Name: Erhaltung der zellulären Vielfalt des menschlichen Glioblastoms ex vivo unter Verwendung dreidimensionaler Organoidkultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Erzeugung von Glioblastom-Organoiden aus Patientenproben zur Untersuchung zellulärer Vielfalt und Wirkstoffresistenzen. Diese 3D-Kultur ermöglicht realistischere Tumormodelle für personalisierte Therapieansätze.

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Wir danken Dr. Justin Lathia für seine unschätzbaren Ratschläge und seine kontinuierliche Unterstützung. Wir danken auch Katrina Fife, Lisa Wallace und Maya Camhi für ihre hervorragende technische Unterstützung.

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Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

GBM-Organoide sind eine komplementäre Kulturmethode zu traditionellen Sphären, die eine größere zelluläre und mikroökologische Heterogenität aufweisen 4,22,30. Obwohl zeit- und ressourcenintensiver, kann die Organoidkultur wertvolle Einblicke in das intratumorale Verhalten und die Mechanismen der Arzneimittelresistenz bieten.
GBM wird von einer Population von CSCs 5,31 angetrieben, und diese Methoden wurden entwickelt, um ein kontinuierliches Wachstum und eine Selbsterneuerung dieser CSC-Population zu ermöglichen. Es ist bekannt, dass der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) die Erhaltung und das Wachstum von Stammzellen verbessern und eine aktive Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK)-Signalisierung bereitstellen. Die Bildung heterogener Zellpopulationen und unterschiedlicher Tumormikroumgebungen innerhalb von GBM-Tumoren beruht auf der Unterstützung des CSC-Verhaltens. Die Auswahl eines lrECM ahmt die lamininreiche Gehirnumgebung nach und unterstützt die Zellen in Organoidkultur dabei, sich selbst zu organisieren und durch Invasion zu migrieren. Obwohl einige Gruppen eine Organoidkultur ohne die Verwendung eines lrECM- oder EGF/FGF-angereicherten Mediums24,28 etabliert haben, was eine zeiteffizientere Art dieser Kulturmethode und eine stärkere Auswahl onkogener Signale zur Wachstumsförderung bieten kann, wurden diese Methoden ausgewählt, um die Pro-Stammzellumgebung zu optimieren, um die zelluläre Heterogenität von Organoiden bestmöglich zu bestimmen. Sowohl zerebrale Organoide als auch GBM-Organoide wurden mit lrECM in der Literatur zuvor 21,32,33 hergestellt. Obwohl wir Daten über die Tumorpopulationen in Organoiden und die räumliche Variation gesammelt haben, ist weniger über Nicht-Tumorpopulationen innerhalb der Organoide bekannt und wie lange sie von den ursprünglichen Patientenproben überleben. Bestimmte IHC-Färbungen (wie CD45) können diese Daten liefern und könnten in Zukunft ein interessanter Forschungspunkt mit Organoiden sein.
Die Kenntnis des Verwendungszwecks für die Organoidkultur ist wichtig für die Auswahl geeigneter Methoden. Die Etablierung von Organoiden aus Primärproben im Vergleich zur Züchtung einheitlicher Organoide für spezifische Experimente hat leicht unterschiedliche Verfahren. Ein Verständnis dafür, wie Organoide reifen und das lrECM-Gerüst visuell ausfüllen, ist wichtig, um in der Lage zu sein, die richtige Zeit und Ressourcen für die Organoidkultur bereitzustellen. Dünne Zellregionen in Organoiden dehnen sich langsam aus und wachsen, um die lrECM zu füllen, was je nach Verhalten der Probe zwischen 2 und 8 Wochen dauern kann. Diese Wachstumsrate ist für jedes Exemplar etwas intrinsisch; Es ist über verschiedene Chargen von Organoiden konserviert und stimmt ziemlich konsistent mit der relativen Rate des Kugelwachstums. Organoide können über 1 Jahr lang aufrechterhalten werden und behalten die Fähigkeit zur Tumorbildung auf Xenotransplantat in Mäusen; Es wird jedoch empfohlen, sie mit einem bestimmten Zweck anzubauen, um keine Laborressourcen (sowohl Materialien als auch Zeit) zu verschwenden4. Das Organoidwachstum wurde in mehreren Well-Größen und -Formaten getestet und zeigt, dass eine 10-cm-Platte die ideale Einstellung für die Aufrechterhaltung einer optimalen Zelllebensfähigkeit ist, gefolgt von einer 6-Well-Platte mit drei Organoiden pro Welle34. Organoide verbrauchen im Vergleich zu ihren zweidimensionalen Kulturgegenstücken mehr Medien, und die Verwendung eines kleineren Well-Formats führt nicht zu einer ordnungsgemäßen Wartung. Zum Beispiel hat eine Vertiefung einer Platte im 96-Well-Format nicht genügend Platz oder Medienvolumen im Verhältnis zur Größe eines Organoids, um das Organoidwachstum aufrechtzuerhalten.
Wie sich Organoide etablieren, ist es wichtig, aufmerksam zu sein, um den Erfolg zu steigern. Anfangs konsumieren Organoide Medien langsam, aber wenn sie dichter und reifer werden, werden sie Medien schneller konsumieren. Die Zugabe von Phenolrot zu den Medien kann als Indikator für den Medienverbrauch dienen. Wenn die Medien gelber sind, können wir das Fütterungsmuster anpassen, sei es, um ein höheres Medienvolumen auszutauschen, die Gesamtmedienmenge in der Platte zu erhöhen, Organoide auf mehrere Zellkulturplatten zu verteilen, um mit ihrem Wachstum Schritt zu halten, oder sogar den Zeitplan für Experimente anzupassen. 
In vielerlei Hinsicht sind Organoide eine ineffiziente Art, Krebsforschung zu betreiben. Sie beinhalten lange Zeitskalen und sind im Vergleich zur GBM-Sphärenkultur teuer und ressourcenintensiv. Im Vergleich zu patientenbasierten Xenotransplantaten, einer alternativen Methode zur Wiederherstellung der zellulären und mikroökologischen Vielfalt, sind sie jedoch einfacher, kostengünstiger und kontrollierbarer. Die Auswahl, wann Organoide am besten verwendet werden sollen, ist für Krebsforscher wichtig. Sie sind nicht dazu gedacht, traditionelle Sphären oder zugehörige Kulturen zu ersetzen und Xenograft-Modelle nicht zu ersetzen. Organoide können, wenn sie auf die richtige wissenschaftliche Frage angewendet werden, die Vorteile dieser beiden Systeme kombinieren und es uns ermöglichen, die Tumorzellbiologie zu beobachten, die sonst verborgen bleiben würde. Die wissenschaftliche Gemeinschaft beginnt gerade erst zu verstehen, welche Lernmöglichkeiten Organoide bieten, aber es ist klar, dass sie in Zukunft ein unschätzbares Werkzeug für das Verständnis der komplexen Biologie von GBM sein werden.

