Name: Etablierung von Zebrafisch-Xenotransplantaten aus Bauchspeicheldrüsenkrebs für Chemosensitivitätstests (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Erfahren Sie die Etablierung von Zebrafisch-Patienten-xenotransplantaten zur Vorhersage der Chemosensitivität bei Bauchspeicheldrüsenkrebs. Diese Methode erhält das Tumormikromilieu und ermöglicht personalisierte Behandlungsentscheidungen.

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Diese Arbeit wurde von der Fondazione Pisa gefördert (Projekt 114/16). Die Autoren danken Raffaele Gaeta von der Abteilung für Histopathologie der Azienda Ospedaliera Pisana für die Auswahl der Patientenproben und die Unterstützung bei der Pathologie. Wir danken auch Alessia Galante für die technische Unterstützung bei den Experimenten. Dieser Artikel basiert auf der Arbeit von COST Action TRANSPAN, CA21116, unterstützt von COST (European Cooperation in Science and Technology).

Das italienische Gesundheitsministerium genehmigte alle beschriebenen Tierversuche in Übereinstimmung mit der Richtlinie 2010/63/EU über die Verwendung und Pflege von Tieren. Die lokale Ethikkommission genehmigte die Studie unter der Registrierungsnummer 70213. Von allen beteiligten Probanden wurde eine informierte Einwilligung eingeholt. Vor dem Start sollten alle Lösungen und die Ausrüstung vorbereitet werden (Abschnitt 1) und die Fische gekreuzt werden (Abschnitt 2).
1. Vorbereitung von Lösungen und Geräten
HINWEIS: In Tabelle 1 finden Sie die Lösungen und Medien, die vorbereitet werden müssen.
<ol><li>Unterstützung von Agarose-Gel<ol><li>Wiegen Sie das Agarosepulver in einem mikrowellengeeigneten Kolben ab und lösen Sie es in einem bestimmten Volumen E3-Zebrafischmedium auf, um ein 1%iges Gel herzustellen. In der Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat. Anmerkungen: Überkochen Sie die Lösung nicht.</li>
		<li>Gießen Sie die geschmolzene Agarose in eine Petrischale und warten Sie, bis das Gel vollständig erstarrt ist.</li>
		<li>Machen Sie kleine Agarosezylinder (~5 mm hoch) mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff mit abgeschnittener Spitze. Nach der Zubereitung in einer in Alufolie gewickelten Petrischale bei 4 °C lagern.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikronadeln aus Glas<ol><li>Ziehen Sie die Kapillaren aus Borosilikatglas mit einem Abzieher, um feine Nadeln zu erhalten (Einstellungen: HEAT 990, PULL 550). HINWEIS: Aus einer Kapillare können zwei feine Nadeln mit einem Spitzendurchmesser von 10 μm gewonnen werden.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fischkreuzung und Eiersammlung
<ol><li>Übertragen Sie erwachsene Fische 3 Tage vor der Gewebeimplantation in Aufzuchtbecken, wie von Avdesh et al.17 beschrieben.</li>
	<li>HINWEIS: Ein Verhältnis von 1:1 oder 2:3 von Männern zu Frauen wird empfohlen. Die Fischdichte sollte maximal fünf Fische pro Liter Wasser betragen. Halten Sie Männchen und Weibchen über Nacht mit einer Barriere getrennt.</li>
	<li>Entfernen Sie am nächsten Tag die Barriere und lassen Sie die Fische sich paaren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Fische aus den Zuchtbecken und bringen Sie sie in ihre Haltungsbecken zurück.</li>
	<li>Gießen Sie das Wasser aus dem Aufzuchtbecken durch ein feinmaschiges Netz. Übertragen Sie die befruchteten Eier in eine Petrischale mit E3-Zebrafischmedium.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Petrischale mit einem Stereomikroskop und entsorgen Sie die trüben Eier. Bewahren Sie die befruchteten Eier in frischem E3-Zebrafischmedium bei 28 °C auf.</li>
</ol>3. Probensammlung
Anmerkungen: Autoklavenzange und Skalpellgriff.
<ol><li>Sofortige Bearbeitung<ol><li>Die chirurgische Probe des Tumors wird in 10 ml Tumormedium bei 4 °C (Tumorprobe mit einem Durchmesser von 5 mm bis 10 mm) entnommen. Übertragen Sie die Probe bei 4 °C von der gewünschten Stelle zur sofortigen Verarbeitung.</li>
	</ol></li>
	<li>Lagerung über Nacht (optional)<ol><li>Sammeln Sie die chirurgische Tumorprobe in 10 ml Tumormedium und lagern Sie die Probe über Nacht bei 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Lagerung bei -80 °C (optional, am wenigsten empfohlen)<ol><li>Lagern Sie die Probe bei -80 °C in einem kryogenen Fläschchen mit Tumormedium, das mit 5 % Dimethylsulfoxid (DMSO) angereichert ist.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Probenverarbeitung
Anmerkungen: Führen Sie die Schritte unter einer sterilen Gewebekultur-Laminar-Flow-Haube durch.
