Name: Wirkung von Hyaluronsäure 35 kDa auf ein In-vitro-Modell der vorzeitigen Dünndarmverletzung und Heilung unter Verwendung enteroid-abgeleiteter Monoschichten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Lernen Sie den Scratch-Wound-Assay für Darmschleimhautregeneration mit Enteroid-Monoschichten. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Visualisierung der Wundheilung in einem prätermen Säugetiermodell.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dieser Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. HC wird durch den Zuschuss P20GM134973 der National Institutes of Health unterstützt. KB wird durch einen Zuschuss der Children's Hospital Foundation (CHF) und der Presbyterian Health Foundation (PHF) unterstützt. Lebendzellbildgebungsdienste, die vom Kern der Cancer Functional Genomics bereitgestellt werden, wurden teilweise durch den National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 und den National Cancer Institute Grant P30CA225520 der National Institutes of Health unterstützt, die an das Stephenson Cancer Center der University of Oklahoma Health Sciences Center vergeben wurden.

Alle Tierverfahren in dieser Studie wurden vom University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Nach institutioneller Zulassung wurden fetale Dünndarmproben von einem frühgeborenen nichtmenschlichen Primaten (NHP, 90% Trächtigkeit, Olivenpavian, Papio anubis) nach Euthanasie für eine separate Studie gewonnen (Protokoll #101523-16-039-I)20.
1. Etablierung von frühgeborenen nicht-menschlichen Primaten 3D Darmenteroide
<ol><li>Medienvorbereitung HINWEIS: Medien können bis zu 1 Woche vor der Kryptenisolierung nach aseptischer Standardtechnik vorbereitet werden. Penicillin / Streptomycin (Endkonzentration 1%) kann auf Wunsch anstelle der Breitbandantibiotika für Primärzellen verwendet werden.<ol><li>Bereiten Sie humanes Organoid-Wachstumsmedium + Y-27632 (HOGMY) vor, indem Sie 50 ml Organoid-Wachstumsmedium humanes Basalmedium mit 50 ml Organoid-Ergänzung mischen (Materialtabelle). Fügen Sie 200 μL der Breitbandantibiotika (Endkonzentration 100 μg/ml) (Tabelle der Materialien) und Y-27632 (zu einer Endkonzentration von 10 μM) hinzu. Auf der Tischplatte auf Raumtemperatur erwärmen.</li>
		<li>Bereiten Sie humanes Organoid-Wachstumsmedium (HOGM) vor, indem Sie 50 ml Organoid-Wachstumsmedium menschliches Basalmedium mit 50 ml Organoid-Ergänzung mischen. Fügen Sie 200 μL der Breitbandantibiotika (100 μg / ml) hinzu. Auf der Tischplatte auf Raumtemperatur erwärmen. HINWEIS: HOGM wird verwendet, wenn Medien über die ersten 2-3 Tage nach der Passage hinaus gewechselt werden.</li>
		<li>100 ml 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Kalzium oder Magnesium eiskalt kühlen.</li>
		<li>Bereiten Sie 50 ml Waschpuffer vor, indem Sie 1x PBS ohne Kalzium oder Magnesium mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) kombinieren. Kühlen Sie es, bis es eiskalt ist.</li>
		<li>Bereiten Sie den DMEM-F12-Waschpuffer vor, indem Sie 1 ml der Breitbandantibiotika (100 μg/ml) zu 500 ml DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F12 + 15 mM HEPES-Puffer) hinzufügen. Halten Sie es eiskalt.</li>
	</ol></li>
	<li>Crypt-Isolierung und -Beschichtung HINWEIS: Hydrogel auf Basis der extrazellulären Matrix (ECM) muss während des gesamten Verfahrens auf dem Eis verbleiben. Dieses Verfahren setzt genügend Gewebe voraus, um sechs ECM-basierte Hydrogelkuppeln zu besiedeln. Wenn eine andere Dichte von Krypten geerntet wird, sollte die Domnummer entsprechend geändert werden.<ol><li>150 μL Wachstumsfaktor-reduzierter (GFR) Basalmembranextrakt (BME) (phenolrotfrei) über Nacht auf dem Eis bei 2-8 °C auftauen.</li>
		<li>Inkubieren Sie eine mit 24 Vertiefungen behandelte Polystyrolplatte mit flachem Boden in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 für mindestens 30 Minuten vor Gebrauch.</li>
		<li>Nach NHP-Euthanasie und Gewebeentnahme spülen Sie das Ileumsegment der Trümmer mit einer 1.000 μL Pipettenspitze mit eiskaltem 1x PBS in einer Einweg-Petrischale. HINWEIS: Frisches Gewebe muss schnell geerntet und eiskalt gehalten werden, um gesunde Enteroide zu ernten.</li>
		<li>Das Ileum längs entlang des gesamten Darms schneiden und mit eiskaltem PBS 3x waschen. Zerkleinern Sie das Gewebe in kleine Fragmente (ca. 2 mm Länge) mit einer sterilen Schere über einem 50 ml konischen Röhrchen, das 15 ml eiskaltes PBS enthält, beginnend mit dem Teil des Ileumsegments, der dem Röhrchen am nächsten ist.</li>
		<li>Verwenden Sie eine serologische 10-ml-Pipette, um die Krypten zu stören, indem Sie 5-10x auf und ab pipettieren. Lassen Sie die Gewebesegmente auf dem Boden des Röhrchens absetzen, entfernen Sie dann den Überstand und ersetzen Sie ihn durch frisches, eiskaltes PBS. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens 7x-10x, bis der Überstand klar und frei von Ablagerungen ist.</li>
		<li>Sobald Sie klar sind, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Krypten in 25 ml Zelldissoziationsreagenz. Stellen Sie das Rohr bei 20 U/min für 15 min bei Raumtemperatur auf eine Schaukelplattform.</li>
		<li>Entfernen Sie den Schlauch aus der Wippe, lassen Sie die Zellen etwa 30 s bis 1 Minute ruhen und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 10 ml eiskalten Waschpuffer hinzu. Pipettieren Sie mit einer p1000-Pipette auf und ab, um weiter in einzelne Krypten zu dissoziieren.</li>
		<li>Filtern Sie das Gewebe durch ein 70 μm Zellsieb in ein neues 50 ml konisches Röhrchen. Spülen Sie den originalen 50-ml-Konikusschlauch mit 10 ml eiskaltem Waschpuffer ab und filtern Sie durch das 70-μm-Sieb, um sicherzustellen, dass alle Krypten aus dem Originalröhrchen entfernt wurden. Wiederholen Sie dieses Waschen des Taschentuchs für insgesamt 4x Spülungen.</li>
		<li>Das Filtrat bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. Fügen Sie 600 μL HOGMY hinzu und zerbrechen Sie das Pellet, indem Sie mit einer 200 μL Pipette auf und ab pipettieren. Stellen Sie das Röhrchen auf Eis, bis die Lösung eiskalt wird. HINWEIS: Wenn die Lösung nicht eiskalt ist, behält die Kuppel nicht die richtige Struktur, wenn sie beschichtet ist. Vermeiden Sie das Einbringen von Blasen beim Pipettieren von ECM-basierten Hydrogelkuppeln, da Blasen ein ordnungsgemäßes Anhaften am Plattenboden verhindern.</li>
		<li>Fügen Sie 600 μL eiskaltes Hydrogel auf ECM-Basis hinzu, um das Zellpellet zu suspendieren, und mischen Sie es gut mit einer 200 μL Pipette.</li>
		<li>Nehmen Sie die 24-Well-Platte aus dem Inkubator und legen Sie sie auf einen 37 °C heißen Plattenwärmer. 50 μL eiskaltes Hydrogelgemisch auf HOGMY/ECM-Basis werden in die Mitte von 24 Vertiefungen einer 24-Well-Kulturplatte (50 μL pro Kuppel) pipettiert.</li>
		<li>Nach der Beschichtung lassen Sie die Kuppeln 1 Minute lang auf einem 37 °C warmen Plattenwärmer sitzen, damit sie am Boden der Platte haften bleiben. Drehen Sie die Platte vorsichtig um, stellen Sie sicher, dass sich kein Kondenswasser auf der Unterseite der Platte angesammelt hat, und legen Sie die umgekehrte Platte bei 37 °C und 5% CO2 in den Inkubator.</li>
		<li>Drehen Sie die Platte nach 15 Minuten mit der rechten Seite nach oben und pipettieren Sie 750 μL HOGMY bei Raumtemperatur in jede Vertiefung. HINWEIS: Pipetten Sie Medien langsam auf die Seitenwand von Vertiefungen, achten Sie darauf, die neu gebildete 3D-ECM-basierte Hydrogelkuppel nicht zu stören.</li>
		<li>Sobald alle Vertiefungen mit Medien gefüllt sind, legen Sie die Platte in den Inkubator und wechseln Sie das Medium alle 3 Tage mit 750 μL HOGM. Passage Enteroide alle 7-10 Tage.</li>
	</ol></li>
	<li>Intestinale enteroide Passaging HINWEIS: Das folgende Protokoll gilt für eine 24-Well-Kulturplatte, die NHP-Enteroide mit einer Splitrate von 1:2 enthält.<ol><li>Entfernen Sie die enteroiden Medien aus jeder Vertiefung, achten Sie darauf, die ECM-Kuppel, die Enteroide enthält, nicht zu stören, geben Sie 500 μL eiskaltes Zelldissoziationsreagenz mit einer 1.000 μL Pipette in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 Minute.</li>
		<li>Unterbrechen Sie die ECM manuell, indem Sie 8-12x auf und ab pipettieren. Den Inhalt von 12 Vertiefungen in ein konisches 15-ml-Rohr überführen.</li>
		<li>Sobald die gesamte Lösung von der 24-Well-Kulturplatte gesammelt wurde, fügen Sie 250 μL Zellaufschlussreagenz zu jeder Vertiefung hinzu, um sicherzustellen, dass alle NHP-Enteroide aus jeder Vertiefung entfernt wurden, und fügen Sie diese letzte Spülung zu den vorhandenen 15-ml-konischen Röhrchen hinzu.</li>