Das Glioblastom (GBM) ist der am häufigsten auftretende primäre Hirntumor mit einer düsteren Prognose von etwa 15 Monaten ab Diagnose1. Behandlungen, die in präklinischen Studien wirksam sind, können bei Patienten oft schlecht wirksam sein 2,3. Ein schlechtes klinisches Ansprechen wird auf viele Faktoren zurückgeführt, einschließlich der Mikroumweltheterogenität von GBM und komplexer intratumoraler Interaktionen. Diese können im Labor mit traditionellen Adhärent- oder Kugelkulturmethoden nur schwer nachgebildet werden4. Das Vorhandensein einer Untergruppe selbsterneuernder Krebsstammzellen (CSCs) in GBM kann ebenfalls zu dieser Komplexität beitragen 5,6. CSCs sind entscheidend für die Tumorausbreitung und halten das Tumorwachstum aufrecht, indem sie die aktive Angiogenese, die Krebsinvasion und die Resistenz gegen Therapien einschließlich Strahlungfördern 7,8,9. CSCs sind nicht gleichmäßig über Tumoren verteilt, sondern werden in spezifischen Mikroumgebungen angereichert, einschließlich der perivaskulären Nische und perinecrotischen Regionen, die jeweils eine eindeutige molekulare Regulation ihrer zellulären Zustände bieten 10,11,12,13,14. CSCs sind keine passiven Empfänger von Mikroumgebungshinweisen, sondern besitzen die Fähigkeit, ihre eigene Mikroumgebung umzugestalten 7,15,16. Die Mikroumgebung eines CSC kann die Aufrechterhaltung des Stammzellzustands als Reaktion auf Belastungen wie Nährstoffknappheit, pH-Wert und Hypoxiefördern 17,18,19,20, was auf die Bedeutung dieser Bedingungen in einem Modellsystem hindeutet. Die Rekapitulation der vielfältigen zellulären Mikroumgebung innerhalb von Tumoren ist daher entscheidend für das Verständnis therapeutischer Resistenzen und die Identifizierung neuartiger Therapien.
Die dreidimensionale Kultur hat in den letzten Jahren an Popularität gewonnen21,22. Organoide wurden bei anderen Krebsarten eingesetzt, und das Hauptziel der Erhaltung von Zellen als Organoide besteht darin, das Wachstum heterogener Zellpopulationen (von denen viele normalerweise in einer homogeneren Kugelkultur überholt werden können) und räumliche Vielfalt zu ermöglichen, die als regionale Tumormikroumgebungen mit genetischer Spezifität angesehen werden 4,23,24,25,26 . Es gibt viele Methoden zur dreidimensionalen Kultur von Krebszellen, die jeweils Vor- und Nachteilehaben 27,28,29. Die Organoidkultur soll kein Ersatz für die traditionelle Anhänger- oder Sphärenkultur sein. Es wird am besten als ergänzende Technik zu zweidimensionalen Methoden verwendet, wenn es spezifische Fragen gibt, bei denen die Interaktion zwischen Zellmikroumgebung und Tumorzellantworten kritisch ist.
Dieser Artikel beschreibt zuverlässige und wiederholbare Methoden zur Erzeugung von GBM-Organoiden aus primären Patientenproben oder aus Patientenkulturen. Wir adressieren zwei verschiedene Ziele für die dreidimensionale Organoidkultur: (1) die Etablierung von Organoiden aus primärem Patientengewebe mit maximalem Engraftment-Potenzial unabhängig von der Einheitlichkeit oder (2) die Züchtung einheitlicher Organoide für eine quantitativere experimentelle Verwendung. Bei der Etablierung einer primären Probe als Organoide ist es nicht notwendig, nach einzelnen Zellen zu filtern oder Zellen zu zählen, da die Beibehaltung maximaler Zellzahlen und -typen zur Bestimmung der ursprünglichen Kultur Priorität hat. Bei der Züchtung von Organoiden für Vergleichsexperimente sind jedoch Einzelzellfiltration und Zellzählung erforderlich, um sicherzustellen, dass Replikationsorganoide hinsichtlich der experimentellen Konsistenz vergleichbar sind. Dieses Protokoll beschreibt, wie Organoidkulturen etabliert und einheitliche Organoide erstellt werden, sowie verfeinerte Methoden zur Einbettung und Konservierung von Organoiden und Standard-Zellkulturexperimenten, einschließlich Immunhistochemie, Immunfluoreszenz und Bewertung der Gesamtzelllebensfähigkeit in GBM-Organoiden.