<ol><li>Waschen Sie das gesamte Tumorgewebe mit 5 ml frischem Tumormedium und pipettieren Sie 10x mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff auf und ab. Saugen Sie das Waschmedium ab und entsorgen Sie es. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x. Anmerkungen: Vermeiden Sie eine Aspiration des Tumorgewebes, da es an der Pasteurpipette aus Kunststoff haften bleiben könnte.</li>
	<li>Die Probe wird in eine Petrischale überführt und in 1-2 ml frisches Tumormedium getaucht. Schneiden Sie die Tumorprobe mit einer Skalpellklinge in kleine Stücke (1-2 mm3) und legen Sie sie in ein steriles 5-ml-Kunststoffröhrchen mit Tumormedium.</li>
	<li>Stellen Sie den McIlwain-Taschenhäcksler auf eine Dicke von 100 μm ein. Legen Sie die Probenfragmente auf den runden Plastiktisch des Häckslers und hacken Sie sie. Drehen Sie den Tisch um 90° und wiederholen Sie das Hacken.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Fragmente bei 300 × g für 3 Minuten. Saugen Sie dann den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Fragmente mit einem fluoreszierenden Zelltracker, CM-DiI (Endkonzentration von 10 μg/ml in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung [DPBS]), Deep Red (Endkonzentration von 1 μl/ml in DPBS) oder CellTrace (Endkonzentration von 5 μM in DPBS) für 30 Minuten und legen Sie das Röhrchen in ein 37 °C warmes Wasserbad.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Fragmente, indem Sie alle 10 Minuten vorsichtig auf und ab pipettieren. HINWEIS: Im Falle von CellTrace fügen Sie am Ende der Inkubation gemäß den Anweisungen des Herstellers ein Medium hinzu, das mindestens 1 % Protein enthält.</li>
	<li>Bei 300 x g 3 min zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x mit 1 ml DPBS, um nicht eingearbeiteten Farbstoff zu entfernen.</li>
	<li>Suspendieren Sie die Fragmente in 5 ml DPBS in einer 60-mm-Petrischale. HINWEIS: Achten Sie darauf, dass das Gewebe nicht austrocknet.</li>
</ol>5. Etablierung von zPDX
Anmerkungen: Führen Sie die Schritte unter einer sterilen Gewebekultur-Laminar-Flow-Haube durch.
<ol><li>Betäuben Sie die Embryonen 2 Tage nach der Befruchtung (dpf) mit 0,16 mg/ml Tricain in E3-Zebrafischmedium.</li>
	<li>Legen Sie drei Agarosezylinder (Schritt 1.1.3) in eine Petrischale und legen Sie einen Zebrafischembryo auf einen Zylinder, wobei Sie eine Seite freilegen. Entfernen Sie die überschüssige Lösung, um den Embryo in einem dünnen Film zu halten.</li>
	<li>Übertragen Sie das gefärbte Gewebestück mit einer sterilen Pinzette aus der Petrischale auf den 1%igen Agaroseträger, auf dem der Embryo liegt. Nehmen Sie das Gewebe auf, legen Sie es auf das Embryonalgelb und schieben Sie es dann mit der wärmegezogenen Glasmikronadel in den perivitellinen Raum (Schritt 1.2.1).</li>
	<li>Geben Sie vorsichtig einige Tropfen E3 1% Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptokokken) in den Embryo, um ihn wieder in die Flüssigkeit zu bringen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 5.2-5.4 für alle Embryonen, entfernen Sie schließlich die Agarosestützen aus der Petrischale und inkubieren Sie die Embryonen bei 35 °C.</li>
	<li>Kontrollieren Sie die Embryonen 2 h nach der Implantation mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop auf die richtigen Xenotransplantate (positive Färbung). Verwerfen Sie die Embryonen mit Tumorfragmenten, die sich nicht vollständig im perivitellinen Raum befinden, sowie die toten Embryonen. Verteilen Sie die Embryonen nach dem Zufallsprinzip auf sechs Multi-Well-Platten (maximal n = 20 Embryonen/Well), die gemäß dem Versuchsplan gleichmäßig in Gruppen aufgeteilt werden (z. B. Kontrolle und FOLFOXIRI).</li>
</ol>6. Behandlung
<ol><li>Verdünnen Sie das Arzneimittel (z. B. 5-Fluorouracil, Oxaliplatin, Irinotecan) in E3 1% Pen-Streptokokken und mischen Sie es gründlich, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. Wie von Usai et al.12 vorgeschlagen, verwenden Sie eine fünffache Verdünnung des Arzneimittels im Fischwasser in Bezug auf die äquivalente Plasmakonzentration (EPC).</li>
	<li>Mischen Sie die Drogen, um den Cocktail zuzubereiten (z. B. FOLFOXIRI).</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie den Medikamentencocktail 2 Stunden nach der Implantation hinzu.</li>
	<li>Behandeln Sie die Embryonen 3 Tage lang. Erneuern Sie den Drogencocktail jeden Tag.</li>
</ol>7. Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung
Anmerkungen: Bevor Sie beginnen, stellen Sie Aceton auf -20 °C ein und bereiten Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Lösungen vor.
