Name: Das Zusammenspiel zwischen natürlichen Killerzellen und Nozizeptorneuronen herauskitzeln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Erfahren Sie, wie Nozizeptorneuronen die Funktion natürlicher Killerzellen in einem Ko-Kultur-System modulieren. Diese Methode eröffnet Einblicke in neuro-immunologische Interaktionen bei Entzündungen und Tumorabwehr.

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Diese Arbeit wurde vom New Frontiers in Research Fund (NFRFE201901326), den Canadian Institutes of Health Research (162211, 461274, 461275), der Canadian Foundation for Innovation (37439), dem Canada Research Chair Program (950-231859), dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (RGPIN-2019-06824) und dem Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380) unterstützt.

Die Institutional Animal Care and Use Committees der Université de Montréal (#22053, #22054) genehmigten alle Tierverfahren. Siehe Tabelle 1 für eine Liste der Lösungen und ihrer Zusammensetzung und die Tabelle der Materialien für eine Liste der Materialien , Ausrüstungen und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. NK-Zellisolierung, -kultur und -stimulation
<ol><li>Erzeugen Sie Nozizeptorneuron intakt (Wurfgeschwisterkontrolle; TRPV1wt::D TAfl/wt) und ablatierte (TRPV1 cre::D TA fl/wt) Mäuse durch Kreuzung von Lox-Stop-Lox-Diphtherietoxin-Mäusen (DTA fl/fl) mit TRPV1cre/wt-Mäusen.</li>
	<li>Mit CO2 -Inhalation eine naive Wurfgeschwister-Kontrollmaus (TRPV1 wt::D TAfl/wt) einschläfern.</li>
	<li>Sammeln Sie die Milz in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das 500 μL sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthält.</li>
	<li>Homogenisieren Sie die Milz mit einem Stößel.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zellen mit 1 ml sterilem PBS.</li>
	<li>Filtern Sie die Mischung durch ein 50-μm-Zellsieb in ein 15-ml-konisches Röhrchen.</li>
	<li>Füllen Sie das Volumen (10 ml) mit sterilem PBS auf.</li>
	<li>Sammeln Sie 10 μL und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen (500 × g, 5 min) und entfernen Sie den Überstand.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 108 Zellen / ml in ergänztem RPMI 1640-Medium.</li>
	<li>Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um Milz-NK-Zellen mit einem Maus-NK-Zellisolierungskit magnetisch zu reinigen. Bestätigen Sie die Reinheit der NK-Zellen mittels Durchflusszytometrie11.</li>
	<li>Sammeln Sie 10 μL und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen (500 × g, 5 min) und entfernen Sie den Überstand.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die NK-Zellen in einem ergänzten RPMI 1640-Kulturmedium (enthält IL-2 und IL-15).</li>
	<li>Kultur 2 × 106 NK-Zellen/ml in einer 96-Well-U-Bodenplatte für 48 h.</li>
</ol>2. DRG-Neuronenisolation und -kultur
<ol><li>24 h vor dem Ende der NK-Zellstimulation (Schritt 1.15) eine 96-Well-Platte mit 100 μL/Well-Laminin (1 ng/ml) beschichten und 45 min (37 °C) inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Inkubation die Lösung und lassen Sie die Vertiefungen in einer Biosicherheitswerkbank an der Luft trocknen.</li>
	<li>Unter Verwendung von CO2 -Inhalation das Nozizeptorneuron intakt einschläfern (Wurfgeschwisterbekämpfung; TRPV1wt::D TAfl/wt) oder abgetragene (TRPV1cre::D TAfl/wt) Mäuse. HINWEIS: Die CO2 -Inhalation wird der zervikalen Dislokation vorgezogen, da sie eine Störung der mit der DRG verbundenen Spinalnerven vermeidet.</li>
	<li>Befestigen Sie die Maus in Bauchlage auf dem Brett, heben Sie die Haut an und schneiden Sie die Haut entlang der Rückensäule. Siehe Perner et al. für ein detailliertes Video12.</li>
	<li>Schneiden Sie das lumbosakrale Gelenk ab und trennen Sie das Kreuzbein mit einer Schere von der Lendenwirbelsäule.</li>
	<li>Trennen Sie die Wirbelsäule, indem Sie die Muskeln und Rippen auf beiden Seiten der Wirbelsäule in kranialer Richtung schneiden, bis die Schädelbasis erreicht ist.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer Schere die Wirbelsäule am Atlanto-Okzipitalgelenk ab.</li>
	<li>Entfernen Sie Muskel- und Fettgewebe aus der Wirbelsäule.</li>
	<li>Stecken und öffnen Sie die Wirbelsäule, um das Rückenmark zu entfernen und Zugang zum DRG zu erhalten. Suchen Sie nach dem DRG in der Foramina intervertebralis, die durch die Rückenwurzel mit dem Rückenmark verbunden ist, aber von den Hirnhäuten getrennt ist.</li>