<table><tbody><tr><td>3,3-Diaminobenzidin (DAB) Tabletten</td><td>MP Biomedicals</td><td>08980681</td><td>3,3-Diaminobenzidin (DAB) Tabletten</td></tr><tr><td>96-Well-PCR-Platten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>96-Well-PCR-Platten</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SCR005</td><td>Zellablösungslösung</td></tr><tr><td>Antibiotisch-antimykotisch</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Antibiotisch-antimykotisches</td></tr><tr><td>B-27-Präparat minus Vitamin A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12587001</td><td>B-27-Präparat minus Vitamin A (50x)</td></tr><tr><td>GelCode Blue Fleckenreagenz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24590</td><td>Bläuereagenz</td></tr><tr><td>Zellsieb (70 &; Mikro; m)</td><td>CellTreat Scientific</td><td>229483</td><td>Cell Sieb (70 & Mikro; m)</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>Viabilitätsassay für lumineszierende Zellen</td></tr><tr><td>Clarifier 2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7301</td><td>Nukleares Hämatoxylin-Klärreagenz</td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>6901</td><td>Xylolersatz</td></tr><tr><td>Epredia Gill 2 Hämatoxylin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>72504</td><td>Hämatoxylin</td></tr><tr><td>Glutamin in 0,85 % NaCl</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Glutamin in 0,85 % NaCl (200 mM)</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>354234</td><td>mit Laminin angereicherte extrazelluläre Matrix Mini-PAP-Pen</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>008877</td><td>Hydrophober Barrierestift</td></tr><tr><td>Eindeckmedium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-050-102</td><td>Eindeckmedium</td></tr><tr><td>Neurobasal Medien minus Phenolrot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12349015</td><td>Neurobasale Medien minus Phenolrot (500 mL)</td></tr><tr><td>Normales Eselsserum (NDS)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Normales Eselsserum (NDS)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 4% in PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td>Paraformaldehyd 4% in PBS</td></tr><tr><td>Phenolrot</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Phenolrot (0,5%)</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Eindeckmittel mit DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td>Flüssighärtendes Eindeckmittel</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes EGF-Protein</td><td>R& D systems</td><td>236-EG-01M</td><td>Rekombinantes humanes EGF-Protein (250 & Mikro; g/mL)</td></tr><tr><td>Rekombinante humane FGF grundlegende</td><td>F& D systems</td><td>4144-TC-01</td><td>Rekombinante humane FGF basic (250 & micro; g/mL)</td></tr><tr><td>SignalStain Antikörper Verdünnungsmittel</td><td>Zellsignalisierung</td><td>8112</td><td>Antikörperverdünnungsmittel</td></tr><tr><td>SignalStain Boost IHC Nachweisreagenz</td><td>Zellsignalisierung</td><td>8114</td><td>Immunhistochemische Nachweisreagenz</td></tr><tr><td>SignalStain Citrat Demaskierungslösung</td><td>Zellsignalisierung</td><td>14746</td><td>Citrat Demaskierungslösung</td></tr><tr><td>Einschneidige Rasierklinge</td><td>Uline</td><td>H-595B</td><td>Einkante Rasierklinge</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td>Natriumpyruvat (100 mM)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Kryoformen</td><td>VWR</td><td>25608-916</td><td>Einweg-Kryoformen</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Compound mit optimaler Schnitttemperatur</td></tr><tr><td>Trypanblauer Fleck</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T10282</td><td>Zellunempfindliche Färbung (0,4%)</td></tr><tr><td>Xylol</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific X3P-1GAL</td><td>Xylol</td></tr></tbody></table>

