Ein Hochdurchsatz-Multiplex-Screening auf Typ-1-Diabetes, Zöliakie und COVID-19
5. Juli 2022
Im Einklang mit dem dringenden Bedarf an Screening auf Typ-1-Diabetes, Zöliakie und Coronavirus-Krankheit 2019 haben wir einen 6-Plex-Elektrochemilumineszenz-Assay mit hohem Durchsatz entwickelt, um alle vier Inselautoantikörper, Gewebetransglutaminase-Autoantikörper und Antikörper gegen die Rezeptorbindungsdomäne des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 gleichzeitig nachzuweisen.
Der neuartige 6-Plex ECL-Assay ist der erste Multiplex-Assay, der validiert und nun in klinischen Studien für das Screening der Allgemeinbevölkerung eingesetzt wird. Es kombiniert gleichzeitig sechs Autoantikörper-Assays, die für das Screening von Typ-1-Diabetes, Zöliakie und COVID-19 in einer großen Population geeignet sind. Im Vergleich zum aktuellen Standard-Autoantikörpertest kann diese Technik mehrere Autoantikörper effizienter auf mehrere Autoimmunerkrankungen gleichzeitig untersuchen.
Die Implikation dieser Technik wird das groß angelegte Screening praktikabler und krankheitsspezifischer machen, was zu einer frühen Krankheitsvorhersage für die Prävention und einer präziseren Diagnose für die Therapie führt. Fügen Sie zunächst vier Mikroliter biotinyliertes GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 und Proinsulinantigenprotein in ein Röhrchen mit 156 Mikrolitern 1% BSA hinzu und mischen Sie es mit 240 Mikrolitern entsprechender Streptavidin-konjugierter Linker, 1, 2, 3, 8, 9 und 10. Dann inkubieren Sie die Mischung für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Aliquot 160 Mikroliter Stopplösung in jedes Röhrchen und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Nehmen Sie nun 400 Mikroliter der Mischungslösung aus jedem Röhrchen und kombinieren Sie sie miteinander. Fügen Sie der Mischung vier Mikroliter Ruthenium-markiertes GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 und Proinsulinantigen hinzu.
Dann fügen Sie 1,6 Milliliter Stopplösung und 3,2 Milliliter PBS hinzu. Mischen Sie alle Komponenten gründlich. Und jetzt ist die Antigenlösung bereit für den Einsatz im Assay.
Für eine 96-Well-PCR-Platte aliquotieren Sie sieben Mikroliter Serum pro Vertiefung und bedecken Sie die Platte mit einem Siegelfilm. Als nächstes heizen Sie die Seren bei 56 Grad Celsius für 30 Minuten auf einer PCR-Maschine vor und zentrifugieren die Platte kurz bei 100 mal G für eine Minute. Fügen Sie 63 Mikroliter vorbereitete Antigenlösung pro Vertiefung hinzu, mischen Sie sie mit den Seren und bedecken Sie die PCR-Platte mit Siegelfolie, um Licht zu vermeiden.
Schütteln Sie die Platte auf einem Shaker mit einer Drehzahl von 450 U/min für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Und dann die Platte bei vier Grad Celsius für 18 bis 24 Stunden inkubieren. Nehmen Sie eine 6-Plex-Platte aus dem vier Grad Celsius warmen Kühlschrank, damit die Platte Raumtemperatur erreicht.
Fügen Sie dann 150 Mikroliter 3% Blocker A zu jeder Vertiefung der 6-Plex-Platte hinzu. Decken Sie die Platte mit Folie ab, um Licht zu vermeiden. Stellen Sie den Teller zurück in einen vier Grad Celsius heißen Kühlschrank und brüten Sie ihn über Nacht aus.
Am Ende der Inkubation, sobald die Platte aus dem Kühlschrank entfernt wurde, entfernen Sie den gesamten Puffer von der Platte. Tupfen Sie den Teller zum Trocknen auf die Papiertücher und waschen Sie ihn jedes Mal dreimal mit 150 Mikrolitern Waschpuffer pro Brunnen. Trocknen Sie die Platte auf dem Papiertuch und aliquot inkubieren 30 Mikroliter Serumantigen aus jeder Vertiefung der über Nacht inkubierenden PCR-Platte in zwei Vertiefungen der 6-Plex-Platte.