	<li>Ernten Sie die DRGs in ein 15-ml-konisches Röhrchen, das mit 10 mL eiskalt ergänztem DMEM gefüllt ist.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zubereitung (200 × g, 5 min, Raumtemperatur) und entfernen Sie den Überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 250 μL PBS mit Kollagenase IV (1 mg/ml) und Dispase II (2,4 U/ml) hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie das DRG mit Collagenase IV/Dispase II (C/D) Lösung (80 min, 37 °C, leichtes Rühren). Wenn Sie Ganglien von mehreren Mäusen poolen, halten Sie ein Verhältnis von 125 μL C / D-Lösung pro Ganglion ein.</li>
	<li>Um die Enzyme zu inaktivieren, fügen Sie 5 ml ergänztes DMEM-Medium hinzu.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Lösung (200 × g, 5 min) und entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette.</li>
	<li>Um unerwünschten Zellverlust zu vermeiden, lassen Sie ~ 100 μL des Überstandes.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml des ergänzten DMEM-Mediums hinzu.</li>
	<li>Mit einer Pipettenpistole und drei Glaspasteurpipetten abnehmender Größe das DRG vorsichtig zu einem einzelligen Präparat trituieren (~ 10 nach oben / unten pro Pasteur-Pipettengröße).</li>
	<li>In einer Biosicherheitswerkbank Rinderserumalbumin (BSA) in sterilem PBS auf eine Endkonzentration von 15% verdünnen. 1 ml Aliquots bei −20 °C lagern.</li>
	<li>Erstellen Sie einen BSA-Gradienten in einem konischen 15-ml-Röhrchen, indem Sie 2 ml steriles PBS hinzufügen und langsam 1 ml 15% BSA-Lösung auf den Boden des Röhrchens dosieren. Vermeiden Sie eine Unterbrechung des Farbverlaufs, indem Sie die Pipette vorsichtig entfernen.</li>
	<li>Mit einer P200-Pipette pipetten Sie die geriebene Gangliensuspension (die die Neuronen enthält) langsam auf die Seite der Röhre in den Farbverlauf.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den neuronenhaltigen BSA-Gradienten (200 × g, 12 min, Raumtemperatur). Stellen Sie die Beschleunigung und Verzögerung der Zentrifuge auf die Mindestgeschwindigkeit ein. HINWEIS: Nach der Zentrifugation befinden sich die Neuronen am Boden der Röhre, während die Zelltrümmer im BSA-Gradienten eingeschlossen werden.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Überstand mit einer Pipette.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μL Neurobasal.</li>
	<li>Platte 104 Neuronen pro Vertiefung (200 μL neurobasal/Well) in einer Laminin-beschichteten, flachen 96-Well-Platte. HINWEIS: Im Durchschnitt wird ein Forscher in der Lage sein, ~ 8 Brunnen pro Maus zu füllen.</li>
	<li>Kultur der Neuronen (37 °C, über Nacht), um eine Anhaftung zu ermöglichen.</li>
</ol>3. Kokultur und Durchflusszytometrie
<ol><li>Entfernen Sie langsam das Neurobasal aus der Neuronenkultur.</li>
	<li>Nach 48-stündiger Stimulation mit IL-2 und IL-15 (siehe Schritte 1.14-1.15) werden die NK-Zellen resuspendiert und 105 NK-Zellen/Vertiefung in die Neuronenkultur gegeben (96-Well-Flachbodenplatte). HINWEIS: Im Durchschnitt wird der Ermittler in der Lage sein, ~ 6 Brunnen pro Maus zu füllen.</li>
	<li>Co-Kultur der Zellen in ergänztem neurobasalem MX (37 °C, 48 h).</li>
	<li>Die Zellen einsammeln, mit PBS waschen (3x) und zentrifugieren (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und färben Sie die Zellen mit Viability Dye eFlour-780 (1:1.000, 15 min, 4 °C).</li>
	<li>Die Zellen einsammeln, mit PBS waschen (3x) und zentrifugieren (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Blockieren Sie unspezifische Stellen auf den Zellen mit CD16/32 (1:100, 15 min, 4 °C).</li>
	<li>Die Zellen einsammeln, mit PBS waschen (3x) und zentrifugieren (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Färbung (15 min, 4 °C) der Zellen mit BV421 Anti-NK-1.1 (1:100), Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), Anti-NKp46 (1:100) und Phycoerythrin (PE) Anti-GM-CSF (1:100).</li>
	<li>Die Zellen einsammeln, mit PBS waschen (3x) und zentrifugieren (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen im FACS-Puffer (500 μL) und immunphänotypisieren Sie die NK-Zellen durch Durchflusszytometrie11. Siehe Abbildung 1A für die Gating-Strategie.</li>
</ol>