erhaltung der zellulären vielfalt des menschlichen glioblastoms ex vivo unter verwendung dreidimensionaler organoidkultur

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

Das Glioblastom (GBM) ist der am häufigsten auftretende primäre maligne Hirntumor mit extrem schlechter Prognose. Intratumorale zelluläre und molekulare Vielfalt sowie komplexe Wechselwirkungen zwischen Tumormikroumgebungen können die Suche nach wirksamen Behandlungen zu einer Herausforderung machen. Traditionelle Adhärenz- oder Kugelkulturmethoden können solche Komplexitäten maskieren, während dreidimensionale Organoidkulturen regionale Mikroumweltgradienten rekapitulieren können. Organoide sind eine Methode der dreidimensionalen GBM-Kultur, die die Tumorarchitektur des Patienten besser nachahmt, phänotypisch vielfältige Zellpopulationen enthält und für Experimente mit mittlerem Durchsatz verwendet werden kann. Obwohl die dreidimensionale Organoidkultur im Vergleich zur traditionellen Kultur aufwändiger und zeitaufwendiger ist, bietet sie einzigartige Vorteile und kann dazu dienen, die Lücke zwischen aktuellen In-vitro- und In-vivo-Systemen zu schließen. Organoide haben sich als unschätzbare Werkzeuge im Arsenal der Krebsbiologen etabliert, um das Tumorverhalten und die Resistenzmechanismen besser zu verstehen, und ihre Anwendungen wachsen weiter. Hier werden Methoden zur Erzeugung und Aufrechterhaltung von GBM-Organoiden beschrieben. Anweisungen zur Durchführung der Einbettung und Schnittierung von Organoidproben sowohl mit gefrorenen als auch mit Paraffin-Einbettungstechniken sowie Empfehlungen für Immunhistochemie und Immunfluoreszenzprotokolle für Organoidschnitte und die Messung der Lebensfähigkeit der gesamten Organoidzellen werden ebenfalls beschrieben.