		<li>Auf eine Schaukelplattform bei 40 U/min für 15 min bei Raumtemperatur (20 °C) stellen. Alternativ können Sie die Röhrchen 15 min bei Raumtemperatur manuell schütteln.</li>
		<li>Nach 15 min bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand aus den 15-ml-Röhrchen, bis nur noch das Pellet übrig ist.</li>
		<li>Fügen Sie 8 ml eiskaltes DMEM + Breitbandantibiotika in ein 15 ml konisches Röhrchen hinzu und stellen Sie sicher, dass das Pellet ausreichend gestört ist. Bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen.</li>
		<li>Fügen Sie 600 μL HOGMY hinzu und brechen Sie das Pellet auf, indem Sie mit einer 1.000 μL Pipette auf und ab pipettieren. Stellen Sie das Röhrchen auf Eis, bis die Lösung eiskalt wird. Sobald die Lösung eiskalt ist, fügen Sie 600 μL eiskaltes ECM hinzu, um das Zellpellet aufzuhängen und gut mit einer 1.000 μL Pipette zu mischen. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.2.-1.3.7. für die restlichen 12 Bohrungen.<ol><li>Die restlichen Schritte finden Sie in den Schritten 1.2.11.-1.2.16.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Etablierung eines enteroiden Monolayer- und Kratzwundtests
<ol><li>Medien- und Behandlungsvorbereitung<ol><li>Kühlen Sie 5 ml PBS ohne Kalzium oder Magnesium eiskalt.</li>
		<li>Bereiten Sie den DMEM-F12-Waschpuffer vor, indem Sie 1 ml der Breitbandantibiotika (100 μg/ml) zu 500 ml DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F12 + 15 mM HEPES-Puffer) hinzufügen. Eis kalt halten.</li>
		<li>Bereiten Sie 100 ml HOGMY vor, wie in Schritt 1.1.1 beschrieben, und erwärmen Sie es auf dem Tisch, um Raumtemperatur zu erreichen.</li>
		<li>25 ml 0,25% Trypsin-ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in einem 37 °C warmen Wasserbad.</li>
		<li>Bereiten Sie 50 μg/ml, 100 μg/ml und 200 μg/ml HA35 für die Zellbehandlung unter Verwendung von sterilem PBS ohne Kalzium oder Magnesium als Lösungsmittel vor. Bei der endgültigen Verdünnung von HA35 wird HOMGY als Lösungsmittel verwendet. HINWEIS: HA35-Präparation kann mehrere Verdünnungen erfordern, da HA35 oft in einer Konzentration von mehr als 5 mg / ml aus der Lösung kommt.</li>
	</ol></li>
	<li>Enteroide Monoschichtbildung HINWEIS: Das folgende Verfahren liefert Volumina, die für die Erzeugung einer 24-Well-Platte enteroider Monoschichten ausreichen. Stellen Sie die Lautstärken für die gewünschte Anzahl von Monolayern ein.<ol><li>96 μL ECM-basiertes Hydrogel BME (phenolrotfrei) über Nacht auf Eis bei 2-8 °C auftauen. Verdünntes Hydrogel auf ECM-Basis in eiskaltem PBS ohne Calcium oder Magnesium im Verhältnis 1:50. Beschichten Sie jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte mit 200 μL eiskalt verdünntem Hydrogel auf ECM-Basis.</li>
		<li>Die ECM-basierte Hydrogel-beschichtete Platte für mindestens 1 h bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren. Aspirieren Sie Medien aus der 24-Well-Kulturplatte, die die für Monoschichten bestimmten 3D-Enteroide enthalten, und ersetzen Sie sie durch 500 μL Zelldissoziationsreagenz / Well.</li>
		<li>Stören Sie ECM-basierte Hydrogelkuppeln manuell, indem Sie 8x-12x auf und ab pipettieren und den Inhalt von 12 Vertiefungen in ein 15-ml-konisches Röhrchen übertragen.</li>
		<li>Waschen Sie die 12 leeren Vertiefungen mit 250 μL Zelldissoziationsreagenz, um sicherzustellen, dass alle Enteroide entfernt wurden, und geben Sie den Inhalt in ein 15-ml-konisches Röhrchen. Wiederholen Sie Schritt 2.2.5. und Schritt 2.2.6. für die restlichen 12 Vertiefungen mit einem zweiten 15-ml-konischen Rohr.</li>
		<li>Die konischen Röhrchen bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Fügen Sie 10 mL eiskalten DMEM-F12-Waschpuffer in 15 ml konische Röhrchen hinzu und suspendieren Sie die enteroiden Pellets durch Inverdrehen der Röhrchen. Bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 12 ml 37 °C Trypsin-EDTA. Legen Sie die Röhrchen für 10 min in ein 37 °C warmes Wasserbad oder bis die Zellen löslich erscheinen. Fügen Sie jedem Röhrchen 3 ml DMEM-F12-Waschpuffer hinzu, um Trypsin-EDTA zu verdünnen, mischen Sie es durch Invertieren der Röhrchen und legen Sie es auf Eis.</li>
		<li>Filtern Sie die dissoziierten Enteroide durch ein 37 μM Mesh-Zellsieb und sammeln Sie den Inhalt in sauberen 15 ml konischen Röhrchen. Die Röhrchen bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
		<li>Während die Zellen in der Zentrifuge pelletieren, entfernen Sie die ECM-basierte Hydrogel-beschichtete Platte aus dem Inkubator und saugen Sie überschüssige ECM-basierte Hydrogellösung ab, ohne die beschichtete Oberfläche zu zerkratzen oder die Platte vollständig trocknen zu lassen.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand aus den konischen Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellpellets mit 6 mL HOMGY. Geben Sie 500 μL der kombinierten 12-ml-HOMGY-Zellsuspension in jede Vertiefung der 24-Well-Platte, die mit ECM-basiertem Hydrogel beschichtet ist, bei einer Seeding-Dichte von etwa 3 x 105 Zellen/Well. Schwenken Sie die Platte mit einem Deckel, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in den Vertiefungen zu gewährleisten.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C und 5% CO 2und wechseln Sie die HOMGY-Medien alle 2 Tage, bis die Monoschichten &gt;90% Konfluenz erreichen.</li>
	</ol></li>
	<li>Monolayer-Behandlung und Kratzwundtest<ol><li>Sobald die Monoschichten &gt;90% Konfluenz erreicht haben, saugen Sie Medien ab, um alle Zellen zu entfernen, die sich nicht anhaften. Behandeln Sie Zellen mit 500 μL HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) oder PBS, gelöst in HOMGY, für 24 h.</li>
		<li>Entfernen Sie nach 24 h das Medium und achten Sie darauf, die Oberfläche der Monoschicht nicht zu stören. Machen Sie mit einer 200-μL-Pipettenspitze einen linearen Kratzer über den gesamten Oberflächendurchmesser der Monoschicht in jeder Vertiefung und achten Sie darauf, die Monoschichten nicht trocknen zu lassen.</li>
		<li>Waschen Sie die zerkratzten Monolagen 1x mit 500 μL 1x PBS. 500 μL HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) oder PBS gelöst in HOMGY und Transfer der Platte in das Lebendzellenanalysegerät (Table of Materials) innerhalb eines 37 °C und 5% CO2-Inkubators.</li>
		<li>Klicken Sie unter dem Symbol Zeitplan in der Live-Cell-Analysesoftware (Materialverzeichnis) auf das Symbol Assistent zum Hinzufügen neuer Schiffe starten und legen Sie die Scanhäufigkeit so fest, dass nach einem Zeitplan gescannt wird. Erstellen Sie unter Scantyp ein neues Whole Well-Gefäß, geben Sie die Scaneinstellungen an (z. B. Phase für Bildkanäle und 4x für Objektiv) und klicken Sie auf Weiter.</li>
		<li>Wählen Sie den Plattenhersteller und die Katalognummer aus der bereitgestellten Liste aus. Wählen Sie unter dem Symbol Zeitplan das Plus-Symbol aus, an dem die Platte im Analysegerät für lebende Zellen platziert wird. Wählen Sie das gewünschte Scanmuster aus, und erstellen Sie dann eine Plattenzuordnung, indem Sie auf der Seite Plattenlayout "+" auswählen. Wählen Sie Analyse auf später verschieben aus, legen Sie dann den Scanzeitplan für alle 4 Stunden für 24 Stunden fest und überprüfen Sie die Erfassungseinstellungen auf der Seite Zusammenfassung des Schiffsassistenten. Wählen Sie abschließend Zum Zeitplan hinzufügen aus.</li>
		<li>Sobald der 24-Test abgeschlossen ist, doppelklicken Sie unter dem Symbol Ansicht auf Schiffsname und exportieren Sie Bilder und Filme. Wählen Sie Vertiefungen und eine Reihe von Bildern aus, die angezeigt und als JPEG exportiert werden sollen. Analysieren Sie Bilder auf prozentuale Wundheilung mit dem Wundheilungsgrößen-Plugin für ImageJ21 gemäß Schritt 2.4. unter.</li>
	</ol></li>
	<li>Kratzwundanalyse<ol><li>Öffnen Sie die ImageJ-Software. Laden Sie die Kratzwund-Assay-Bilder hoch (. TIFF oder .JPG).</li>
		<li>Wählen Sie Bild &gt; Geben Sie &gt; 8-Bit ein, um das Bild von 24-Bit-RGB in 8-Bit zu ändern. Installieren Sie das Wundheilungsgrößen-Plugin, indem Sie Plugins &gt; Makros auswählen &gt; &gt; Wundheilungsgrößen-Plugin installieren.</li>
		<li>Drehen Sie das Bild so, dass der Kratzer vertikal ist, und initialisieren Sie das Wundheilungsgrößentool-Plugin.</li>
		<li>Wählen Sie die Plugin-Parameter im Dialogfeld aus, um die Kratzwunde optimal anzupassen. Legen Sie den Wert der Parameter für die Größenoptionen für die Wundheilung wie folgt fest: Varianzfensterradius bei 20, Schwellenwert bei 100 und Prozentsatz gesättigter Pixel bei 0,001, und wählen Sie Ja für Globale Skalierung festlegen aus. Schließen Sie die Auswahl ab, indem Sie auf die Schaltfläche OK klicken. Überprüfen Sie, ob der ausgewählte Bereich der Wundbereich ist. Die oben genannten Parameter erfordern möglicherweise eine Standardisierung von Labor zu Labor.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.4.2.-2.4.4. für die verbleibenden Zeitpunkte für jeden Kratzer.</li>