<ol><li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li>
<li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li>
<li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li>
<li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li>
<li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li>
<li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li>
<li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li>
<li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+or+adaptive+immunity%3F+The+example+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li>
<li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li>
<li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333(2021).</li>
<li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li>
<li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li>
<li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Davies et al.11 fanden heraus, dass verletzte Neuronen RAE1 hochregulieren. Über Zell-Zell-Kontakt konnten NKG2D-exprimierende NK-Zellen dann RAE1+ -Neuronen identifizieren und eliminieren, was wiederum chronische Schmerzen begrenzt11. Angesichts der Tatsache, dass NK-Zellen auch verschiedene Neuropeptidrezeptoren exprimieren und dass diese Neuropeptide für ihre immunmodulatorischen Fähigkeiten bekannt sind, erscheint es immer wichtiger, die Interaktion ...

Die Zellkörper sensorischer Neuronen stammen aus den dorsalen Wurzelganglien (DRG). Die DRG befinden sich im peripheren Nervensystem (PNS), zwischen dem Rückenhorn des Rückenmarks und den peripheren Nervenendigungen. Die pseudo-unipolare Natur von DRG-Neuronen ermöglicht die Übertragung von Informationen vom peripheren Ast, der das Zielgewebe innerviert, zum zentralen Ast, der die somatosensorische Information zum Rückenmark transportiert1. Unter Verwendung spezialisierter Ionenkanalrezeptoren spüren Neuronen erster Ordnung Bedrohungen durch Krankheitserreger, Allergene und Schadstoffe2, was zum Einstrom von Kationen (Na+, Ca2+) und zur Erzeugung eines Aktionspotentials 3,4,5 führt.
Diese Neuronen senden auch ein antidromisches Aktionspotential in Richtung Peripherie, wo die anfängliche Gefahrenwahrnehmung aufgetreten war, was zur lokalen Freisetzung von Neuropeptidenführt 1,4. Daher dienen die Nozizeptorneuronen als Schutzmechanismus, der den Wirt vor Umweltgefahren 4,5,6,7 warnt.
Um mit Neuronen zweiter Ordnung zu kommunizieren, setzen die Nozizeptoren verschiedene Neurotransmitter (z. B. Glutamat) und Neuropeptide (z. B. Calcitonin-Gen-verwandtes Peptid (CGRP), Substanz P (SP) und vasoaktives intestinales Peptid (VIP)) frei)6,7. Diese Peptide wirken auf Kapillaren und fördern Plasmaextravasation, Ödeme und den lokalen Einstrom und die Modulation von Immunzellen 2,4,7.
Das somatosensorische und das Immunsystem nutzen ein gemeinsames Kommunikationssystem, das aus Zytokinen und Neuropeptiden und ihren jeweiligen verwandten Rezeptoren besteht4. Während diese bidirektionale Kommunikation hilft, vor Gefahren zu schützen und die Homöostase zu erhalten, kann sie auch zur Krankheitspathophysiologie beitragen4.
NK-Zellen werden als angeborene lymphatische Zellen klassifiziert und sind darauf spezialisiert, viral infizierte Zellen zu eliminieren. Die NK-Zellfunktion wird durch ein Gleichgewicht von stimulierenden und inhibitorischen Rezeptoren gesteuert, einschließlich des aktivierenden Rezeptors NKG2D8. Der endogene Ligand von NKG2D, Retinsäure früh induzierbar1 (RAE1), wird von Zellen exprimiert, die Stress ausgesetzt sind, wie Tumorgenese und Infektion 8,9.
Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass periphere Nervenverletzungen sensorische Neuronen dazu bringen, maladaptive Moleküle wie Stathmin 2 (STMN2) und RAE1 zu exprimieren. So wurden über Zell-Zell-Kontakt NKG2D-exprimierende NK-Zellen durch Interaktion mit RAE1-exprimierenden Neuronen aktiviert. Im Gegenzug waren NK-Zellen in der Lage, verletzte Nozizeptorneuronen und stumpfe Schmerzüberempfindlichkeit zu eliminieren, die normalerweise mit Nervenverletzungen einhergeht10. Zusätzlich zur NKG2D-RAE1-Achse exprimieren NK-Zellen die verwandten Rezeptoren für verschiedene Nozizeptor-produzierte Mediatoren. Es ist daher möglich, dass diese Mediatoren die NK-Zellaktivität modulieren. Dieser Artikel stellt eine Kokulturmethode vor, um die Biologie der Neuron-NK-Zellinteraktion des Nozizeptors zu untersuchen. Dieser Ansatz wird dazu beitragen, das Verständnis dafür zu verbessern, wie Nozizeptorneuronen angeborene Immunzellreaktionen auf Verletzungen, Infektionen oder Malignität modulieren.