Abbildung 1 zeigt das frühe Organoidwachstum mittels Lichtmikroskopie bei 10-facher Vergrößerung. Abbildung 1A zeigt die Migration und Invasion einzelner Zellen durch lrECM in der mittleren Ansicht. Die Zellen werden sich weiter ausdehnen und das lrECM "besiedeln", und sie werden bei visueller Inspektion dichter und schließlich undurchsichtiger erscheinen. Abbildung 1B zeigt mehrere reife Organoide (nach 7 Wochen) ohne Vergrößerung, relativ zur Größe eines Groschens.
Abbildung 2 zeigt die immunhistochemische Färbung von GBM-Organoiden für Phospho-Histon H3, einen Marker für aktive Proliferation. Die meisten stark proliferativen Zellen sind im Organoidumfang im Vergleich zum Organoidkern zu sehen. Positive Färbung hat ein braunes / kupferfarbenes Aussehen.
Abbildung 3 beschreibt den Prozess zur Homogenisierung und Messung der Gesamtzellanzahl in GBM-Organoiden unter Verwendung eines 3D-spezifischen lumineszierenden Zelllebensfähigkeitsassays. Aufgrund der hohen Anzahl von Zellen in GBM-Organoiden wird die größere Organoidstruktur zunächst durch Verreibung im lumineszierenden Assay-Reagenz homogenisiert. Dann werden Fraktionen des gesamten Organoidlysats in einzelne Vertiefungen geladen und vor der Inkubation und dem Ablesen auf einem geeigneten Multi-Well-Plattenleser mit zusätzlichem Lumineszenz-Assay-Reagenz verdünnt.
Abbildung 4 zeigt DMSO-Steuerdaten (Common Vehicle) für Organoide. Die dargestellten Daten zeigen die intraorganoide und interorganoide Konsistenz. Lumineszenzlebensfähigkeitsdaten werden bei der Generierung experimenteller Daten in der Regel für jede Probe auf Kontrollen normalisiert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig01.jpg"> Abbildung 1: Blick durch ein Lichtmikroskop (10x). (A) Frühes Organoidwachstum, das die Migration/Invasion von GBM-Zellen in der lamininreichen extrazellulären Matrix zeigt. (B) Reife Organoide relativ zur Größe eines Groschens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig02.jpg"> Abbildung 2: Immunhistochemie von GBM-Organoiden . (A, B) GBM-Organoide mit Phospho-Histon-H3-gefärbten Zellen zur aktiven Proliferation. Maßstabsbalken sind 600 μm bzw. 300 μm für A bzw. B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig03.jpg"> Abbildung 3: Lumineszenzzelllebensfähigkeitsprotokoll für Organoide. (A) Bewegen Sie einzelne Organoide in kleine Zentrifugenröhrchen und entfernen Sie überschüssige Medien. (B) Fügen Sie 500 μL 1:1 PBS und lumineszierende Zelllebensfähigkeits-Assay-Mischung zu jedem Röhrchen hinzu und pipettieren Sie aggressiv, um das Organoid abzubauen. (C) Man gibt 25 μL dieser Organoidmischung und 75 μL derselben 1:1 PBS- und lumineszierenden Zelllebensfähigkeits-Assay-Mischung zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte. (D) Auf einen Shaker für 2 min geben, gefolgt von einer Inkubation für 20 min bei RT, und dann Lumineszenz auf einem Plattenleser ablesen. Figur aus BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig04.jpg"> Abbildung 4: Zelllebensfähigkeit. Zelllebensfähigkeitsdaten für Organoide in 0,1% Dimethylsulfoxid (DMSO) für sechs technische Replikate von vier Organoiden für vier Patientenproben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bestandteil</td>
			<td>Menge</td>
		</tr><tr><td>Neurobasalmedium minus Phenolrot</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr><tr><td>B-27 Ergänzung minus Vitamin A (50x)</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum (100x)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Natriumpyruvat (100 mM)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Glutamin in 0,85% NaCl (200 mM)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Rekombinante humane FGF basic (250 μg/ml)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>Rekombinantes humanes EFG-Protein (250 μg/ml)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>Phenol rot</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Vollständige Formulierung des neurobasalen Mediums (NBMc)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagenz</td>
			<td>Zeit</td>
		</tr><tr><td>50% Ethanol</td>
			<td>3 Minuten</td>
		</tr><tr><td>75% Ethanol</td>
			<td>3 Minuten</td>
		</tr><tr><td>95% Ethanol</td>
			<td>3 Minuten</td>
		</tr><tr><td>95% Ethanol</td>
			<td>4 Minuten</td>
		</tr><tr><td>100% Ethanol</td>
			<td>2 Minuten</td>
		</tr><tr><td>100% Ethanol</td>
			<td>3 Minuten</td>
		</tr><tr><td>100% Ethanol</td>
			<td>4 Minuten</td>
		</tr><tr><td>Xylol-Ersatz</td>
			<td>2 Minuten</td>
		</tr><tr><td>Xylol-Ersatz</td>
			<td>3 Minuten</td>
		</tr><tr><td>Xylol-Ersatz</td>
			<td>4 Minuten</td>
		</tr><tr><td>Paraffin</td>
			<td>15 Minuten</td>
		</tr><tr><td>Paraffin</td>
			<td>15 Minuten</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Verarbeitungsschema für kleine Organoide (unter 3 mm Durchmesser)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagenz</td>
			<td>Zeit</td>
		</tr><tr><td>50% Ethanol</td>
			<td>6 Minuten</td>
		</tr><tr><td>75% Ethanol</td>
			<td>6 Minuten</td>
		</tr><tr><td>95% Ethanol</td>
			<td>5 Minuten</td>
		</tr><tr><td>95% Ethanol</td>
			<td>8 Minuten</td>
		</tr><tr><td>100% Ethanol</td>
			<td>5 Minuten</td>
		</tr><tr><td>100% Ethanol</td>
			<td>5 Minuten</td>
		</tr><tr><td>100% Ethanol</td>
			<td>8 Minuten</td>
		</tr><tr><td>Xylol-Ersatz</td>
			<td>5 Minuten</td>
		</tr><tr><td>Xylol-Ersatz</td>
			<td>5 Minuten</td>
		</tr><tr><td>Xylol-Ersatz</td>
			<td>8 Minuten</td>
		</tr><tr><td>Paraffin</td>
			<td>30 Minuten</td>
		</tr><tr><td>Paraffin</td>
			<td>30 Minuten</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 3: Verarbeitungsschema für große Organoide (über 3 mm Durchmesser)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagenz</td>
			<td>Zeit</td>
		</tr><tr><td>Hämatoxylin</td>
			<td>2 Minuten</td>
		</tr><tr><td>Ausführen von diH2O</td>
			<td>2 Minuten</td>
		</tr><tr><td>Kernhämatoxylin-klärendes Reagenz</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Ausführen von diH2O</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Bläuliches Reagenz</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Ausführen von diH2O</td>
			<td>2 Minuten</td>
		</tr><tr><td>70% Ethanol</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>100% Ethanol</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>100% Ethanol</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Xylol-Ersatz</td>
			<td>2 Minuten</td>
		</tr><tr><td>Xylol-Ersatz</td>
			<td>2 Minuten</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 4: Hämatoxylin-Gegenfärbung