Decken Sie die Platte mit Folie ab, legen Sie die Platte dann auf einen Plattenschüttler und schütteln Sie sie eine Stunde lang mit einer Geschwindigkeit von 450 U/min bei Raumtemperatur. Die vorhandene Lösung wird in die 6-Plex-Platte gekippt und die Platte dreimal mit 150 Mikrolitern 0,4 M Natriumchlorid-Waschpuffer pro Vertiefung gewaschen. Nachdem die dritte Wäsche abgeschlossen ist, trocknen Sie die Platte gegen das Papiertuch und geben Sie 150 Mikroliter Lesepuffer in jede Vertiefung.
Die Konzentrationen von sechs Autoantikörpern für GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA und COVID-19A aus dem 6-Plex ECL-Assay waren gut mit den entsprechenden sechs einzelnen ECL-Assays und dem aktuellen Standard-Radiobindungstest korreliert. Die Indexwerte für jede Probe für alle sechs Antikörper wurden gegen die entsprechenden Positiv- und Negativkontrollen berechnet. Es wurde ein Indexwert beobachtet, der größer als der Cutoff-Wert war, was auf ein positives Ergebnis hindeutete.
Autoantikörper im Serum durchbrachen das Ruthenium-markierte Antigen zum biotinylierten Antigen und bildeten einen Komplex mit einem spezifischen Linker, um eine Multiplexing-Plattform aufzubauen. Diese Taktik macht das groß angelegte Screening in der Allgemeinbevölkerung für Typ-Eins-Diabetes und Begleiterkrankungen praktikabler und effizienter, was zu einer frühzeitigen Vorhersage und Prävention der Krankheiten führt.
Übersicht
Diese Studie stellt einen neuartigen 6-Plex-Elektrochemilumineszenz-Assay vor, der für den simultanen Nachweis von Autoantikörpern im Zusammenhang mit Typ-1-Diabetes, Zöliakie und COVID-19 entwickelt wurde. Der Assay zielt darauf ab, die Effizienz der Großskalen-Screening-Verfahren für diese Autoimmunerkrankungen zu verbessern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Autoimmunität
- Klinische Diagnostik
- Elektrochemilumineszenz-Assays
Hintergrund
- Typ-1-Diabetes und Zöliakie sind Autoimmunerkrankungen, die eine frühzeitige Erkennung erfordern.
- COVID-19 hat neue Herausforderungen bei der Screening-Untersuchung von Autoimmunerkrankungen eingeführt.
- Aktuelle Screening-Methoden sind oft ineffizient und zeitaufwendig.
- Multiplex-Assays können die Screening-Fähigkeiten verbessern, indem sie mehrere Antikörper gleichzeitig testen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Hochdurchsatz-Assays zur gleichzeitigen Detektion mehrerer Autoantikörper.
- Validierung des Assays für den Einsatz in klinischen Studien.
- Unterstützung der frühen Krankheitsvorhersage und -prävention.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Antigenlösungen unter Verwendung biotinylierter und Ruthenium-markierter Proteine.
- Inkubation von Serumproben mit den hergestellten Antigenlösungen.
- Verwendung einer 96-Well-PCR-Platte für die Probenvorbereitung.
- Korrelierung der Ergebnisse mit Standardassays zur Validierung des Multiplex-Ansatzes.
Hauptergebnisse
- Der 6-Plex-ECL-Assay zeigte eine starke Korrelation mit herkömmlichen Einzelassays.
- Indexwerte wiesen auf positive Ergebnisse für Autoantikörper in Serumproben hin.
- Der Assay ermöglicht eine effiziente Untersuchung auf mehrere Autoimmunerkrankungen.
- Die Ergebnisse stützen die Durchführbarkeit einer großangelegten Bevölkerungsscreening.
Schlussfolgerungen
- Der 6-Plex-ECL-Assay ist ein aussichtsreiches Werkzeug für die Früherkennung von Autoimmunerkrankungen.
- Diese Methode verbessert die Effizienz von Screening-Verfahren.