<table><tbody><tr><td>Anti-Maus CD16/32</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Kat.-Nr.: 017769</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Kat.-Nr.: 009669</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA) Kulturqualität</td><td>World Precision Instruments</td><td>Kat.-Nr.: 504167</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Anti-Maus NK-1.1</td><td>Fisher</td><td>Scientific Kat.-Nr.: 12430112</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (50 &mu; m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Kat.-Nr.: A3160702</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Fisher Scientific</td><td>Kat.-Nr.: 15140148</td><td></td></tr><tr><td>Diphteriatoxinfl/fl</td><td>Fisher Scientific</td><td>Kat.-Nr.: SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Fisher Scientific</td><td>Kat.-Nr.: 13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Kat.-Nr.: 07-200-95</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Maus NK Cell Isolation Kit</td><td>Sigma</td><td>Katze Nr.: CLS2595</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>Katze Nr.: C0130</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>Sigma</td><td>Katze Nr.: 04942078001</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>Katze Nr.: 806552</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti-Maus NKp46</td><td>Sigma</td><td>Katze Nr.: L2020</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit flachem Boden</td><td>Sigma</td><td>Kat.-Nr.: 03690</td><td></td></tr><tr><td>Glaspasteur-Pipette</td><td>Sigma</td><td>Kat.-Nr.: 470236-274</td><td></td></tr><tr><td>Neurotropher Faktor (GDNF) für GliazelllinienVWR</td><td></td> <td>Kat.-Nr.: 02-0131</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Cedarlane</td><td>Kat.-Nr.: 03-50/31</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>Kat.-Nr.: A14867-01</td><td></td></tr><tr><td>Maus rekombinant IL-15</td><td>Gibco</td><td>Kat.-Nr.: 22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Maus rekombinant IL-2</td><td>Gibco</td><td>Kat.-Nr.: 21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor (NGF)</td><td>Life Technologies</td><td>Kat.-Nr.: 13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>PeproTech</td><td>Kat.-Nr.: 450-51-10</td><td></td></tr><tr><td>PE Anti-Maus GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>Kat.-Nr.: 212-12</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin und Streptomycin</td><td>PeproTech</td><td>Kat.-Nr.: 210-15</td><td></td></tr><tr><td>Pestles</td><td>Stem Cell Technology</td><td>Kat.-Nr.: 19855</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Biolegend</td><td>Kat.-Nr.: 108732</td><td>Klon PK136</td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Biolegend</td><td>Kat.-Nr.: 137606</td><td>Klon 29A1.4</td></tr><tr><td>TRPV1Cre</td><td>Biolegend</td><td>Kat.-Nr.: 505406</td><td>Klon MP1-22E9</td></tr><tr><td>Pinzetten und Sezierwerkzeuge.</td><td>Biolegend</td><td>Kat.-Nr.: 65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit U-förmigem Boden</td><td>Biolegend</td><td>Kat.-Nr.: 101319</td><td></td></tr><tr><td>Viability Dye eFlour-780</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

das zusammenspiel zwischen natürlichen killerzellen und nozizeptorneuronen herauskitzeln

Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

Somatosensorische Neuronen haben sich entwickelt, um schädliche Reize zu erkennen und Abwehrreflexe zu aktivieren. Durch den Austausch von Kommunikationsmitteln stimmen Nozizeptorneuronen auch die Abwehrkräfte des Wirts ab, indem sie die Aktivität des Immunsystems steuern. Die Kommunikation zwischen diesen Systemen ist meist adaptiv und hilft, die Homöostase zu schützen, sie kann auch zum Ausbruch chronischer Krankheiten führen oder diese fördern. Beide Systeme haben sich gemeinsam entwickelt, um eine solche lokale Interaktion zu ermöglichen, wie sie in primären und sekundären lymphatischen Geweben und Schleimhäuten zu finden ist. Neuere Studien haben gezeigt, dass Nozizeptoren Fremdantigene, Immunzell-abgeleitete Zytokine und Mikroben direkt erkennen und darauf reagieren.
Die Aktivierung von Nozizeptoren führt nicht nur zu Schmerzüberempfindlichkeit und Juckreiz, sondern senkt auch die Nozizeptor-Feuerschwelle, was zur lokalen Freisetzung von Neuropeptiden führt. Die Peptide, die von den peripheren Terminals von Nozizeptoren produziert und freigesetzt werden, können die Chemotaxis und Polarisation von Lymphozyten blockieren und die Lokalisation, Dauer und Art der Entzündung kontrollieren. Jüngste Erkenntnisse zeigen, dass sensorische Neuronen mit angeborenen Immunzellen über Zell-Zell-Kontakt interagieren, zum Beispiel Gruppen-2D-Rezeptoren (NKG2D) auf natürlichen Killerzellen (NK).
Da NK-Zellen die verwandten Rezeptoren für verschiedene Nozizeptor-produzierte Mediatoren exprimieren, ist es denkbar, dass Nozizeptoren Neuropeptide verwenden, um die Aktivität von NK-Zellen zu steuern. Hier entwickeln wir eine Co-Kulturmethode, um Nozizeptor-Neuron-NK-Zell-Interaktionen in einer Schale zu untersuchen. Mit diesem Ansatz fanden wir heraus, dass lumbale Nozizeptorneuronen die NK-Zellzytokinexpression verringern. Insgesamt könnte eine solche reduktionistische Methode nützlich sein, um zu untersuchen, wie tumorinnervierende Neuronen die Antikrebsfunktion von NK-Zellen steuern und wie NK-Zellen die Eliminierung verletzter Neuronen steuern.

NK-Zellen wurden magnetisch aus Splenozyten der Wurfgeschwisterkontrolle (TRPV1 wt::D TAfl/wt) Mäuse gereinigt und mit IL-2 und IL-15 stimuliert (48 h). Die NK-Zellen wurden dann allein kultiviert oder mit DRG-Neuronen co-kultiviert, die aus intakten Nozizeptorneuronen gewonnen wurden (Wurfgeschwisterkontrolle; TRPV1wt::D TAfl/wt) oder abgetragene (TRPV1cre::D TAfl/wt) Mäuse. Die Zellen wurden dann dem TRPV1-Agonisten Capsaicin (1 μM) oder seinem Vehikel a...

Nozizeptorneuronen und NK-Zellen interagieren aktiv in einem entzündlichen Kontext. Ein Kokulturansatz ermöglicht es, dieses Zusammenspiel zu untersuchen.