		<li>Berechnen Sie den Prozentsatz der Wundheilung im Kratzbereich von wandernden oder proliferierenden Zellen über 24 h wie folgt: % Wundheilung = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63758/63758eq01.jpg" style="margin: auto;"> wobei T 0 = % Fläche zum Zeitpunkt 0 h und Tc = % Fläche bei 0 h, 4 h, 12 h oder 24 h ist.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lemons, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+low+birth+weight+outcomes+of+the+National+Institute+of+Child+Health+and+Human+Development+Neonatal+Research+Network%2C+January+1995+through+December+1996%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996.</a> Pediatrics. 107 (1), 1(2001).</li>
<li>Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+composition%2C+digestion%2C+and+absorption+differences+among+neonatal+feeding+strategies%3A+Potential+implications+for+intestinal+inflammation+in+preterm+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants.</a> Nutrients. 13 (2), 550(2021).</li>
<li>Duffy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+mediating+bacterial+translocation+in+the+immature+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine.</a> The Journal of Nutrition. 130, 2S Suppl 432-436 (2000).</li>
<li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis%3A+An+immature+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776(2011).</li>
<li>Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+the+developing+human+intestine%3A+A+possible+pathophysiologic+contribution+to+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).</li>
<li>He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+components+modulate+toll-like+receptor-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation.</a> Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).</li>
<li>Walker, W. A., Iyengar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+milk%2C+microbiota%2C+and+intestinal+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis.</a> Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).</li>
<li>Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+enteral+supplementation+of+a+prebiotic+mixture+of+non-human+milk+galacto-%2C+fructo-+and+acidic+oligosaccharides+on+intestinal+permeability+in+preterm+infants%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants.</a> British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).</li>
<li>vanden Berg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+glutamine-enriched+enteral+nutrition+on+intestinal+permeability+in+very-low-birth-weight+infants%3A+A+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parenteral+and+Enteral+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial.</a> Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).</li>
<li>Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+immunoglobulin+for+preventing+necrotizing+enterocolitis+in+preterm+and+low+birth+weight+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).</li>
<li>Maffei, D., Schanler, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+is+the+feeding+strategy+to+prevent+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).</li>
<li>Patel, A. L., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+and+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human milk and necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).</li>
<li>Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+immunomodulating+components+of+maternal+breast+milk+and+protection+against+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis.</a> Nutrients. 12 (1), 14(2019).</li>
<li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+hyaluronan+enhances+innate+defense+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).</li>
<li>Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glycosaminoglycans+in+protection+from+neonatal+necrotizing+enterocolitis%3A+A+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review.</a> Nutrients. 12 (2), 546(2020).</li>
<li>Chaaban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+small+intestine+development+and+remodeling+of+the+microbiome+following+hyaluronan+35+kDa+treatment+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice.</a> Nutrients. 13 (6), 2030(2021).</li>
<li>Gunasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+35+kDa+enhances+epithelial+barrier+function+and+protects+against+the+development+of+murine+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).</li>
<li>Montenegro-Miranda, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4%CE%B1+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li>
<li>Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+regeneration+ability+of+Crohn%27s+disease+assessed+using+patient-derived+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013(2021).</li>
<li>Gurung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Zika+virus+%28ZIKV%29+infection+following+vaginal+inoculation+with+ZIKV-infected+semen+in+timed-pregnant+olive+baboons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons.</a> Journal of Virology. 94 (11), 00058(2020).</li>
<li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).</li>
<li>Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cell+migration+monitoring+to+analyze+drug+synergism+in+the+scratch+assay+using+the+IncuCyte+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system.</a> Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).</li>
<li>de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+milk+nutrients+driving+intestinal+epithelial+layer+maturation+via+Wnt+and+Notch+signaling%3A+Implications+for+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229(2021).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+protects+epithelial+cells+from+excessive+autophagy+and+apoptosis+in+experimental+neonatal+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis.</a> PLoS One. 8 (7), 69620(2013).</li>
<li>Kessler, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+role+of+35+kilodalton+hyaluronan+in+promoting+defense+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).</li>
<li>Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan%3A+Its+nature%2C+distribution%2C+functions+and+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover.</a> Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+35kDa+treatment+protects+mice+from+Citrobacter+rodentium+infection+and+induces+epithelial+tight+junction+protein+ZO-1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo.</a> Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).</li>
<li>Prehm, P., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+hyaluronan+export+from+human+fibroblasts+by+inhibitors+of+multidrug+resistance+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters.</a> Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).</li>
<li>Stenson, W. F., Ciorba, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmicrobial+activation+of+TLRs+controls+intestinal+growth%2C+wound+repair%2C+and+radioprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection.</a> Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510(2021).</li>
<li>Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+regulates+normal+intestinal+and+colonic+growth+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).</li>
<li>Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+and+TLR4+mediate+hyaluronic+acid+regulation+of+Lgr5%2B+stem+cell+proliferation%2C+crypt+fission%2C+and+intestinal+growth+in+postnatal+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).</li>
<li>Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific-sized+hyaluronan+fragments+promote+expression+of+human+beta-defensin+2+in+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).</li>
<li>Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+intestinal+epithelial+wound+healing+through+protease-activated+receptor-2+activation+in+Caco2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).</li>
<li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering+Communications%22%5BJournal%5D)">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li>
<li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272(2020).</li>
<li>Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+organoids%3A+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen und keine Interessenkonflikte.

