Erhaltung der zellulären Vielfalt des menschlichen Glioblastoms ex vivo unter Verwendung dreidimensionaler Organoidkultur

Die Suche nach Behandlungen für Glioblastome ist aufgrund der zellulären Vielfalt, die in Tumoren existiert, und der Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Mikroumgebungen schwierig. Organoide können helfen, einen Teil dieser räumlichen Vielfalt wiederherzustellen, und wir können dies nutzen, um die Biologie der Tumore besser zu verstehen. Während traditionelle Zellkulturmethoden dazu neigen, homogene Tumorzellpopulationen zu produzieren, können Organoide die molekulare und zelluläre Vielfalt des Glioblastoms besser nachahmen und intratumorale Interaktionen besser modellieren.

Organoide können verwendet werden, um die Wirksamkeit von Medikamenten und Resistenzmechanismen zu untersuchen. Resistenzen gegen klinische Therapien können nur in Organoiden und nicht in der traditionellen Sphärenkultur auftreten, was die klinische Realität dieser Krankheit widerspiegelt. Organoide können helfen, die regionalen Effekte von Chemotherapien nachzuweisen.

Sie können verwendet werden, um neue nischenspezifische Therapien zu entdecken, und sie können auch als prädiktives Werkzeug für die personalisierte Medizin in der Zukunft dienen. Einige Materialien, die zur Herstellung von Organoiden verwendet werden, sind temperaturempfindlich, und die Vernachlässigung, diese Materialien auf ihrer richtigen Temperatur zu halten, kann zu Schwierigkeiten bei der Herstellung oder Aufrechterhaltung von Organoiden führen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Organoidformen unter einer Kulturhaube, indem Sie das Wachspapier von der Parafilmfolie nehmen und zwischen zwei sterilen 96-Well-Polymerase-Kettenreaktions- oder PCR-Platten legen.

Stellen Sie sicher, dass die Innenseite des Parafilms sauber ist. Üben Sie gleichmäßigen Druck auf die obere Platte aus, um kleine, zwei Millimeter tiefe Grübchen im Parafilm zu bilden, ohne Löcher zu erzeugen. Trennen Sie die Platten.

Der Noppen-Parafilm klebt an der oberen Platte. Stellen Sie dann die obere Platte für 30 Sekunden auf Trockeneis. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um den Parafilm in einer schnellen Bewegung von der oberen Platte zu ziehen.

Gefrorener Parafilm ist leichter zu entfernen. Legen Sie die fertige Parafilmform in eine abgedeckte, sterile 10-Zentimeter-Zellkulturschale. Um die einzellige Suspension aus Glioblastom- oder GBM-adhärenter Kultur herzustellen, entfernen Sie die verwendeten Medien von der Platte.

Dann fügen Sie zwei Milliliter Zellablösungslösung bei Raumtemperatur auf die Platte und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad für drei Minuten. Nachdem Sie die Zellablösung von der Platte unter dem Mikroskop bestätigt haben, fügen Sie acht Milliliter Neurobasal Medium Complete oder NBMc-Medium hinzu, um die Zellablösungslösung zu neutralisieren. Die Suspension durch ein einzelnes 70-Mikron-Zellsieb abseihen.

Drehen Sie die Zellen bei 120 mal G für fünf Minuten herunter. Dann entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter NBMc. Zählen Sie die Zellen aus der Einzelzellsuspension mit einer Zellunmittelfärbung.

Um Organoide aus einer einzelligen Suspension herzustellen, fügen Sie eine geeignete Menge Laminin-reicher extrazellulärer Matrix oder lrECM in ein kleines Zentrifugenröhrchen in einem Eiskübel oder kalten Block hinzu. Bereiten Sie eine Zellmischung vor, die 20.000 Zellen pro Organoid enthält. Mischen Sie die lrECM-Zellsuspensionsmischung gründlich, um eine Ansiedlung der Zellen zu vermeiden, die zu einer ungleichmäßigen Organoidbildung führen würde.

Als nächstes pipetten Sie vorsichtig 20 Mikroliter der Mischung auf eine Parafilmform, um ein perlenartiges Tröpfchen zu bilden. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze alle zwei bis drei Organoide gekühlt wird, um eine lrECM-Polymerisation zu verhindern. Sobald die gewünschte Anzahl von Organoiden in einer 10-Zentimeter-Kulturplatte auf die Parafilmform pipettiert wurde, inkubieren Sie die Organoide bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Stunden in einem Zellkulturinkubator.

Nachdem die Organoide verfestigt sind, spülen Sie die Organoide mit einer P1000-Spitze vorsichtig mit NBMc-Medium von der Parafilmform ab und sammeln Sie sie in einer neuen 10-Zentimeter-Kulturplatte mit 20 Milliliter NBMc. Legen Sie die Kulturplatte vier Tage lang ohne Schütteln in einen Inkubator. Ersetzen Sie nach vier Tagen die Medien in der Platte.

Legen Sie dazu ein Stück dunkles Papier unter die Zellkulturplatte. Neigen Sie die Platte und warten Sie 20 Sekunden. Wenn sich die Organoide vollständig am Boden der Schale absetzen, entfernen Sie das Medium langsam mit einer großflächigen Glaspipette.

Nachdem Sie neue Medien hinzugefügt haben, legen Sie die Platte in den Inkubator auf einem Orbitalschüttler bei 80 U/min und wechseln Sie danach alle zwei bis drei Tage die Medien aus. Das Wachstum des Organoids wurde lichtmikroskopisch beobachtet. In der mittleren Ansicht zeigte das frühe Organoidwachstum Migration und Einzelzellinvasion durch lrECM.

Die reifen Organoide nach sieben Wochen waren relativ zur Größe eines Cents. Die immunhistochemische Färbung der GBM-Organoide mit Phospho-Histon H3 zeigte im Vergleich zum Kern hochproliferative Zellen mit braunem oder violettem Aussehen im Organoidumfang. Die Zelllebensfähigkeitsdaten für Organoide in 0,1% DMSO zeigten intraorganoide und interorganoide Konsistenz.

Achten Sie auf organoide Biomasse und Medienversauerung. Wenn die Organoide zu schnell durch Medien gehen, achten Sie darauf, die Medien häufiger auszutauschen oder die Organoide auf zusätzliche Platten aufzuteilen. Ausgereifte Organoide können für Experimente mit Therapien verwendet oder eingebettet und geschnitten für die Verwendung mit Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz verwendet werden.

Die dissoziierten Organoide können für die FACS-Analyse verwendet werden. Diese Organoide wurden kürzlich im dreidimensionalen funktionellen Screening verwendet, um Ziele zu entdecken, die in räumlich unterschiedlichen Krebsstammzellnischen unerlässlich sind. Wir verwenden diese Modelle auch, um verschiedene Medikamente und Therapien vor In-vivo-Tests zu priorisieren.