Das Zusammenspiel zwischen natürlichen Killerzellen und Nozizeptorneuronen herauskitzeln

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

Angesichts der Tatsache, dass Nozizeptorneuronen verschiedene Neuropeptide sezernieren und dass NK-Zellen den Rezeptor für diese Neuropeptide exprimieren, haben wir uns entschieden, eine Kokulturmethode zu entwickeln, um das Zusammenspiel zwischen der NK-Zelle und den Nozizeptorneuronen zu untersuchen. Eine solche reduktionistische Methode könnte nützlich sein, um zu untersuchen, wie Nozizeptorneurone die Antitumorfunktion von NK-Zellen kontrollieren, und es könnte auch interessant sein zu untersuchen, wie NK-Zellen die Eliminierung verletzter Neuronen kontrollieren. Ali Ahmadi, ein ehemaliger Masterstudent aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren.Um mit der Isolierung und Kultur des natürlichen Killers oder der NK-Zellen zu beginnen, sammeln Sie die Milz der Maus in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern sterilem PBS und homogenisieren Sie dann die Milz mit einem Stößel. Als nächstes verdünnen Sie die Zellen mit einem Milliliter sterilem PBS und filtern die Mischung durch ein 50-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-konisches Röhrchen. Füllen Sie das gefilterte Homogenatvolumen mit sterilem PBS auf 10 Milliliter auf.Zählen Sie die Zellen in 10 Mikrolitern des verdünnten Homogenats mit einem Hämozytometer. Die restlichen Zellen werden fünf Minuten lang bei 500 G zentrifugiert und der Überstand entfernt. Anschließend werden die Zellen bei 10 bis acht Zellen pro Milliliter in ergänztem RPMI 1640-Medium resuspendiert.Reinigen Sie die Milz-NK-Zellen magnetisch mit einem Maus-NK-Zellisolierungskit und bestätigen Sie die NK-Zellreinheit mittels Durchflusszytometrie. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, gefolgt von einer Zentrifugation nach fünf Minuten bei 500 G, dann entfernen Sie den Überstand. Zur Stimulation der pelletierten NK-Zellen resuspendieren Sie diese Zellen in IL-2 und IL-15 ergänztem RPMI 1640 Kulturmedium.Kultur zweimal 10 bis zur sechsten NK-Zellen pro Milliliter in einer 96-Well-U-Bodenplatte für 48 Stunden. 24 Stunden vor der NK-Zellstimulation die 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern Laminin pro Welle beschichten und 45 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation die Lösung und lassen Sie die Vertiefungen in der Biosicherheitswerkbank an der Luft trocknen.Als nächstes befestigen Sie die eingeschläferte Maus auf dem Brett in Bauchlage. Heben Sie die Haut an und schneiden Sie die Haut entlang der dorsalen Säule. Schneiden Sie das lumbosakrale Gelenk ab und trennen Sie das Kreuzbein mit einer Schere von der Lendenwirbelsäule.Trennen Sie dann die Wirbelsäule, indem Sie die Muskeln und Rippen auf beiden Seiten in Schädelrichtung schneiden, bis die Schädelbasis erreicht ist. Verwenden Sie eine Schere, um die Wirbelsäule am Atlantookzipitalgelenk abzuschneiden. Als nächstes entfernen Sie den Muskel und das Fettgewebe von der Wirbelsäule.Pinnen und öffnen Sie die Wirbelsäule, um das Rückenmark zu entfernen, bevor Sie Zugang zum dorsalen Wurzelganglion oder DRG in der Zwischenwirbelforamina erhalten, die durch die Rückenwurzel mit dem Rückenmark verbunden ist. Als nächstes ernten Sie die DRGs in ein 15-Milliliter-konisches Röhrchen, das mit 10 Milliliter eiskalt ergänztem DMEM gefüllt ist. Dann zentrifugieren Sie das Präparat für fünf Minuten bei 200 G bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand.Fügen Sie 250 Mikroliter PBS hinzu, die ein Milligramm pro Milliliter Kollagenase IV und 2,4 Einheiten pro Milliliter Dispase II enthalten.Inkubieren Sie dieses DRG mit Kollagenase-Dispase-Lösung für 80 Minuten unter leichtem Rühren. Um die Enzyme zu inaktivieren, fügen Sie fünf Milliliter ergänztes DMEM-Medium hinzu und zentrifugieren Sie die Lösung bei 200 G.Nach fünf Minuten entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und lassen Sie etwa 100 Mikroliter des Überstands stehen, um unerwünschten Zellverlust zu vermeiden. Als