Der Magen-Darm-Trakt eines Frühgeborenen steht unter ständigem regenerativem Druck durch wiederholte Exposition gegenüber Umwelteinflüssen im Zusammenhang mit Dysbiose, entzündlichen bakteriellen Metaboliten und Toxinen und intermittierender Hypoxie23,24. Leider ist das Darmepithel des Frühgeborenen nicht in der Lage, schnell funktionelle Integrität herzustellen23, was zu Barrierestörungen, erhöhter Darmpermeabilität und in schweren Fällen...

Die nekrotisierende Enterokolitis (NEC) ist einer der häufigsten gastrointestinalen Notfälle bei Frühgeborenen1. Die Krankheit ist durch eine schwere Darmentzündung gekennzeichnet, die sich schnell zu Darmnekrose, Sepsis und möglicherweise zum Tod verschlechtern kann. Obwohl die Ätiologie unklar ist, deuten Hinweise darauf hin, dass NEC multifaktoriell ist und das Ergebnis einer komplexen Wechselwirkung von Fütterung, abnormaler bakterieller Besiedlung und einem unreifen Darmepithelist 2,3. Frühgeborene haben eine erhöhte Darmpermeabilität, eine abnormale bakterielle Besiedlung und eine niedrige Enterozytenregenerationskapazität4,5, was ihr Risiko für Darmbarrierestörungen, bakterielle Translokation und NEC-Entwicklung erhöht. Daher ist die Identifizierung von Strategien oder Interventionen zur Beschleunigung der Darmepithelreifung und zur Förderung der Regeneration oder Heilung des Darmepithels entscheidend für die Verhinderung dieser tödlichen Krankheit.
Studien haben gezeigt, dass Muttermilch (HM) bei Frühgeborenen 6,7,8,9,10,11 vor NEC schützt. Sowohl Human- als auch Tierstudien haben gezeigt, dass die Formel auf Rinderbasis die Darmpermeabilität erhöht und direkt toxisch für Darmepithelzellen ist 2,12. Obwohl nicht vollständig aufgeklärt, deuten Beweise darauf hin, dass die schützende Wirkung von HM durch bioaktive Komponenten wie Lactoferrin, Immunglobulin A (IgA) und HM-Oligosaccharide vermitteltwird 13. HM ist auch reich an Hyaluron (HA), einem einzigartigen sulfatfreien Glykosaminoglykan mit wiederholter D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-Glucosamindisaccharide14,15. Wichtig ist, dass wir gezeigt haben, dass orale 35 kDa HA (HA35), eine HM HA-Nachahmung, die Schwere der Darmverletzung abschwächt, bakterielle Translokation verhindert und die Mortalität in einem murinen NEC-ähnlichen Darmverletzungsmodell verringert16,17. 
Hier werden die Wirkungen von HA35 auf die Darmheilung und Regeneration in vitro weiter untersucht. Derzeit ist der am weitesten verbreitete In-vitro-Assay für Darmverletzung und -reparatur ein Kratzwundtest, der in Darmkrebszellmonoschichten (CRC) durchgeführt wird. Die physiologische Relevanz eines solchen Modells für den Frühgeborenendarm ist begrenzt, da die Wundreparatur von Darmkrebszellen stark von der hochgradig proliferativen Natur von Krebszellen und nicht von stammzellgesteuerten Reparaturprozessen abhängt18. Um diese Einschränkung zu überwinden, wird hier die Etablierung eines enteroiden 2D-Kratzwundmodells beschrieben, einschließlich des Verfahrens zur Isolierung und Aufrechterhaltung primärer Stammzell-abgeleiteter Dünndarmenteroide von Frühgeborenen nicht-menschlichen Primaten (NHP). Da vorzeitige NEC am häufigsten im distalen Dünndarm berichtet wird, liefert die Verwendung von primären Epithelzellorganoiden in einem Modell der Darmschädigung und -reparatur ein physiologisch besser übersetzbares In-vitro-Modell im Vergleich zu bestehenden Modellen, die traditionelle kolorektale Monoschichten verwenden18,19.