- Sie birgt das Potenzial, die Patientenergebnisse durch eine frühzeitige Intervention zu verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Der validierte 6-Plex-ECL-Assay ermöglicht die Hochdurchsatz-Detektion von Autoantikörpern für Typ-1-Diabetes, Zöliakie und COVID-19 in multiplexierter Form und trägt so der Notwendigkeit effizienter, krankheitsspezifischer Populationsscreenings Rechnung. Diese Plattform erhöht die Vorhersagesicherheit bereits am frühesten Wendepunkt der Entdeckungs- bis Diagnosekette und unterstützt risikoadjustierte Portfolioentscheidungen in der Forschung zu Autoimmun- und Infektionskrankheiten. Die Einführung als primäres Screening-Tool zeigt die unternehmensweite Wirkung auf translationale und präklinische Arbeitsabläufe.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung mehrerer autoimmuner und viraler Zielstrukturen in einem einzigen Assay-Format.
- Verbessert die biologische Ent风险bewertung, indem krankheitsspezifische Autoantikörperprofile unterschieden werden.
- Unterstützt die Vorhersagesicherheit für Strategien zur frühen Krankheitsvorhersage und -prävention.
- Erleichtert die Portfolio-Priorisierung, indem multiplexe, quantitative Messwerte für die Zielstrukturvalidierung bereitgestellt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte multiplexe Systeme für nachgeschaltete Screening- und Biomarker-Arbeitsabläufe vor.
- Standardisiert Assay-Bedingungen, um die Reproduzierbarkeit und quantitative Vergleichbarkeit zwischen Proben sicherzustellen.
- Ermöglicht skalierbares Hochdurchsatz-Screening mit minimalem Serumvolumenbedarf.
- Ermöglicht die zuverlässige Bewertung der Wirkung von Substanzen oder Interventionen auf mehrere krankheitsrelevante Biomarker.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung auf krankheitsrelevante Biomarkerstrategien für eine translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur klinischen Validierung.
- Liefert quantitative Ergebnisse, die risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung in präklinischen Entwicklungsstufen unterstützen.
- Verbessert die prädiktive Entschärfung von Risiken, indem multiplexe Autoantikörperprofile mit Krankheitsbeginn und -progression korreliert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der 6-Plex-ECL-Assay integriert sich an der Schnittstelle zwischen früher Entdeckung, Identifizierung von Wirkstoffkandidaten und translationsmedizinischer Forschung und ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Hypothesenprüfung zur präklinischen Validierung.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die robuste Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch multiplexe Nachweise von Autoantikörpern.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse, die für Hochdurchsatz-Screening-Umgebungen geeignet sind.
- Analytik: Stellt Indexwerte und entscheidungsrelevante Schwellenwerte für den Vergleich über verschiedene Erkrankungszustände hinweg sowie für statistische Analysen bereit.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der klinischen Validierung, indem der Biomarkernachweis mit krankheitsrelevanten Endpunkten abgestimmt wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare, skalierbare Plattform für zukünftige multiplexe Screening-Initiativen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen in der frühen Forschung zu Autoimmun- und Infektionskrankheiten.
- Operationaler Wert: Optimiert Arbeitsabläufe durch Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit im Hochdurchsatzverfahren.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffizientes Portfolio-Management, indem multiplexe, handlungsrelevante Daten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Beitrag: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Kandidaten auf Grundlage robuster, multiplexer Biomarker-Beweise.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Entwicklung multiplexer Immunoassays und der elektrochemilumineszenten Detektion.
- Setzt Zugang zu spezialisierten Geräten für ECL-Messungen und die Handhabung von Hochdurchsatz-Mikroplatten voraus.
- Erfordert die Standardisierung von Assay-Protokollen und Datenanalyse-Pipelines über Teamgrenzen hinweg.
- Kann eine Anpassung notwendig machen, wenn verschiedene Probenarten oder Krankheitsmodelle im Zuge sich ändernder Portfolioanforderungen verwendet werden sollen.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört die Notwendigkeit einer sorgfältigen Validierung gegenüber etablierten Single-Plex- und Radio-Bindungsassays.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Create Linker‐Coupled Antigen Solution
2:36
Preparation of Antigen Labeled Serum and the 6‐Plex Plate
3:54
Serum/Antigen Incubates Transfer into the 6‐Plex Plate
4:42
Washing the 6‐Plex Plate and Reading Buffer Addition
5:11
Results: Comparison of Antibody Levels Study Between the Single and the 6‐Plex ECL Assay
5:59
Conclusion
