ist es schwierig, das Geschlecht während der Entwicklungsstadien zu unterscheiden, die nachfolgende Assays verhindert haben. Die vorliegende Arbeit hob hervor, dass das Geschlecht von Tortricidenlarven durch die Beobachtung von Hoden oder Milch-Essigsäure-Orcein-Färbung bestimmt werden konnte, um das frauenspezifische W-Chromosom zu visualisieren. Darüber hinaus ermöglichte die vorliegende Studie unter Verwendung der Geschlechtsbestimmungsmethoden Nukleinsäureextraktionen aus geschlechtsbestimmten Embryonen und die Anwendung auf Hochdurchsatzsequenzierung. Diese Tipps sind für andere Schadinsekten anwendbar und erleichtern weitere morphologische und genetische Studien.

Einrichtung von Wirtsstrecken und deren Instandhaltung Die Lebensfähigkeit von Feldsammellarven wird unterschiedlich dem Standort des Feldes, den Jahreszeiten und den Aufzuchtbedingungen zugeschrieben (z. B. 90% der Lebensfähigkeit in Taiwan, Taoyuan, wie in Arai et al.12 gezeigt). Ungefähr 30% -50% der Paare werden wie gewohnt die nächste Generation erzeugen. Für H. magnanima und A. honmai werden Matriline seit über 100 Generationen durch Inzucht aufrechterha...

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Aufzuchtmethode von tortriciden Schädlingsinsekten in den Laboratorien. Die Verfahren zur Unterscheidung des Geschlechts von Insekten und zum Extrahieren von Nukleinsäuren für die Hochdurchsatzsequenzierung werden unter Verwendung von zwei Tortricid-Schädlingen festgelegt.

Massenaufzucht und molekulare Studien an Tortricidae-Schädlingen

Tortricidae (Lepidoptera), commonly known as tortrix or leafroller moths, comprises many agricultural and forestry pests, which cause serious agricultural ...

Wir präsentieren grundlegende, aber sehr gefragte Massen für Massenaufzucht, Beobachtungen und molekulare Studien mit ernsthaften Schädlings-Tortrix-Massen, um ihre Biologie zu studieren. Bisher hat die Struktur der Insekteneier eine weitere Analyse verhindert. Insbesondere ermöglichten wir die Untersuchung dünner, weicher und zerbrechlicher Eier, die mit mütterlichem Sekret bedeckt waren.Es gibt einfache Techniken, von denen erwartet wird, dass sie für die weitere Erforschung von Tortrix, das Ausprobieren anderer Insekten und anderer Taxa anwendbar sind. Beginnen Sie, indem Sie eine Frau und zwei Männer in einen 120-Milliliter-Plastikbecher mit einem Stück Paraffinpapier legen, um eine Matra-Linie zu etablieren. Schneiden Sie etwa 60 Gramm künstliche Diäten mit einer Reibe für die Massenaufzucht.Legen Sie die mit reifen Embryonen gefüllte Eimasse auf die in Scheiben geschnittene künstliche Diät in einen Plastikbehälter. Legen Sie Paraffinpapiere mit den geschnittenen Diäten auf die Eiermasse. Legen Sie 15 Männchen und 10 Weibchen in eine Plastikbox zur Paarung bei 25 Grad Celsius.Sammeln Sie alle fünf bis sieben Tage Eier und wiederholen Sie die Massenaufzuchtschritte für jede Gen

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Um die Unterdrückung der Population von Aedes aegypti mit dem RIDL-® (Freisetzung von Insekten, die ein dominantes Lethal-System tragen) zu erreichen, muss eine große Anzahl männlicher Mücken freigesetzt werden. Dies erfordert den Einsatz von Techniken und Technologien für die Massenaufzucht, um zuverlässige Systeme bereitzustellen, um die maximale Anzahl hochwertiger männlicher Mücken zu erhalten.

Massenproduktion von gentechnisch veränderten Aedes aegypti für Feldfreisetzungen in Brasilien

Protokolle für die effiziente Herstellung von homogenen Proben von Spinnmilben, Befall der Versuchspflanzen und Bewertung von Pflanzenschäden, wie für Studien der Pflanzenschädlingseingriff erforderlich entwickelt.

Die Anwendung der Zwei-Spinnmilbe<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; Für Plant-Schädlingsinteraction Studies

Hier präsentieren wir Protokolle für die Aufzucht eines intermediären Keimkäfers, Dermestes maculatus (D. maculatus) im Labor. Wir teilen auch Protokolle für embryonale und elterliche RNAi und Methoden zur Analyse embryonaler Phänotypen, um die Genfunktion bei dieser Spezies zu untersuchen.

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer, Dermestes maculatus

Abbilden der Morphogenese von Insekten Embryonen mit Lichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskopie wurde Stand der Technik geworden. Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht drei Befestigungstechniken geeignet für Tribolium castaneum Embryonen führt zwei neue maßgeschneiderte transgenen Linien gut geeignet für die Echtzeit- Bildgebung, diskutiert wesentliche Qualitätskontrollen und zeigt den aktuellen experimentellen Beschränkungen.

Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embry

Sterbetafeln Quantifizierung der Quellen und Rate von Sterblichkeit in Insektenpopulationen ermöglichen und dazu beitragen, zu verstehen, vorherzusagen und Populationsdynamik in Agrarökosystemen zu manipulieren. Methoden für die Durchführung und Auswertung der Kohorte-basierte Sterbetafeln im Feld für ein Insekt mit Traubeneichen unreifen Lebensphasen werden vorgestellt.

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Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht, Mikroinjektion von Eiern und für eine effiziente Paarung des Feuerbres Thermobia domestica zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme nach der Genombearbeitung.

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Hier wird ein Protokoll der Helicoverpa armigera (Hübner) Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutantenidentifizierung vorgestellt, das durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing erstellt wurde. Mutierte Insekten ermöglichen die weitere Erforschung der Genfunktion und Interaktion zwischen verschiedenen Genen in vivo.

Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutanten-Identifizierung von CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Dieses Papier beschreibt grundlegende Methoden zur Standardisierung wichtiger Faktoren wie Dichte, Futterverfügbarkeit, Hydratationsquelle und Umweltkontrollen für die langfristige Aufzucht von Laborkulturen der essbaren Grille Gryllus bimaculatus.

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Das Protokoll demonstriert eine einfache und leichte Seziermethode, die für wandernde Wildtyp-Insekten geeignet ist, die mit Suchscheinwerferfallen gefangen wurden. Diese Technik kann die gleiche Art signifikant aufklären, indem beide Fortpflanzungsgewebe verglichen werden, nämlich die Paarungssack- und Eierstockentwicklung von Wildtyp-Weibchen.

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Isolierung, Verhaltensidentifikation und Pathogenitätsbewertung von entomopathogenen Pilzen aus einem Waldholzbohrer

Lernen Sie Massenaufzucht und molekulare Studien an Tortricidae-Schädlingen. Diese Methode ermöglicht Geschlechtsbestimmung und Nukleinsäureextraktion für Hochdurchsatz-Sequenzierung.

Massenaufzucht und molekulare Studien an Tortricidae-Schädlingen

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