<table><tbody><tr><td>10 mL Serologische Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-49</td><td></td></tr><tr><td>100x21mm Schale, Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konisches Röhrchen</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>24-Well, TC-behandelt, flache Bodenplatte</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>37 & micro; M Reversibles Zellsieb</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konisches Röhrchen</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Sterile Zellsiebe</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Albumin, Rind (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D-Zellviabilitätsassay</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium/Nährschinken-Gemisch F-12 (DMEM-F12) mit 15 mM HEPES-Puffer</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissoziationsreagenz</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0485</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument</td><td>Sartorius</td><td>4647</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module</td><td>Sartorius</td><td>9600-0012</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>06010</td><td>Das ist HOGMY, aber ohne das Y-27632 oder Antibiotika. Wird auch als Basis für HOGM verwendet, aber dann fehlen nur noch die Antibiotika.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide aus Escherichia coli O111:B4, gereinigt durch Gelfiltrationschromatographie</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basalmembranmatrix, phenolrotfreies</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon deltabehandelte Mikroplatte mit flachem Boden</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung), 1X [-] Kalzium, Magnesium, pH 7,4</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Dies ist ein Breitband-Antibiotika</td></tr><tr><td>Natriumhyaluronat, Forschungsqualität, HA20K</td><td>Lifecore Biomedical</td><td>HA20K-1</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automatisierter Zellzähler</td><td>Unternehmen: Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 1X, 0,25% Trypsin</td><td>Fisher</td><td>Scientific MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

wirkung von hyaluronsäure 35 kda auf ein in-vitro-modell der vorzeitigen dünndarmverletzung und heilung unter verwendung enteroid-abgeleiteter monoschichten