<ol><li>Tag 1:<ol><li>Fixieren Sie die Larven mit 1 ml 4%igem Paraformaldehyd in Glasfläschchen bei 4 °C über Nacht.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 2:<ol><li>Waschen Sie die Larven 3 x 5 min mit 1 ml PBS unter leichtem Rühren auf einer Laborplattformwippe (400 U/min).</li>
		<li>In 1 ml 100%igem Methanol bei -20 °C über Nacht lagern (oder zur Langzeitlagerung).</li>
		<li>Rehydrieren Sie 3 x 10 min mit 1 ml PTw (0,1 % Tween in PBS) unter leichtem Rühren auf einer Laborplattformwippe (400 U/min).</li>
		<li>Permeabilisieren Sie mit 1 ml 150 mM Tris-HCl bei pH 8,8 für 5 min bei RT, gefolgt von einer Erhitzung für 15 min bei 70 °C.</li>
		<li>2 x 10 min mit 1 ml PTw unter leichtem Rühren auf einer Laborpodestwippe (400 U/min) waschen.</li>
		<li>2 x 5 min mit 1 ml dH2O unter leichtem Rühren auf einer Labortischwippe (400 U/min) waschen.</li>
		<li>Mit 1 ml eiskaltem Aceton für 20 min bei -20 °C permeabilieren.</li>
		<li>2 x 5 min mit 1 ml dH2O unter leichtem Rühren auf einer Labortischwippe (400 U/min) waschen.</li>
		<li>2 x 5 min mit 1 ml PTw unter leichtem Rühren auf einer Laborpodestwippe (400 U/min) waschen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Larven in 1 ml Blockierpuffer für 3 h bei 4 °C unter leichtem Rühren auf einer Laborplattformwippe (400 U/min).</li>
		<li>Platzieren Sie die Larven in Vertiefungsplatten, die nach Gruppen wie folgt unterteilt sind: 10 Larven in 50 μl Volumen/Vertiefung in einer 96-Well-Platte oder 20 Larven in 100 μl Volumen/Vertiefung in einer 48-Well-Platte.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Blockierungspuffer, inkubieren Sie die Larven mit einer primären Antikörperlösung (z. B. Kaninchen-Anti-Human-Caspase-3, 1:250), die in Inkubationspuffer über Nacht bei 4 °C im Dunkeln verdünnt ist, und schaukeln Sie vorsichtig auf einer Schüttelplatte (400 U/min). In Schritt 7.2.11 finden Sie die empfohlenen Volumes.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 3:<ol><li>Waschen Sie die Larven nacheinander 3 x 1 h mit 1 mL PBS-TS (10% Ziegenserum, 1% Triton X-100 in PBS) und dann mit 2 x 10 min mit 1 mL PBS-T (1% Triton X-100 in PBS) und 2 x 1 h mit 1 mL PBS-TS. Rühren Sie bei jedem Waschgang die Platten mit den Larven vorsichtig auf einer Schüttelplatte (400 U/min).</li>
		<li>Inkubation der Larven mit Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Sekundärantikörpern (z. B. Goat anti-Rabbit IgG [H+L] cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647, 1:500) und 100 μg/ml Hoechst 33258 verdünnt in Inkubationspuffer über Nacht bei 4 °C unter leichtem Rühren auf einer Schüttelplatte (400 U/min). In Schritt 7.2.11 finden Sie die empfohlenen Volumina der sekundären Antikörperlösung.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 4:<ol><li>Waschen Sie 3 x 1 h mit 1 mL PBS-TS und 2 x 1 h mit 1 mL PTw, unter leichtem Rühren auf einer Schüttelplatte (400 U/min).</li>
		<li>Erzeugen Sie mit dem Zahnschmelz eine kreisförmige Schicht (Dicke von ~0,5-1 mm) auf Objektträgern. Lassen Sie den Zahnschmelz austrocknen und legen Sie die Larven in die Mitte der kreisförmigen Schicht, wobei die Seite des Xenotransplantats freigelegt wird.</li>
		<li>Trocknen Sie die überschüssige Lösung und montieren Sie das Glasdeckglas mit einem wasserlöslichen, nicht fluoreszierenden Eindeckmedium.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Bildgebung
<ol><li>Nehmen Sie Bilder unter konfokaler Mikroskopie mit einem 40-fachen Objektiv auf. Verwenden Sie die folgenden Erfassungsparameter: eine Auflösung von 1024 x 512 Pixeln mit einem Z-Abstand von 5 μm.</li>
</ol>9. Analyse der Apoptose durch ImageJ
<ol><li>Laden Sie (Fiji Is Just) ImageJ-Software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) und öffnen Sie das Z-Stack-Dateiimage (klicken Sie auf Datei | Offen). Wählen Sie im Popup-Fenster Stack-Ansicht/Hyperstack aus und klicken Sie auf OK.</li>
	<li>Überlagern Sie die verschiedenen Kanäle, indem Sie Bild | Farbe | Komposit erstellen.</li>
	<li>Ziehen Sie den Z-Balken am unteren Rand des Bildes, um durch das Z-Stapelbild zu blättern und den Xenotransplantatbereich zu identifizieren (Zellen, die Fluoreszenzzell-Tracker-positiv sind. Siehe Schritt 4.5) im perivitellinen Raum des Zebrafisches.</li>
	<li>Wählen Sie das Punktwerkzeug aus, und zählen Sie die Anzahl der apoptotischen menschlichen Zellen (positiver bis fluoreszierender Zelltracker und gespaltene Caspase-3), wie im ergänzenden Video S1 gezeigt.</li>
	<li>Doppelklicken Sie auf das Symbol des Punktwerkzeugs , ändern Sie den Zähler und zählen Sie die Gesamtzahl der menschlichen Zellkerne (Kerne von CM-DiI-positiven Zellen).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