Hier beschreiben wir eine Methode, um Organoide des Glioblastoms (GBM) aus primären Patientenproben oder von Patienten stammenden Zellkulturen zu erzeugen und bis zur Reife zu erhalten. Diese GBM-Organoide enthalten phänotypisch vielfältige Zellpopulationen und bilden Tumormikroumgebungen ex vivo nach.

Erhaltung der zellulären Vielfalt des menschlichen Glioblastoms ex vivo unter Verwendung dreidimensionaler Organoidkultur

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Die Suche nach Behandlungen für Glioblastome ist aufgrund der zellulären Vielfalt, die in Tumoren existiert, und der Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Mikroumgebungen schwierig. Organoide können helfen, einen Teil dieser räumlichen Vielfalt wiederherzustellen, und wir können dies nutzen, um die Biologie der Tumore besser zu verstehen. Während traditionelle Zellkulturmethoden dazu neigen, homogene Tumorzellpopulationen zu produzieren, können Organoide die molekulare und zelluläre Vielfalt des Glioblastoms besser nachahmen und intratumorale Interaktionen besser modellieren.Organoide können verwendet werden, um die Wirksamkeit von Medikamenten und Resistenzmechanismen zu untersuchen. Resistenzen gegen klinische Therapien können nur in Organoiden und nicht in der traditionellen Sphärenkultur auftreten, was die klinische Realität dieser Krankheit widerspiegelt. Organoide können helfen, die regionalen Effekte von Chemotherapien nachzuweisen.Sie können verwendet werden, um neue nischenspezifische Therapien zu entdecken, und sie können auch als prädiktives Werkzeug für die personalisierte Medizin in der Zukunft dienen. Einige Materialien, die zur Herstellung von Organoiden verwendet werden, sind temperaturempfindlich, und die Vernachlässigung, diese Materialien auf ihrer richtigen Temperatur zu halten, kann zu Schwierigkeiten bei der Herstellung oder Aufrechterhaltung von Organoiden führen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Organoidformen unter einer Kulturhaube, indem Sie das Wachspapier von der Parafilmfolie nehmen und zwischen zwei sterilen 96-Well-Polymerase-Kettenreaktions- oder PCR-Platten legen.Stellen Sie sicher, dass die Innenseite des Parafilms sauber ist. Üben Sie gleichmäßigen Druck auf die obere Platte aus, um kleine, zwei Millimeter tiefe Grübchen im Parafilm zu bilden, ohne Löcher zu erzeugen. Trennen Sie die Platten.Der Noppen-Parafilm klebt an der oberen Platte. Stellen Sie dann die obere Platte für 30 Sekunden auf Trockeneis. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um den Parafilm in einer schnellen Bewegung von der oberen Platte zu ziehen.Gefrorener Parafilm ist leichter zu entfernen. Legen Sie die fertige Parafilmform in eine abgedeckte, sterile 10-Zentimeter-Zellkulturschale. Um die einzellige Suspension aus Glioblastom- oder GBM-adhärenter Kultur herzustellen, entfernen Sie die verwendeten Medien von der Platte.Dann fügen Sie zwei Milliliter Zellablösungslösung bei Raumtemperatur auf die Platte und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad für drei Minuten. Nachdem Sie die Zellablösung von der Platte unter dem Mikroskop bestätigt haben, fügen Sie acht Milliliter Neurobasal Medium Complete oder NBMc-Medium hinzu, um die Zellablösungslösung zu neutralisieren. Die Suspension durch ein einzelnes 70-Mikron-Zellsieb abseihen.Drehen Sie die Zellen bei 120 mal G für fünf Minuten herunter. Dann entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter NBMc. Zählen Sie die Zellen aus der Einzelzellsuspension mit einer Zellunmittelfärbung.Um Organoide aus einer