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

In-vitro-Kratzwund-Assays werden häufig verwendet, um die Mechanismen und Eigenschaften der Epithelheilung in einer Vielzahl von Gewebetypen zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung einer zweidimensionalen (2D) Monoschicht aus dreidimensionalen (3D) nichtmenschlichen Primatenenteroiden, die aus Darmkrypten des terminalen Ileums stammen. Diese enteroid-abgeleiteten Monoschichten wurden dann in einem In-vitro-Kratzwund-Assay verwendet, um die Fähigkeit von Hyaluron 35 kDa (HA35), einer menschlichen Milch-HA-Nachahmung, zu testen, Zellmigration und -proliferation entlang der epithelialen Wundkante zu fördern. Nachdem die Monolagen bis zum Konfluenzen gewachsen waren, wurden sie manuell zerkratzt und mit HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) oder Kontrolle (PBS) behandelt. Die Zellmigration und -proliferation in die Lücke wurde mit einem Durchlichtmikroskop abgebildet, das für die Bildgebung lebender Zellen ausgestattet war. Der Wundverschluss wurde mit dem Wundheilungsgrößen-Plugin in ImageJ als prozentuale Wundheilung quantifiziert. Die Kratzfläche und die Rate der Zellmigration sowie der Prozentsatz des Wundverschlusses wurden über 24 h gemessen. HA35 beschleunigt in vitro die Wundheilung in Dünndarm-Enteroid-Monoschichten, wahrscheinlich durch eine Kombination aus Zellproliferation am Wundrand und Migration in den Wundbereich. Diese Methoden können möglicherweise als Modell verwendet werden, um die Darmregeneration im Frühdarm des menschlichen Dünndarms zu untersuchen.

Die Auswirkungen von HA auf die Gewebereparatur und Wundheilung in verschiedenen Geweben und Organen sind gut dokumentiert; Die spezifischen Wirkungen von HA mit einem Molekulargewicht von 35 kDa auf die fetale oder neonatale Dünndarmheilung und -regeneration sind derzeit jedoch nicht bekannt. Um die Fähigkeit von HA35 zu testen, die Wundheilung in einem Modell des fetalen oder neonatalen Dünndarms zu fördern, erzeugten wir 3D-Darmenteroide aus NHP-Ileumgewebe und dissoziierten dieses Gewebe weiter in einzelne Zellen, um...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erstellung und Durchführung eines Kratzwundtests an zweidimensionalen (2D) Monoschichten, die aus dreidimensionalen (3D) Enteroiden abgeleitet sind, die aus nichtmenschlichem Primatenileum isoliert wurden.

Wirkung von Hyaluronsäure 35 kDa auf ein In-vitro-Modell der vorzeitigen Dünndarmverletzung und Heilung unter Verwendung enteroid-abgeleiteter Monoschichten