In-vivo-Modelle in der Krebsforschung bieten unschätzbare Werkzeuge, um die Krebsbiologie zu verstehen und das Ansprechen auf die Krebsbehandlung vorherzusagen. Aktuell stehen verschiedene In-vivo-Modelle zur Verfügung, zum Beispiel gentechnisch veränderte Tiere (transgene und Knockout-Mäuse) oder patienteneigene Xenotransplantate aus menschlichen Primärzellen. Trotz vieler optimaler Funktionen hat jede von ihnen verschiedene Einschränkungen. Insbesondere fehlt den oben genannten Modellen eine zuverläss...

Eines der Probleme der klinischen Krebsforschung besteht darin, dass Krebs nicht eine einzelne Krankheit ist, sondern eine Vielzahl verschiedener Krankheiten, die sich im Laufe der Zeit entwickeln können und je nach den Eigenschaften des Tumors selbst und des Patienten spezifische Behandlungen erfordern1. Folglich besteht die Herausforderung darin, sich in Richtung einer patientenorientierten Krebsforschung zu bewegen, um neue personalisierte Strategien für die frühe Vorhersage von Krebsbehandlungsergebnissen zu identifizieren2. Dies ist besonders relevant für das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC), da es mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 11 % als schwer zu behandelnder Krebs gilt3.
Die späte Diagnose, das schnelle Fortschreiten und das Fehlen wirksamer Therapien sind nach wie vor die drängendsten klinischen Probleme der PDAC. Die größte Herausforderung besteht daher darin, den Patienten zu modellieren und Biomarker zu identifizieren, die in der Klinik angewendet werden können, um die wirksamste Therapie im Einklang mit der personalisierten Medizin auszuwählen 4,5,6. Im Laufe der Zeit wurden neue Ansätze zur Modellierung von Krebserkrankungen vorgeschlagen: Patienten-abgeleitete Organoide (PDOs) und von Maus-Patienten abgeleitete Xenotransplantate (mPDXs) stammen aus einer Quelle menschlichen Tumorgewebes. Sie wurden verwendet, um die Krankheit zu reproduzieren, um das Ansprechen und die Resistenz gegen die Therapie sowie das Wiederauftreten der Krankheit zu untersuchen 7,8,9.
In ähnlicher Weise hat das Interesse an zebrafischbasierten patientenabgeleiteten Xenotransplantat-Modellen (zPDX) zugenommen, dank ihrer einzigartigen und vielversprechenden Eigenschaften10, die ein schnelles und kostengünstiges Werkzeug für die Krebsforschung darstellen11,12. zPDX-Modelle benötigen nur eine kleine Tumorstichprobengröße, was ein Hochdurchsatz-Screening der Chemotherapie möglich macht13. Die gebräuchlichste Technik, die für zPDX-Modelle verwendet wird, basiert auf einem vollständigen Probenverdau und der Implantation der primären Zellpopulationen, die den Tumor teilweise reproduziert, aber die Nachteile einer fehlenden Tumormikroumgebung und einer Wechselwirkung zwischen bösartigen und gesunden Zellen hat14.
Diese Arbeit zeigt, wie zPDXs als präklinisches Modell verwendet werden können, um das Chemosensitivitätsprofil von Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs zu identifizieren. Die wertvolle Strategie erleichtert den Xenotransplantat-Prozess, da keine Zellexpansion erforderlich ist, was eine Beschleunigung des Chemotherapie-Screenings ermöglicht. Die Stärke des Modells besteht darin, dass alle Komponenten der Mikroumgebung so erhalten bleiben, wie sie im Krebsgewebe des Patienten sind, denn das Verhalten des Tumors hängt bekanntlich von ihrem Zusammenspiel ab15,16. Dies ist gegenüber alternativen Methoden in der Literatur sehr günstig, da es möglich ist, die Tumorheterogenität zu erhalten und patientenspezifisch zur Verbesserung der Vorhersagbarkeit des Behandlungsergebnisses und des Rezidivs beizutragen, so dass das zPDX-Modell in koklinischen Studien eingesetzt werden kann. Dieses Manuskript beschreibt die Schritte, die zur Erstellung des zPDX-Modells erforderlich sind, beginnend mit einer Tumorresektion des Patienten und deren Behandlung, um das Ansprechen auf die Chemotherapie zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>5-Fluorouracil</td><td>Teva Pharma AG</td><td>SMP 1532755</td><td></td></tr><tr><td>48 Multiwell-Platte</td><td>Sarstedt</td><td>83 3923</td><td></td></tr><tr><td>96 Multiwell-Platte</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Merck</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Agarose-Pulver</td><td>Merck</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kern-Antikörper, Klon 235-1</td><td>Merck</td><td>MAB1281&nbsp;</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Netz für Aquarien QN6</td><td>Penn-plax</td><td>0-30172-23006-6</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34567</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker CM-DiI&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C7001</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Deep Red&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34565</td><td></td></tr><tr><td>gespaltene Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Kaninchen-mAb-Zellsignaltechnologie</td><td></td><td>9661S</td> 1<td>:250 Verdünnung</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>PanReac AppliChem ITW Reagenzien</td><td>A3672,0250</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzetten</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Folinsäure -&nbsp; Lederfolin</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillaren, 3.5"</td> <td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Außendurchmesser = 1.14 mm. Innendurchmesser = 0.53 mm.&nbsp;</td></tr><tr><td>Glasfläschchen &nbsp;</td><td>VWR International</td><td>WHEAW224581</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen&nbsp; IgG&nbsp; (H+L) Kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21244&nbsp; &nbsp;</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31872</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Irinotecan</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niedertemperatur-Gefrierfläschchen</td><td>VWR International</td><td>479-1220</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten-Mischer</td><td>SCILOGEX</td><td>822000049999</td><td></td></tr><tr><td>Oxaliplatin</td><td>Teva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Merck</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 100 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83 3902500</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 60 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83 3901</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff-Pasteurpipette</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Mount</td><td>Tebu-bio</td><td>18606-5</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Merck</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 mittel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklinge Nr. 10 steriler Edelstahl</td><td>VWR International</td><td>SWAN3001</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Tricain</td><td>Merck</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Vertikaler Mikropipetten-Abzieher</td><td>Verschluss Instrument</td><td>P-30&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

