Demonstration der haarigen und kahlen Hautinnervation in einem 3D-Muster unter Verwendung mehrerer fluoreszierender Färbe- und Gewebereinigungsansätze
May 20th, 2022
Die Dicke der Gewebeschnitte schränkte die morphologische Untersuchung der Hautinnervation ein. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einzigartige Gewebereinigungstechnik zur Visualisierung von kutanen Nervenfasern in dicken 300 μm Gewebeschnitten unter konfokaler Mikroskopie.
Unser Protokoll bot eine praktikable Methode, um den Sync-Abschnitt mit einem konfokalen Mikroskop zu beobachten, was eine Präzision bei der Beobachtung der Nervenfasern gewährleisten konnte. Ein einfaches und leichtes Tissue-Reinigungsprotokoll ist ein Hauptvorteil dieser Technik. Der Tissue-Reinigungsprozess ist effizient und dauert etwa 30 Minuten bis zu einer Stunde.
Führen Sie eine Perfusion an der eingeschläferten Ratte durch, wie im Textmanuskript erwähnt. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Haut des Rückens und der Sohle von der Hinterpfote zu entfernen. Für Proben, die einen gefrorenen Abschnitt erfordern, fixieren Sie das Gewebe in 4% aus Aldehyd in 0,1 molaren PB für zwei Stunden.
Nach dem Waschen betten Sie die Hauttücher bei 37 Grad Celsius in 2% Agarose ein und legen Sie sie zur Kühlung in die Eisbox. Fixieren Sie das montierte Gewebe mit Eiswasser auf dem Vibrationsmikroton und schneiden Sie es mit einer Dicke von 500 Mikrometern in Querrichtung auf. Entfernen Sie nach dem Schneiden die Agarose aus den Abschnitten und lagern Sie sie in einer Sechs-Well-Platte mit 1x PBS.
Inkubieren Sie die Gewebeabschnitte in einer Lösung von 2% Triton X-100 in 1x PBS über Nacht bei vier Grad Celsius. Legen Sie die Gewebeabschnitte in den Sperrpuffer und drehen Sie sie mit 72 Umdrehungen pro Minute auf dem Shaker über Nacht bei vier Grad Celsius. Die Gewebeabschnitte werden in die Lösung mit den primären Antikörpern des monoklonalen Anti-CGRP-Antikörpers der Maus und des polyklonalen Anti-LYVE-1-Antikörpers der Schafe im Verdünnungspuffer im Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Dann zwei Tage bei vier Grad Celsius auf dem Shaker drehen. Waschen Sie die Gewebepartien zweimal mit Waschpuffer bei Raumtemperatur und halten Sie sie dann über Nacht bei vier Grad Celsius im Waschpuffer auf dem Shaker. Am nächsten Tag die Gewebeabschnitte in die Mischlösung mit den sekundären Antikörpern in einem Mikrozentrifugenröhrchen überführen und mit 72 Umdrehungen pro Minute auf dem Shaker fünf Stunden lang bei vier Grad Celsius rotieren.
Waschen Sie die Gewebeabschnitte in einer Platte mit sechs Vertiefungen mit Waschpuffer zweimal für eine Stunde bei Raumtemperatur. Halten Sie die Gewebeabschnitte im Waschpuffer auf dem Shaker über Nacht bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die Gewebeabschnitte in das Gewebereinigungsreagenz und drehen Sie sich mit 60 Umdrehungen pro Minute sanft für eine Stunde bei Raumtemperatur.
Montieren Sie das klare Gewebe auf dem Objektträger, umkreisen Sie dann das Gewebe mit einem Abstandshalter und kleben Sie den Spalt mit frischem Gewebereinigungsreagenz und Deckschlitten. Das 3D-Muster zeigte, dass die CGRP-positiven Nervenfasern durch das Unterhautgewebe und die Dermis zur Epidermis gelangten. Diese Nervenfasern verliefen in Bündeln im Unterhautgewebe, die innerhalb der Dermis verzweigt und in der Epidermis abgeschlossen waren.
Im Gegensatz dazu sind Phalloidin in positiven Blutgefäßen und LYVE-1-positive Lymphgefäße im Unterhautgewebe und in der Dermis verteilt. Im Allgemeinen verliefen die CGRP-positiven Nervenfasern parallel zu den Blutgefäßen und Lymphgefäßen und umgaben sie und bildeten ein 3D-Netzwerk in der behaarten und kahlen Haut. Beim konventionellen Ansatz waren zwar die Nervenfasern Blutgefäße und Lymphgefäße in den dünnen Abschnitten eindeutig mit CGRP-Phalloidin und LYVE-1 markiert, die Beobachtung dieser Strukturen war jedoch durch die Schichtdicke begrenzt und kann nicht vollständig beobachtet werden.
In dem Abschnitt mit einer Dicke von 30 Mikrometern gab es keinen Unterschied zwischen behaarter Haut und kahler Haut in der Oberfläche von CGRP-positiven Nervenfasern. In den 300 Mikrometern dicken Gewebeabschnitten wurde im Vergleich zu behaarter Haut die Oberfläche von CGRP-positiven Nervenfasern der kahlen Haut signifikant vergrößert. Es ist wichtig, den Reinigungspuffer mit hohem osmotischem Druck nach der Antikörperinkubation zu verwenden.
