Durchflusszytometrische Analyse von Biomarkern zum Nachweis von Funktionsdefekten menschlicher Spermien

Diese Technik stellt einen praktischen Ansatz dar, um mehrere funktionelle Biomarker für menschliche Spermien mittels Durchflusszytometrie zu schätzen, ohne die Qualität der Experimente durch längere Wartezeiten wesentlich zu beeinträchtigen. Diese Technik kann ein praktisches und zuverlässiges Instrumentarium für die Diagnose von Unfruchtbarkeit und die Beurteilung der Spermienfunktion sowohl auf dem Tisch als auch im Bett sein und die routinemäßige Spermienuntersuchung ergänzen. Dieses Verfahren wird mit der Accuri C6-Plattform durchgeführt und kann mit geringfügigen Änderungen auch auf andere kommerzielle Plattformen angewendet werden.

Zu Beginn wird die Samenprobe bei 37 Grad Celsius inkubiert und eine Stunde lang vollständig verflüssigt. Um die Samenzellen zu zählen, mischen Sie die verflüssigte Samenprobe gründlich, geben Sie dann 10 Mikroliter Sperma in eine Spermienzählkammer und scannen Sie den Objektträger in einem Spermienklassenanalysator. Zählen Sie mindestens sechs Bereiche und 400 Spermien, um die Spermienkonzentration abzuschätzen.

Zum Nachweis der Spermienapoptose werden mit Hilfe der Annexin-5-FITC-PI-Färbung 10 bis zur sechsten Samenzelle in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gegeben. Waschen Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern kaltem PBS. Zentrifugieren Sie dann die Samenzellsuspension und verwerfen Sie den Überstand, bevor Sie die Zellen in 200 Mikroliter Bindungspuffer resuspendieren.

Als nächstes fügen Sie zwei Mikroliter FITC Annexin-5 und zwei Mikroliter PI hinzu. Die Zellen werden vorsichtig vorgewirbelt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert, bevor sie zur Analyse in das Durchflusszytometer gegeben werden. Für die Analyse des mitochondrialen Membranpotentials (MMP) mit der JC-1-Sonde zwei mal 10 bis zur sechsten Samenzelle in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen geben und zentrifugieren. Nach der Zentrifugation wird die Samenzellsuspension in einer Ein-Milliliter-JC-1-Arbeitslösung erneut suspendiert.

Die Zellen vorsichtig vortexen und 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln inkubieren. Zentrifugieren Sie die Suspension erneut, verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet zweimal mit einem Milliliter PBS. Dann werden die gefärbten Samenzellen in einem Milliliter PBS in einem Durchflusszytometerröhrchen neu suspendiert und das Röhrchen sofort zur Analyse in das Durchflusszytometer gelegt.

Als nächstes verwenden Sie Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazon oder CCCP als Positivkontrolle. Resuspendieren Sie die Samenzellen in einem Milliliter CCCP-Arbeitslösung und wirbeln Sie sie sanft vor, bevor Sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Suspension, verwerfen Sie den Überstand und führen Sie die Schritte zur Analyse von MMP mit der JC-1-Sonde durch, wie gezeigt.

Für den Spermien-Chromatin-Struktur-Assay (SCSA) wird die Samenprobe in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad aufgetaut und mit TNE-Puffer auf eine Konzentration von ein- bis zweimal 10 bis 10 bis sechsten Zellen pro Milliliter verdünnt. Als nächstes werden 200 Mikroliter der verdünnten Probe in ein Durchflusszytometer-Reagenzglas gegeben und mit 400 Mikrolitern Säurelösung vermischt. Die Probe wird mit 1,2 Milliliter Acridinorangenlösung gefärbt.

Verwenden Sie eine Referenzprobe als internen Standard für die Einrichtung und Kalibrierung von Durchflusszytometern. Verdünnen Sie die Probe mit vier Grad Celsius TNE-Puffer auf eine Konzentration von ein- bis zweimal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter und führen Sie die Schritte für SCSA durch, wie gezeigt. Öffnen Sie die Durchflusszytometer-Software und starten Sie das Zytometer.

Um Probendaten zu sammeln, laden Sie eine Kontrollprobe in das Durchflusszytometer und klicken Sie auf Ausführen, um die Datenerfassung zu starten. Erstellen Sie Punktdiagramme zum Anzeigen von Daten. Wählen Sie die Parameter der XY-Achse aus, und zeigen Sie linear an, um Daten anzugeben.

Wählen Sie dann ein polygonales Tor aus und wenden Sie es an, um die Spermienpopulation für die Analyse abzugrenzen. Für die Spermienapoptose stellen Sie FL1 als X-Achse und FL2 als Y-Achse ein. Um dann die lebenden apoptotischen oder nekrotischen Zellen zu isolieren, tippen und ziehen Sie das Quadrantentor, um die Spermienpopulationen auf vier spezifische Populationen zu unterteilen.

Legen Sie für MMP FL1 als X-Achse und FL2 als Y-Achse fest. Erstellen Sie dann ein polygonales Tor, um die Spermienpopulationen auf zwei bestimmte Populationen zu unterteilen. Legen Sie für SCSA FL4 als X-Achse und FL1 als Y-Achse fest.

Zeichnen Sie das Tor und stellen Sie einen Winkel von 45 Grad ein, um Signale von Zelltrümmern auszuschließen. Berechnen Sie 10.000 Samenzellen für jede Probe für Spermien-Apoptose-, MMP- und SCSA-Analysen, legen Sie ein Lauflimit fest, um anzugeben, wann die Datenerfassung beendet werden soll, die Fluidikrate, abhängig von der Zellzahl und dem Schwellenwert, um Ablagerungen und Rauschen zu eliminieren. Wenden Sie diese Einstellungen auf alle Beispiele an.

Stellen Sie bei Bedarf die Farbkompensation ein, um den Fluoreszenz-Spillover zu korrigieren. Pipettieren Sie die Probe vorsichtig zurück, bevor Sie sie in das Durchflusszytometer laden. Geben Sie dann den Namen des Beispiels ein, und klicken Sie auf Ausführen.

Sobald die Ausführung abgeschlossen ist, speichern Sie die Beispieldaten als FCS-Datei, indem Sie einen Dateinamen für die weitere Analyse angeben. Die Messung der Apoptose von Spermien mittels Annexin-5-FITC-PI-Färbung ist hier dargestellt. Diese Analyse umfasste eine Negativkontrolle der ungefärbten Samenzellen, um Kompensation und Quadranten festzulegen.

In einer Probe mit Spermienapoptose wurden die Ergebnisse als Prozentsatz lebensfähiger oder lebender früher apoptotischer oder apoptotischer, später apoptotischer und nekrotischer Zellen ausgedrückt. Die Spermiensubpopulation mit hohem und niedrigem MMP ist hier dargestellt. Eine Spermaprobe von guter Qualität zeigte eine hohe orangefarbene und eine niedrige grüne Fluoreszenz.

Umgekehrt zeigte eine Samenprobe von schlechter Qualität eine niedrige orangefarbene und hohe grüne Fluoreszenz. Die SCSA-Zytogramme eines fruchtbaren und unfruchtbaren Mannes sind hier dargestellt. Die Spermienzellpopulation wurde als normal mit hoher DNA-Stabilität, DNA-Fragmentierungsindex und Zelltrümmern identifiziert.

Die Samenprobe muss bei 37 Grad Celsius inkubiert und bis zu einer Stunde vollständig verflüssigt werden.