etablierung von zebrafisch-xenotransplantaten aus bauchspeicheldrüsenkrebs für chemosensitivitätstests

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Krebs ist weltweit eine der häufigsten Todesursachen, und die Inzidenz vieler Krebsarten nimmt weiter zu. In Bezug auf Screening, Prävention und Behandlung wurden große Fortschritte erzielt. Präklinische Modelle, die das Chemosensitivitätsprofil von Krebspatienten vorhersagen, fehlen jedoch noch. Um diese Lücke zu schließen, wurde ein in vivo patientenabgeleitetes Xenograft-Modell entwickelt und validiert. Das Modell basierte auf Zebrafischembryonen (Danio rerio) 2 Tage nach der Befruchtung, die als Empfänger von Xenotransplantatfragmenten von Tumorgewebe verwendet wurden, die aus einer chirurgischen Probe einer Patientin entnommen wurden. 
Es ist auch erwähnenswert, dass bioptische Proben nicht verdaut oder disaggregiert wurden, um die Tumormikroumgebung aufrechtzuerhalten, was für die Analyse des Tumorverhaltens und des Ansprechens auf die Therapie von entscheidender Bedeutung ist. Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Herstellung von zebrafischbasierten patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (zPDXs) aus der chirurgischen Resektion eines primären soliden Tumors. Nach dem Screening durch einen Anatomopathen wird die Probe mit einer Skalpellklinge präpariert. Nekrotisches Gewebe, Gefäße oder Fettgewebe werden entfernt und dann in 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm große Stücke geschnitten. 
Die Stücke werden dann fluoreszenzmarkiert und in den perivitellinen Raum von Zebrafischembryonen xenotransplantiert. Eine große Anzahl von Embryonen kann kostengünstig verarbeitet werden, was Hochdurchsatz-In-vivo-Analysen der Chemosensitivität von zPDXs gegenüber mehreren Krebsmedikamenten ermöglicht. Konfokale Bilder werden routinemäßig aufgenommen, um die durch die Chemotherapie induzierten apoptotischen Konzentrationen im Vergleich zur Kontrollgruppe zu erkennen und zu quantifizieren. Das Xenotransplantat-Verfahren hat einen erheblichen Zeitvorteil, da es an einem einzigen Tag abgeschlossen werden kann, was ein angemessenes Zeitfenster für die Durchführung eines therapeutischen Screenings für koklinische Studien bietet.

Dieses Protokoll beschreibt den experimentellen Ansatz zur Etablierung von zPDXs aus dem primären humanen Pankreas-Adenokarzinom. Eine Tumorprobe wurde entnommen, zerkleinert und mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbt, wie in Protokollabschnitt 4 beschrieben. Die zPDXs wurden dann erfolgreich durch Implantation eines Tumorstücks in den perivitellinen Raum von 2 dpf-Zebrafischembryonen etabliert, wie in Protokollabschnitt 5 beschrieben. Wie in Protokollabschnitt 6 beschrieben, wurden die zPDXs weiter gescreent, um die Chemother...

Präklinische Modelle zielen darauf ab, das Wissen über die Krebsbiologie zu erweitern und die Wirksamkeit der Behandlung vorherzusagen. Diese Arbeit beschreibt die Erzeugung von zebrafischbasierten patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (zPDXs) mit Tumorgewebefragmenten. Die zPDXs wurden mit einer Chemotherapie behandelt, deren therapeutischer Effekt anhand der Zellapoptose des transplantierten Gewebes beurteilt wurde.

Etablierung von Zebrafisch-Xenotransplantaten aus Bauchspeicheldrüsenkrebs für Chemosensitivitätstests