Mehrmals ist die Reinigungszeit notwendig, die für die Immunfluoreszenzfärbung benötigt wird. Nach diesem Verfahren glauben wir, dass es auch eine Möglichkeit der Färbung und Beobachtung anderer Gewebe und Organe in sechs Abschnitten gibt. Diese Technik könnte neurowissenschaftlichen Forschern helfen, auf die Oberfläche und den Zustand von Neurofasern zu stoßen.
Es hilft uns auch, die Innovation von Geweben und Organen zu beobachten.
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Überblick
Diese Studie präsentiert eine neuartige Gewebeklarierung-Technik zur Visualisierung von Hautnervenfasern in dicken 300 µm Gewebeschnitten mittels konfokaler Mikroskopie. Die Methode verbessert die morphologische Untersuchung der Hautinnervation und adressiert die Einschränkungen konventioneller Dünnschnitte.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Gewebebildgebung
- Konfokale Mikroskopie
Hintergrund
- Die Untersuchung der Hautinnervation ist entscheidend für das Verständnis sensorischer Bahnen.
- Herkömmliche Methoden sind durch die Dünne der Gewebeschnitte eingeschränkt.
- Die Visualisierung von Nervenfasern in dickeren Abschnitten kann tiefere Einblicke bieten.
- Die Methode zielt darauf ab, die Bildgebungspräzision und -effizienz zu verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung und Validierung einer Gewebeklarierung-Technik für dicke Hautabschnitte.
- Erleichterung der Beobachtung von Nervenfasern und ihrer Beziehung zu Blut- und Lymphgefäßen.
- Bereitstellung einer Methode, die für die Untersuchung anderer Gewebe und Organe angepasst werden kann.
Verwendete Methoden
- Konfokale Mikroskopie wurde verwendet, um Nervenfasern in geklärten Gewebeschnitten zu visualisieren.
- Das biologische Modell umfasste euthanisierte Ratten, speziell die Beobachtung von Haut vom Rücken und Hinterlauf.
- Wichtige Schritte schlossen Gewebeperfusion, Einbettung, Antikörperfärbung und Gewebeklarierung ein.
- Das gesamte Reinigungs- und Bildgebungsprotokoll dauert typischerweise 30 Minuten bis eine Stunde.
Hauptergebnisse
- Die Klarierungstechnik offenbarte erfolgreich CGRP-positive Nervenfasern, die ein 3D-Netzwerk innerhalb der Haut bilden.
- Die Ergebnisse zeigten signifikante Unterschiede in der Verteilung von Nervenfasern zwischen haariger und glatter Haut.
- Die Methode ermöglichte eine detaillierte Beobachtung der strukturellen Beziehungen zu Blut- und Lymphgefäßen.
- CGRP-positive Fasern wurden parallel zu oder um Blut- und Lymphgefäße herum verlaufend gefunden.
Schlussfolgerungen
- Diese Technik verbessert die Fähigkeit zur umfassenden Visualisierung und Untersuchung der Hautinnervation.
- Die verbesserte Visualisierung könnte wertvolle Einblicke in neurobiologische Mechanismen liefern.
- Potenzielle Anwendungen erstrecken sich auf verschiedene Gewebe und fördern die breitere neurowissenschaftliche Forschung.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Three-dimensional visualization of skin innervation using thick tissue sections and multiplex fluorescent staining addresses a critical gap in mapping peripheral nerve architecture. This approach enhances predictive confidence in early discovery by enabling comprehensive analysis of nerve, blood, and lymphatic vessel interactions in disease-relevant skin models. The method supports translational continuity for neurobiology and dermatology-focused R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detailed mapping of sensory nerve fiber distribution in both hairy and glabrous skin.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying spatial relationships between nerves and vasculature.
- Improves predictive confidence for target validation in peripheral nervous system research.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated 3D skin models for downstream phenotypic screening.
- Enhances assay reproducibility by standardizing tissue clearing and staining protocols.
- Provides quantitative outputs on nerve fiber surface area and network complexity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling both hairy and glabrous skin innervation.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of neurocutaneous targets.
- Supports risk-adjusted advancement by revealing structural biomarkers in skin tissue.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplexed imaging method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational model development.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing on nerve-vasculature interactions in skin.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative 3D readouts for assay development.
- Analytics: Provides surface area measurements and network mapping for comparative analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment in disease-relevant skin models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized protocol adaptable to other tissues and organ systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in nerve mapping.
- Operational Value: Streamlines tissue processing with efficient clearing and staining workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust 3D data for target evaluation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurocutaneous and dermatological programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and multiplex immunofluorescence.
- Demands access to tissue clearing reagents and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of staining and clearing protocols.
- Adaptable to various tissue types with protocol optimization.
- Dependent on antibody quality and clearing efficiency for optimal results.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:43
Perfusion, Triple Fluorescent Staining, and Tissue Clearing Treatment
3:10
Results: Enhanced Understanding of the Skin Innervation via Immunofluorescence and a 3D View of the Cutaneous Nerve Fibers in the Hairy and Glabrous Skin
4:31
Conclusion