einzelligen Suspension herzustellen, fügen Sie eine geeignete Menge Laminin-reicher extrazellulärer Matrix oder lrECM in ein kleines Zentrifugenröhrchen in einem Eiskübel oder kalten Block hinzu. Bereiten Sie eine Zellmischung vor, die 20.000 Zellen pro Organoid enthält. Mischen Sie die lrECM-Zellsuspensionsmischung gründlich, um eine Ansiedlung der Zellen zu vermeiden, die zu einer ungleichmäßigen Organoidbildung führen würde.Als nächstes pipetten Sie vorsichtig 20 Mikroliter der Mischung auf eine Parafilmform, um ein perlenartiges Tröpfchen zu bilden. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze alle zwei bis drei Organoide gekühlt wird, um eine lrECM-Polymerisation zu verhindern. Sobald die gewünschte Anzahl von Organoiden in einer 10-Zentimeter-Kulturplatte auf die Parafilmform pipettiert wurde, inkubieren Sie die Organoide bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Stunden in einem Zellkulturinkubator.Nachdem die Organoide verfestigt sind, spülen Sie die Organoide mit einer P1000-Spitze vorsichtig mit NBMc-Medium von der Parafilmform ab und sammeln Sie sie in einer neuen 10-Zentimeter-Kulturplatte mit 20 Milliliter NBMc. Legen Sie die Kulturplatte vier Tage lang ohne Schütteln in einen Inkubator. Ersetzen Sie nach vier Tagen die Medien in der Platte.Legen Sie dazu ein Stück dunkles Papier unter die Zellkulturplatte. Neigen Sie die Platte und warten Sie 20 Sekunden. Wenn sich die Organoide vollständig am Boden der Schale absetzen, entfernen Sie das Medium langsam mit einer großflächigen Glaspipette.Nachdem Sie neue Medien hinzugefügt haben, legen Sie die Platte in den Inkubator auf einem Orbitalschüttler bei 80 U/min und wechseln Sie danach alle zwei bis drei Tage die Medien aus. Das Wachstum des Organoids wurde lichtmikroskopisch beobachtet. In der mittleren Ansicht zeigte das frühe Organoidwachstum Migration und Einzelzellinvasion durch lrECM.Die reifen Organoide nach sieben Wochen waren relativ zur Größe eines Cents. Die immunhistochemische Färbung der GBM-Organoide mit Phospho-Histon H3 zeigte im Vergleich zum Kern hochproliferative Zellen mit braunem oder violettem Aussehen im Organoidumfang. Die Zelllebensfähigkeitsdaten für Organoide in 0,1% DMSO zeigten intraorganoide und interorganoide Konsistenz.Achten Sie auf organoide Biomasse und Medienversauerung. Wenn die Organoide zu schnell durch Medien gehen, achten Sie darauf, die Medien häufiger auszutauschen oder die Organoide auf zusätzliche Platten aufzuteilen. Ausgereifte Organoide können für Experimente mit Therapien verwendet oder eingebettet und geschnitten für die Verwendung mit Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz verwendet werden.Die dissoziierten Organoide können für die FACS-Analyse verwendet werden. Diese Organoide wurden kürzlich im dreidimensionalen funktionellen Screening verwendet, um Ziele zu entdecken, die in räumlich unterschiedlichen Krebsstammzellnischen unerlässlich sind. Wir verwenden diese Modelle auch, um verschiedene Medikamente und Therapien vor In-vivo-Tests zu priorisieren.

maintaining-human-glioblastoma-cellular-diversity-ex-vivo-using-three

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Das Video zeigt die Erzeugung und Pflege von organotypischen Schnittkulturen aus Glioblastomgewebe. Das isolierte Gewebe wird in eine Agarose-Matrix eingebettet und mit Hilfe eines Vibratoms werden Dünnschliffe erhalten. Diese Abschnitte werden dann auf permeable Membraneinsätze innerhalb einer Mikroplatte gelegt und zur Langzeitpflege in einem Scheibenkultur-Erhaltungsmedium kultiviert.