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

Das von Zebrafischpatienten abgeleitete Xenotransplantat ist ein leistungsfähiges präklinisches Modell zur Vorhersage des Chemosensitivitätsprofils von Krebspatienten in vivo. Das Protokoll beschreibt die Generierung des Modells ausgehend von einer chirurgischen Probe des Patienten. Durch die Xenotransplantation eines kleinen Gewebefragments, anstatt Zellen in Zebrafischembryonen zu isolieren, ist es möglich, die Tumormikroumgebung aufrechtzuerhalten, was der entscheidende Schritt für das Fortschreiten des Tumors und das Ansprechen auf die Chemotherapie ist.Der große Vorteil des Modells liegt darin, dass es die Prognose des Patienten in einem klinisch relevanten Zeitrahmen von nur einer Woche vorhersagen kann und als Werkzeug für die personalisierte Medizin dient. Beginnen Sie die Probenbearbeitung, indem Sie das gesamte Tumorgewebe des Patienten mit fünf Millilitern frischem Tumormedium waschen. Pipettieren Sie es 10 Mal mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff auf und ab.Saugen Sie das Waschmedium vorsichtig ab und entsorgen Sie es, bevor Sie den Waschvorgang dreimal wiederholen. Tauchen Sie die Probe in ein bis zwei Milliliter frisches Tumormedium. Schneiden Sie die Tumorprobe mit einer Skalpellklinge in ein bis zwei Millimeter große Würfelstücke und legen Sie sie dann in ein steriles Fünf-Milliliter-Kunststoffröhrchen mit Tumormedium.Nachdem Sie den McIlwain Tissue Chopper auf eine Dicke von 100 Mikrometern eingestellt haben, legen Sie die Tumorstücke auf den runden Kunststofftisch des Häckslers und hacken Sie sie. Drehen Sie den Tisch um 90 Grad und wiederholen Sie das Hacken. Sammeln Sie die zerkleinerten Tumorfragmente in einem 15-Milliliter-Plastikröhrchen, das das Tumormedium enthält.Zentrifugieren Sie die gehackten Tumorfragmente drei Minuten lang bei 300 G, bevor Sie sie absaugen und den Überstand verwerfen. Inkubieren Sie die Fragmente mit der Zellspurenlösung oder mit einem alternativen fluoreszierenden Zelltracker wie CM-DiI oder Deep Red für 30 Minuten in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Während der Inkubation resuspendieren Sie die Fragmente vorsichtig alle 10 Minuten.Entfernen Sie am Ende der Färbung den freien Farbstoff, indem Sie ein Tumormedium hinzufügen, das mit mindestens 1 % Protein angereichert ist. Das Volumen beträgt das Fünffache des Färbevolumens. Zentrifugieren Sie die Fragmente bei 300 G drei Minuten lang und entsorgen Sie den Überstand.Fügen Sie einen Milliliter der phosphatgepufferten Kochsalzlösung oder DPBS von Dulbecco hinzu und wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Wenn Sie fertig sind, hängen Sie die Fragmente in fünf Millilitern DPBS in einer 60-Millimeter-Petrischale. Um die auf Zebrafischen basierenden patientenabgeleiteten Xenotransplantate oder zPDX zu etablieren, werden die Embryonen zwei Tage nach der Befruchtung anästhesiert.In einer Petrischale mit drei Agarosezylindern wird ein Zebrafischembryo auf einen Zylinder gelegt, der eine Seite freilegt. Entfernen Sie die überschüssige Lösung, um den Embryo in einem dünnen Film zu halten. Übertragen Sie das Stück gefärbter Tumorgewebefragmente mit einer sterilen