nächstes fügen Sie den Zellen ein Milliliter angereichertes DMEM-Medium hinzu und verwenden Sie eine Pipettenpistole und drei Glaspasteurpipetten abnehmender Größe, um das DRG vorsichtig in eine Einzelzellpräparation zu trituieren.Während der Arbeit in einer Biosicherheitswerkbank Rinderserumalbumin oder BSA in sterilem PBS auf eine Endkonzentration von 15% verdünnen und einen Milliliter Aliquots bei minus 20 Grad Celsius lagern. Um einen BSA-Gradienten in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen zu erzeugen, fügen Sie zwei Milliliter steriles PBS hinzu und dosieren Sie dann langsam einen Milliliter 15% BSA-Lösung am Boden des Röhrchens. Vermeiden Sie eine Unterbrechung des Farbverlaufs, indem Sie die Pipette vorsichtig entfernen.Fügen Sie mit einer P200-Pipette die geritrierte Gangliensuspension mit den Neuronen seitlich des Röhrchens in den Farbverlauf ein. Stellen Sie dann die Beschleunigung und Verzögerung auf das Minimum ein, um das Neuron mit dem BSA-Gradienten für 12 Minuten bei 200 G zu zentrifugieren.Entfernen Sie nach der Zentrifugation den gesamten Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern Neurobasal. Platte 10.000 Neuronen pro Vertiefung in einer lamininbeschichteten flachen 96-Well-Platte.Um die Anheftung der Neuronen zu ermöglichen, inkubieren Sie die 96-Well-Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Um mit der Co-Kultivierung zu beginnen, entfernen Sie langsam das Neurobasal aus der Neuronenkultur. Nach 48 Stunden Stimulation mit IL-2 und IL-15 resuspendieren Sie die NK-Zellen und fügen 10 zu den fünften NK-Zellen pro Vertiefung zur Neuronenkultur hinzu.Co-Kultur der Zellen in ergänztem Neurobasal MX bei 37 Grad Celsius. Nach 48 Stunden die Zellen dreimal mit PBS sammeln und waschen und fünf Minuten bei 500 G bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand, bevor Sie die Zellen mit einem bis 1.000 verdünnten Lebensfähigkeitsfarbstoff eFluor 780 für 15 Minuten bei vier Grad Celsius färben.Waschen und zentrifugieren Sie die Zellen wie gezeigt, gefolgt von einer Behandlung mit CD 1632 für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, um unspezifische Stellen auf den Zellen zu blockieren, gefolgt von einem dreifachen Sammeln und Waschen der Zellen mit PBS. Nach dem nächsten Wasch- und Zentrifugationszyklus färben Sie die Zellen 15 Minuten lang mit BV421, Anti-NK-1.1, Fluorescein-Isothiocyanat-Anti-NKp46 und Phycoerythrin-Anti-GM-CSF an. Noch einmal, sammeln und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, zentrifugieren Sie sie und verwerfen Sie den Überstand, dann resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikroliter FACS-Puffer und Immunphänotyp die NK-Zellen mittels Durchflusszytometrie.Wenn sie allein kultiviert wurden, exprimierten NK-Zellen basale Konzentrationen von Granulozyten-Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor oder GM-CSF und NKp46. Bei Co-Kultivierung mit DRG-Neuronen, die von Nozizeptor-intakten Mäusen geerntet wurden, verringerte die Capsaicin-Stimulation die NK-Zellexpression von GM-CSF. Das Capsaicin hatte keinen Einfluss auf die NK-Zellaktivierungen, wenn es mit DRG-Neuronen aus nozizeptorabgetragenen Mäusen kokultiviert wurde.Der Spiegel von NKp46 wurde nicht beeinflusst. Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind die DRG-Dissoziation und -Isolierung. Die Idee ist, die maximale neuronale Lebensfähigkeit zu erhalten, indem man die Bildung von Blasen vermeidet und die richtige Pipette verwendet.Nach dem Protokoll kann der Prüfer RNA-Sequenzierung oder qPCR verwenden, um die Transkriptänderung in FACS-gereinigten Zellen zu messen, oder er kann ELISA verwenden, um die Sekretion von Zytokin oder Neuropeptiden zu messen. Ein solches Zusammenspiel zeigt, dass die NK-Zellfunktion wahrscheinlich durch das Nozizeptor-Neuron abgestimmt wird. Und dieses Übersprechen kann in biologischen Prozessen wichtig sein, die von Nervenverletzungen, bakteriellen und viralen Infektionen bis hin zu Malignomen reichen.

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