Erzeugung und Pflege von Schnittkulturen aus humanem Glioblastomgewebe

Dieses Video beschreibt die Herstellung und Kultivierung von Hirntumor-Organoiden aus Einzelzellsuspension. Durch die Verwendung einer lamininreichen extrazellulären Matrix als Gerüst und Nährmedium für Nährstoffe werden die Zellen in die Lage versetzt, sich innerhalb des Organoids zu vermehren und selbst zu organisieren. Folglich werden ex vivo Organoide erzeugt, die die zelluläre Vielfalt und die Mikroumgebung von Hirntumoren nachahmen.

Erzeugung einer Organoidkultur aus einer Suspension von Hirntumorzellen

Protokoll zur Verbreitung von dissoziierten hochgradigen chirurgischen Gliomproben im serumfreien Neurosphärenmedium zur Auswahl für Zellen mit Krebsstammzellphänotyp. Für Proben, die nicht als Neurosphären wachsen, wird ein alternatives Protokoll vorgeschlagen. Eine Paraffin-Einbettungstechnik zur Aufrechterhaltung der 3D-Neurosphärenarchitektur für die Immunzytochemie wird beschrieben.

Optimierung der hochwertigen Gliom-Zellkultur von chirurgischen Proben für den Einsatz in klinisch relevanten Tiermodellen und 3D-Immunchemie

Aktuelle Ex-vivo- Modelle von Glioblastom (GBM) sind nicht für eine physiologisch relevante Untersuchung der menschlichen Tumorinvasion optimiert. Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung und Pflege von organotypischen Scheibenkulturen aus frischem menschlichem GBM-Gewebe vor. Es wird eine Beschreibung der Zeitraffer-Mikroskopie und der quantitativen Zellmigrationsanalyse-Techniken gegeben.

Ein menschliches Glioblastom Organotypisches Scheibenkulturmodell zur Untersuchung der Tumorzellmigration und patientenspezifischen Wirkungen von antiinvasiven Arzneimitteln

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für dreidimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen innerhalb orthogonal abstimmbaren Biomaterialien entwickelt, um das Gehirn-Matrix zu imitieren. Dieser Ansatz bietet eine in Vitro, experimentelle Plattform, die viele Eigenschaften von in Vivo Glioblastom-Zellen in der Regel in Kultur verloren beibehält.

Hyaluronsäure basierte Hydrogele für 3-dimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen

Diese Studie stellt Protokolle vor und beschreibt Protokolle, um zwei spezifische menschliche neurale Organoide als relevantes und genaues Modell für die Untersuchung von 1) der Entwicklung des menschlichen Glioblastoms innerhalb menschlicher neuronaler Organoide ausschließlich beim Menschen und 2) neuronendopaminergen Organoiden abzuleiten. Differenzierung, die ein dreidimensionales Organoid erzeugt.

Human neurale Organoide zur Untersuchung von Hirntumor und neurodegenerativen Erkrankungen

Hier beschreiben wir einen einfach zu bedienenden Invasionstest für Glioblastom. Dieser Test eignet sich für glioblastom-Stammzellen. Ein Fidschi-Makro zur einfachen Quantifizierung von Invasion, Migration und Proliferation wird ebenfalls beschrieben.

Ein 3D Spheroid Modell für Glioblastom

Diese Studie stellt eine automatisierte Methode zur Erzeugung von 3-dimensionalen Organoiden aus dem Glioblastom eines Patienten unter Verwendung eines Gewebezerkleinerers vor. Die Methode bietet einen geeigneten und effektiven Ansatz, um solche Organoide für therapeutische Tests zu erhalten.

Kultivierung von ex vivo patienteneigenen Gliom-Organoiden mit einem Gewebe-Chopper

IDH1-mutierte diffuse niedriggradige Gliome sind seltene Tumoren, die schwer zu kultivieren sind. Wir stellen eine einfache, nicht-enzymatische Explantatmethode vor, die die Expression des IDH1-mutierten Proteins bewahrt und die Kulturen über Monate aufrechterhält. Wichtig ist, dass diese Technik mit kryokonservierten Tumoren funktioniert und eine wertvolle Ressource für die Gliomforschung darstellt.

Ein Protokoll für Explantatkulturen von IDH1-mutierten diffusen niedriggradigen Gliomen

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