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Dieses Protokoll erweitert den sehr gebräuchlichen Kratzwundtest, der für Regenerationsstudien verwendet wird, um enteroid-abgeleitete Monoschichten, die alle wichtigen Zelltypen des Dünndarms repräsentieren. Diese Technik ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung des Wundverschlusses in einem vorzeitigen enteroiden 2D-Monolayer-Modell der Darmregeneration. Unsere Technik kann auf die Untersuchung des Frühgeborenendarms von Säugetieren angewendet werden, der typischerweise schlecht mit transformierten Darmkrebszelllinien modelliert wird.Beginnen Sie mit dem Auftauen von 96 Mikrolitern extrazellulärer Matrix oder ECM-basiertem Hydrogel BME über Nacht auf Eis bei zwei bis acht Grad Celsius. Verdünnen Sie das ECM-basierte Hydrogel und eiskaltes PBS ohne Kalzium oder Magnesium im Verhältnis eins zu 50. Beschichten Sie jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte mit 200 Mikrolitern eiskalt verdünntem Hydrogel auf ECM-Basis und inkubieren Sie die beschichtete Platte für mindestens eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Dann saugen Sie das Medium von der 24-Well-Kulturplatte ab, die die für Monoschichten bestimmten 3D-Enteroide enthält, und ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter Zelldissoziationsreagenz pro Well. Brechen Sie die ECM-basierten Hydrogelkuppeln manuell, indem Sie acht- bis 12-mal auf und ab pipettieren und den Inhalt von 12 Vertiefungen in ein 15-Milliliter-konisches Rohr übertragen. Waschen Sie die 12 leeren Vertiefungen mit 250 Mikrolitern Zelldissoziationsreagenz, um sicherzustellen, dass alle Enteroide entfernt wurden, und geben Sie den Inhalt in konische 15-Milliliter-Röhrchen.Die konischen Röhrchen bei 300g fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand verwerfen. 10 Milliliter eiskalter DMEM/F-12-Waschpuffer in die konischen Röhrchen geben und die enteroiden Pellets durch Inverdrehen der Röhrchen aufhängen. Bei 300g fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand entfernen.Resuspendieren Sie die Zellpellets in 12 Milliliter 37 Grad Celsius Trypsin-EDTA und legen Sie die Röhrchen für 10 Minuten in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad oder bis die Zellen löslich erscheinen. Fügen Sie drei Milliliter DMEM / F-12-Waschpuffer in jedes Röhrchen hinzu, um Trypsin-EDTA zu verdünnen. Durch Umdrehen der Röhrchen mischen und auf Eis legen.Filtern Sie die dissoziierten Enteroide durch ein 37 Mikrometer großes Maschenzellsieb. Sammeln Sie den Inhalt in sauberen 15-Milliliter-konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand aus den konischen Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellpellets mit sechs Milliliter HOMGY.Als nächstes entfernen Sie die ECM-basierte Hydrogel-beschichtete Platte aus dem Inkubator und saugen Sie überschüssige ECM-basierte Hydrogellösung ab, ohne die beschichtete Oberfläche zu zerkratzen oder die Platte vollständig auszutrocknen. Fügen Sie 500 Mikroliter der kombinierten 12 Milliliter HOMGY-Zellsuspension in jede Vertiefung der 24-Well-Platte hinzu, die mit ECM-basiertem Hydrogel beschichtet ist. Schwenken Sie die Platte mit aufgesetztem Deckel, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in den Vertiefungen zu gewährleisten.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid und wechseln Sie alle zwei Tage HOMGY-Medien, bis die Monoschichten mehr als 90% Konfluenz erreichen. Sobald die Monoschichten eine Konfluenz von mehr als 90% erreicht haben, saugen Sie das Medium ab, um alle Zellen zu entfernen, die sich nicht anhaften. Behandeln Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern HA35 oder PBS, gelöst in HOMGY für 24 Stunden.Danach entfernen Sie das Medium, ohne die Oberfläche der Monoschicht zu stören. Machen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze einen linearen Kratzer über den gesamten Oberflächendurchmesser der Monoschicht in jeder Vertiefung und achten Sie darauf, die Monoschichten nicht trocknen zu lassen. Waschen Sie die zerkratzten Monolagen einmal mit 500 Mikrolitern 1X PBS und fügen Sie 500 Mikroliter HA35 oder PBS gelöst in HOMGY hinzu.Die Platte wird innerhalb eines Inkubators mit 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in das Analysegerät für lebende Zellen überführt. Klicken Sie in der Live-Zellanalyse-Software unter dem Symbol Zeitplan auf das Symbol Assistent zum Hinzufügen neuer Schiffe starten. Wählen Sie Scan on Schedule (Nach Zeitplan scannen) und klicken Sie dann auf Next (Weiter).Wählen Sie Neu unter Schiff erstellen und klicken Sie auf Weiter, wählen Sie dann Whole Well unter Scan Type (Scantyp) und klicken Sie auf Next (Weiter). Wählen Sie Phase für Bildkanäle und 4x für das Objektiv. Wählen Sie den Plattenhersteller und die Katalognummer aus der bereitgestellten Liste aus und klicken Sie auf Weiter.Wählen Sie eine leere Gefäßposition gefolgt von dem gewünschten Scanmuster aus. Geben Sie den Kennzeichennamen in Name ein, und wählen Sie dann plus aus, um ein Plattenlayout zu erstellen. Wählen Sie ein kleines Plus, um einen Behandlungsnamen zu erstellen.Geben Sie den Kurznamen und dann OK ein. Markieren Sie die Plattenschächten, die dieser Behandlung entsprechen, und treffen Sie ein großes Plus, um Vertiefungen mit dieser Behandlung zu kennzeichnen. Geben Sie die Konzentration der Verbindung ein und klicken Sie auf OK. Wenn die Platte fertig ist, wählen Sie OK, Weiter. Wählen Sie Analyse auf später verschieben und anschließend Neuen Zeitplan mit Scans in Intervallen von vier Stunden erstellen.Stoppen Sie das Scannen an einem Tag, null Stunden. Stellen Sie sicher, dass die Zusammenfassung korrekt ist, und fügen Sie sie dann dem Zeitplan hinzu. Wählen Sie in der Live-Zellanalyse-Software oben auf dem Bildschirm Ansicht aus.Navigieren Sie im Menü Schiffsname zu Ihrem abgeschlossenen 24-Stunden-Scan und doppelklicken Sie auf den Schiffsnamen. Wählen Sie das Symbol Bilder und Filme exportieren auf der linken Seite, gefolgt von der Option Wie angezeigt. Markieren Sie die Vertiefungen von Interesse, und wählen Sie dann die gewünschten Zeitpunkte und die angezeigte Bildserie aus.Stellen Sie sicher, dass der Sequenztyp und die Scans korrekt sind. Wählen Sie den gewünschten Speicherort des Zielordners aus. Wählen Sie JPEG aus dem Dropdown-Menü und dann Exportieren.Öffnen Sie die ImageJ-Software und laden Sie das Kratzwund-Assay-Bild hoch. Wählen Sie Bild aus, und geben Sie dann 8-Bit ein, um das Bild von 24-Bit-RGB zu ändern. Wählen Sie Plugins, Makros, Installieren Wound_healing_size Plugin aus, um das Wundheilungsgrößen-Plugin zu installieren.Danach setzen Sie den Radius des Varianzfensters auf 20, den Schwellenwert auf 100, den Prozentsatz der gesättigten Pixel auf 0,001. Ja für Set Scale global und klicken Sie dann auf OK. Stellen Sie sicher, dass der umrissene Bereich der Wundbereich ist, und wiederholen Sie den Vorgang für zusätzliche Kratzer. Berechnen Sie schließlich den Prozentsatz der Wundheilung im Kratzbereich von wandernden oder proliferierenden Zellen über 24 Stunden unter Verwendung der auf dem Bildschirm angezeigten Gleichung.Hier ist T0 der Bereich zum Zeitpunkt Null Stunden und TC ist der Bereich bei null Stunden, vier Stunden, 12 Stunden oder 24 Stunden. Die enteroide Generierung und das enteroid-abgeleitete Monolayer-Wundheilungsverfahren sind in diesen Bildern dargestellt. Eine Kultur von dreidimensionalen, nicht-menschlichen Primaten-Darm-Enteroiden wird verwendet, um in zweidimensionale Monoschichten zu dissoziieren.Monoschichten wurden auf mehr als 90% Konfluenz in einer 24-Well-Platte gezüchtet und dann 24 Stunden lang mit HA35 oder PBS behandelt. Monolagen wurden dann mit einer P200-Pipettenspitze zerkratzt. Hier sind die repräsentativen Bilder von HA35 in Kontrollbehandlungen von enteroiden Monoschichten nichtmenschlicher Primaten gezeigt.Die Bilder wurden nach null Stunden, vier Stunden, 12 Stunden und 24 Stunden nach dem Scratchen mit einer P200-Pipettenspitze aufgenommen. Die Wirkung von HA35 auf Wundheilung und oide Monoschichten wird hier gezeigt. Die Veränderung der Wundheilung im Laufe der Zeit in enteroiden Monoschichten ist abhängig von der HA35-Behandlungskonzentration.HA35 erhöhte signifikant die Wundheilung nach vier Stunden und 12 Stunden bei 100 Mikrogramm pro Milliliter und 200 Mikrogramm pro Milliliter im Vergleich zur Kontrolle, aber die Heilungsraten konvergierten zwischen den Behandlungen um 24 Stunden. Eines der wichtigsten Dinge, an die man sich bei diesem Verfahren erinnern sollte, ist, dass intestinale enteroide Monoschichten kurzlebig sind. Sobald sie zu 90% konflüssig sind, sollten die Ermittler versuchen, sie schnell zu verwenden.Diese Technik ist zu unserem bevorzugten Modell für die vorzeitige Darmregeneration in vitro geworden, insbesondere wenn wir eher an mechanischen als an entzündlichen Verletzungen interessiert sind.

effect-hyaluronic-acid-35-kda-on-an-vitro-model-preterm-small

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video zeigt die Entwicklung der nekrotisierenden Enterokolitis-Krankheit in einem humanen neonatalen enteroiden Modell, das durch die Behandlung mit Lipopolysacchariden induziert wurde. Dieses Modell hilft bei der Untersuchung der Pathophysiologie des Darms.