Pinzette aus einer 60-Millimeter-Petrischale auf den 1%-Agaroseträger, auf den der Embryo gelegt wird.Nehmen Sie dann das Gewebe auf und legen Sie es auf das Eigelb des Embryos, bevor Sie es mit der wärmegezogenen Glasmikronadel in den perivitellinen Raum schieben. Geben Sie einige Tropfen E3 1%Penicillin Streptomycin in den Embryo, um ihn wieder in die Flüssigkeit zu bringen. Nachdem Sie die Implantation von Tumorgewebe in allen Embryonen wiederholt haben, entfernen Sie die Agaroseträger aus der Petrischale und inkubieren Sie die Embryonen bei 35 Grad Celsius.Zwei Stunden nach der Implantation werden die Embryonen mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop auf die richtigen Xenotransplantate mit positiver Färbung überprüft. Verwerfen Sie tote Embryonen und die Embryonen ohne Tumorfragmente vollständig im perivitellinen Raum. Wenn Sie fertig sind, verteilen Sie die Embryonen nach dem Zufallsprinzip auf sechs Multi-Well-Platten, die gemäß dem Versuchsplan gleichmäßig in Gruppen aufgeteilt sind.Verdünnen Sie die Medikamente, indem Sie sie in E3 1%Pen-Streptokokken mischen, um den FOLFOXIRI-Cocktail zuzubereiten. Entfernen Sie nach zwei Stunden der Implantation das Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie den Medikamentencocktail hinzu. Legen Sie die Embryonen drei Tage lang bei 35 Grad Celsius in den Inkubator, wobei das Medium täglich gewechselt wird, um die Medikamente zu erneuern.Für die Bildgebung werden Bilder unter einem 40-fachen Objektiv des konfokalen Mikroskops aufgenommen. Verwenden Sie die Auflösung von 1024 x 512 Pixeln mit einem Z-Abstand von fünf Mikrometern. Die Gesamtbilder der zPDXs, die zur Analyse der in Cyano detektierten Apoptose aufgenommen wurden, zeigten, dass die kombinierte Therapie die Zellapoptose im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhte.Die Fallstudie berichtete, dass für die mit FOLFOXIRI behandelte Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe ein statistisch signifikanter Anstieg des Anteils apoptotischer Zellen in implantierten Xenotransplantaten festgestellt wurde. Das Protokoll zeigt ein Beispiel mit Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe, aber aus Zebrafischpatienten gewonnene Xenotransplantate können aus verschiedenen Krebsarten hergestellt werden. Da das Modell einen geringen ethischen Einfluss hat, ist es außerdem leicht für das In-vivo-Screening neuer Medikamente nutzbar.Die Methode ist technisch anspruchsvoll und erfordert einen fachkundigen Bediener. Vorkenntnisse in der Manipulation von Zebrafischembryonen und der Mikroinjektion werden das Training der Technik beschleunigen.

establishment-zebrafish-patient-derived-xenografts-from-pancreatic

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video beschreibt die Technik zur Erstellung eines von Zebrafisch-Patienten abgeleiteten Xenotransplantat-Modells. Im Probenprotokoll beurteilen wir die Wirksamkeit der Medikamente Gemcitabin und Navitoclax am Xenotransplantatmodell des Pankreastumors.

Zebrafisch-Xenotransplantat (zPDX): Ein Krebsmodell

Dieses Video beschreibt den Zebrafisch-Xenotransplantat-Assay zur Beurteilung der in vivo Tumorbildung und zur Untersuchung der Wirkung von Therapeutika.

Zebrafisch-Xenotransplantat-Assay: Eine Methode zur Bewertung der krebshemmenden Wirksamkeit von Therapeutika auf die Tumorigenität bei Zebrafischen in vivo

Dieses Video beschreibt die Methode zur Transplantation von Tumorzellen aus dem Melanom-tragenden Spender-Zebrafischmodell zu einem immungeschwächten Empfänger-Casper-Zebrafisch. Es hilft, die Tumortransplantation und -proliferation im Empfängerfisch sichtbar zu machen.

Subkutaner Transplantationsassay: Eine Methode zur Transplantation von Melanomzellen von einem Spender in ein Empfänger-Zebrafischmodell

Die Transplantation von Krebszellen ist ein wichtiges Instrument zur Identifizierung von Krebsmechanismen und therapeutischen Reaktionen. Aktuelle Techniken hängen von immune-inkompetenten Tieren ab. Hier beschreiben wir eine Methode zur Transplantation von Zebrafisch-Tumorzellen in immunkompetenten Embryonen zur Langzeitanalyse des Tumorzellverhaltens und in vivo- Arzneimittelwirkungen.

Transplantation von Zebrafisch-pädiatrischen Hirntumoren in immune-kompetente Wirte für die Langzeitstudie von Tumorzellverhalten und Drug Response

Dieses Protokoll beschreibt Optimierungsverfahren in einem virusbasierten Dual-Fluoreszenz-markierten Tumor-Xenograft-Modell unter Verwendung von Larvenzebrafischen als Wirte. Dieses heterogene Xenograft-Modell imitiert die Gewebezusammensetzung der Mikroumgebung von Bauchspeicheldrüsenkrebs in vivo und dient als präziseres Werkzeug zur Beurteilung von Arzneimittelreaktionen in personalisierten zPDX-Modellen (Zebrafish Patient-derived xenograft).

Patientenabgeleitetes heterogenes Xenograft-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs mit Zebrafischlarven als Wirte für vergleichende Arzneimittelbewertung

Zebrafish Xenograft-Modelle ermöglichen ein hochdurchsatziges Arzneimittelscreening und eine fluoreszierende Bildgebung menschlicher Krebszellen in einer in vivo Mikroumgebung. Wir haben einen Workflow für großangelegte, automatisierte Arzneimitteluntersuchungen an von Patienten abgeleiteten Leukämieproben in Zebrafischen mit hilfe einer automatisierten Fluoreszenzmikroskop-Bildgebungseinheit entwickelt.

Arzneimittel-Screening von Primärpatienten abgeleitetTumor Xenografts in Zebrafischen

Hier bieten wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll mit Tipps zur Generierung von Xenografts und Richtlinien für die Tumorverhaltensanalyse, die Immunfluoreszenz mit voller Montätralisierung und die konfokale Bildgebungsquantifizierung.

Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Wir beschreiben ein Protokoll für die Xenotransplantation in das Eigelb von transparenten Zebrafischembryonen, das durch eine einfache, schnelle Staging-Methode optimiert wird. Die Analysen nach der Injektion umfassen das Überleben und die Beurteilung der Krankheitslast von xenotransplantierten Zellen durch Durchflusszytometrie.

Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen

Dieses Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Generierung und Fehlerbehebung von Xenotransplantaten der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) beim Menschen aus Zelllinien und frischem Patientenmaterial in transient immunsupprimierten Zebrafischembryonen sowie Richtlinien für die Beurteilung des Ansprechens auf das Arzneimittel mittels Durchflusszytometrie. Die experimentelle Pipeline kann auch für solide Tumore angepasst werden.

Schnelle in vivo Vorhersage des Ansprechens auf Medikamente mit Hilfe von Leukämiezelltransplantaten in Zebrafischembryonen

Wir beschreiben ein Verfahren zur stabilen Markierung von Patienten stamm Xenotransplantaten (PDXs) mit lentivirale Partikel exprimieren grün fluoreszierenden Protein und Luziferase-Reporter. Diese Methode ermöglicht es, das Wachstum von PDXs am primären Standort zum Verfolgen sowie Detektieren spontaner und experimentelle Metastasen in vivo Bildgebungssysteme verwendet werden .

Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies

Erfahren Sie die Etablierung von Zebrafisch-Patienten-xenotransplantaten zur Vorhersage der Chemosensitivität bei Bauchspeicheldrüsenkrebs. Diese Methode erhält das Tumormikromilieu und ermöglicht personalisierte Behandlungsentscheidungen.

Etablierung von Zebrafisch-Xenotransplantaten aus Bauchspeicheldrüsenkrebs für Chemosensitivitätstests

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