Induktion einer nekrotisierenden Enterokolitis im humanen epithelialen enteroiden Modell

Dieses Protokoll beschreibt die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Echtzeit folgende pharmakologische Behandlung im menschlichen Darm Organellen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und live-Cell-Mikroskopie.

Echtzeitmessung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen

Enteroids entstehen als neuartige Modell in der Studie der menschlichen Krankheit. Das Protokoll beschreibt, wie eine Enteroid Modell der menschlichen nekrotisierenden Enterokolitis mit Lipopolysaccharid (LPS) Behandlung von Enteroids generiert aus neonatalen Gewebe zu simulieren. Gesammelte Enteroids zeigen entzündliche Veränderungen, wie Sie die in menschlichen nekrotisierenden Enterokolitis gesehen.

Neuartige menschlichen epitheliale Enteroid Modellcharakter für die nekrotisierende Enterokolitis

Die von Menschen verursachte pluripotente Stammzelle (hiPSC)-abgeleitete Darm-Organoide bieten spannende Möglichkeiten, enterische Erkrankungen in vitro zu modellieren. Wir zeigen die Differenzierung von HiPSCs in Darm-Organoide (iHOs), die Stimulation dieser IHOs mit Zytokinen und die Mikroinjektion von Salmonella Typhimurium in das IHO Lumen, die die Untersuchung einer epithelialen Invasion durch diese Erreger.

Verwendung von humaninduzierten, zellabgeleiteten Intestarz-Organoiden zur Untersuchung und Modifizierung des epithelialen Zellschutzes gegen Salmonellen und andere Krankheitserreger

Hier beschreiben wir die Herstellung von humanen Organoid-abgeleiteten intestinalen Epithel-Monolayern zur Untersuchung der Darmbarrierefunktion, Permeabilität und des Transports. Da Organoide die ursprüngliche Reaktion des Epithelgewebes auf äußere Reize darstellen, kombinieren diese Modelle die Vorteile der Erweiterbarkeit von Zelllinien und die Relevanz und Komplexität von Primärgewebe.

Organoid-abgeleitete Epithel-Monolayer: Ein klinisch relevantes In-vitro-Modell für die Darmbarrierefunktion

Dieses Protokoll beschreibt ein apikal-out-nekrotisierendes Enterokolitis-Modell (NEC)-in-a-dish, das Dünndarmenteroide mit umgekehrter Polarität verwendet und den Zugang zur apikalen Oberfläche ermöglicht. Wir bieten ein Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll zum Nachweis von NEC-bedingten Epithelstörungen und eine Methode zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von apikalen Enteroiden, die dem NEC-in-a-dish-Protokoll unterliegen.

In vitro Apical-out enteroides Modell der nekrotisierenden Enterokolitis

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung von Enteroiden, einem dreidimensionalen Darmmodell, aus fetalem Darmgewebe. Immunfluoreszierende Bildgebung von epithelialen Biomarkern wurde zur Modellcharakterisierung verwendet. Die apikale Exposition von Lipopolysacchariden, einem bakteriellen Endotoxin, induzierte die epitheliale Permeabilität in einer dosisabhängigen Weise, gemessen durch das Austreten von fluoreszierendem Dextran.

Testen der Epithelpermeabilität in fetalen Gewebe-abgeleiteten Enteroiden

Hier beschreiben wir die Konstruktion eines grundlegenden dreidimensionalen (3D) intestinalen Zelllinienmodellsystems und eines Paraffin-Einbettungsprotokolls für die lichtmikroskopische Bewertung von fixierten intestinalen Äquivalenten. Die Färbung ausgewählter Proteine ermöglicht die Analyse mehrerer visueller Parameter aus einem einzigen Experiment für den potenziellen Einsatz in präklinischen Wirkstoff-Screening-Studien.

Grundlegendes dreidimensionales (3D) Darmmodellsystem mit einer Immunkomponente

Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro Modell der nekrotisierenden Enterokolitis (NEC), das für mechanistische Studien zur Krankheitspathogenese verwendet werden kann. Es verfügt über einen mikrofluidischen Chip, der mit Darmenteroiden besät ist, die aus dem menschlichen Neugeborenendarm, Endothelzellen und dem Darmmikrobiom eines Neugeborenen mit schwerem NEC stammen.

Mikrofluidisches Modell der nekrotisierenden Enterokolitis unter Einbeziehung menschlicher neonataler Darmenteroide und eines dysbiotischen Mikrobioms

Dieses Protokoll zielt darauf ab, biofunktionelle selbstorganisierende Peptide auf Zelladhäsion, Organoidmorphologie und Genexpression durch Immunfärbung zu bewerten. Wir werden eine Darmkrebszelllinie verwenden, um eine kostengünstige Möglichkeit zu bieten, Organoide für intensive Tests zu gewinnen.

Herstellung und Charakterisierung von kolorektalen Krebs-Organoiden aus der SW1222-Zelllinie in ultrakurzer selbstorganisierender Peptidmatrix

Diese Studie stellt ein Protokoll zur Generierung von 2D-Monoschichten des Rinderdarms aus Organoiden vor, das einen verbesserten Zugang zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen bietet. Es umfasst Methoden zur Bewertung der Membranintegrität und -funktionalität und entwickelt In-vitro-Modelle weiter, die die Magen-Darm-Physiologie von Rindern nachahmen. Dieser Ansatz verspricht erhebliche biomedizinische und landwirtschaftliche Vorteile, einschließlich verbesserter Behandlungsstrategien.

Fortschritte in der Rinder-Organoid-Technologie unter Verwendung von Dünn- und Dickdarm-Monolayer-Grenzflächen

Lernen Sie den Scratch-Wound-Assay für Darmschleimhautregeneration mit Enteroid-Monoschichten. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Visualisierung der Wundheilung in einem prätermen Säugetiermodell.

Wirkung von Hyaluronsäure 35 kDa auf ein In-vitro-Modell der vorzeitigen Dünndarmverletzung und Heilung unter Verwendung enteroid-abgeleiteter Monoschichten (Video) | JoVE Journal

Wirkung von Hyaluronsäure 35 kDa auf ein In-vitro-Modell der vorzeitigen Dünndarmverletzung und Heilung unter Verwendung enteroid-abgeleiteter Monoschichten

Weitere Videos entdecken