Name: Demonstration der haarigen und kahlen Hautinnervation in einem 3D-Muster unter Verwendung mehrerer fluoreszierender Färbe- und Gewebereinigungsansätze (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: Erfahren Sie eine Gewebe-Clearing-Technik zur Visualisierung von CGRP-positiven Nervenfasern in dicken Hautschnitten mittels Konfokalmikroskopie. Diese Methode ermöglicht präzise 3D-Aufnahmen der Hautinnervation.

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Diese Studie wurde vom China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Projektcode Nr. CI2021A03404) und der National Traditional Chinese Medicine Interdisciplinary Innovation Fund (Projektcode-Nr. ZYYCXTD-D-202202).

Die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Akupunktur und Moxibustion der China Academy of Chinese Medical Sciences genehmigt (Referenznummer D2018-04-13-1). Alle Verfahren wurden nach dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996) durchgeführt. Drei erwachsene männliche Ratten (Sprague-Dawley, Gewicht 230 ± 15 g) wurden in dieser Studie verwendet. Alle Tiere wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit untergebracht und erlaubten freien Zugang zu Nahrung und Wasser.
1. Perfusion und Probenvorbereitung
<ol><li>Injizieren Sie 250 mg/kg Tribromethanollösung (siehe Materialtabelle) intraperitoneal in die Ratte, um Euthanasie zu induzieren.</li>
	<li>Sobald die Atmung aufhört, verwenden Sie eine chirurgische Schere aus Edelstahl, um die Brusthöhle der Ratte zu öffnen. Verwenden Sie 20-G-Nadeln, um über den linken Herzventrikel 13 mit einer Rate von 3 ml / min mit 100 ml 0,9% normaler Kochsalzlösung zu perfundieren, gefolgt von 250-300 ml 4% Paraformaldehyd in 0,1 m Phosphatpuffer (PB, pH 7,4) (Abbildung 1A, B).</li>
	<li>Verwenden Sie nach der Perfusion ein Skalpell, um die Haut des Rückens und der Sohle von der Hinterpfote zu entfernen.<ol>
<li>Für die Proben, die einen gefrorenen Abschnitt benötigen, fixieren Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PB für 2 h; dann kryoschützen Sie das Gewebe in 25% Saccharose in 0,1 M PB für mehr als 24 h bei 4 °C</li>
		<li>Für die Proben mit dem dicken Abschnitt, der eine Gewebereinigung erfordert, fixieren Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) für 2 h; dann kryoschützen Sie das Gewebe in 1x PBS bei 4 °C (Abbildung 1C–E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Dreifach fluoreszierende Färbung mit CGRP, Phalloidin und LYVE1, gefolgt von einer Gewebereinigungsbehandlung
HINWEIS: Die dreifach fluoreszierende Färbung mit CGRP, Phalloidin und LYVE1 wurde angewendet, um die Nervenfasern, Blutgefäße und Lymphgefäße in behaarter und kahler Haut auf Gewebeabschnitten mit einer Dicke von 300 μm nach der Gewebereinigungsbehandlung freizulegen.
<ol><li>Bereiten Sie 2% Agarose in 1x PBS zu, indem Sie es in einem Mikroofen für 2 Minuten erhitzen, bis sich die Agarose auflöst (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Nach dem Waschen betten Sie die Hauttücher bei 37 °C in 2% Agarose ein und legen sie zum Abkühlen in den Eiskasten (Abbildung 1F,G).</li>
	<li>Befestigen Sie das montierte Gewebe auf dem Vibrationsmikrotom mit dem Eiswasser und schneiden Sie es in einer Dicke von 500 μm in Querrichtung. Verwenden Sie die folgenden Parameter, um den Vibrationsschnitt einzustellen und das Schneiden abzuschließen: Geschwindigkeit 0,50 mm/s und Amplitude 1,5 mm (Abbildung 1H-K).</li>
	<li>Entfernen Sie nach dem Schneiden die Agarose aus den Abschnitten und lagern Sie sie in einer Platte mit sechs Vertiefungen mit 1x PBS (pH 7,4) (Abbildung 1L).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Gewebeabschnitte in einer Lösung von 2% Triton X-100 in 1x PBS (TriX-PB) über Nacht bei 4 °C. Siehe Abbildung 2 für das folgende Verfahren.</li>
	<li>Legen Sie die Gewebeabschnitte in den Sperrpuffer und drehen Sie sie mit 72 U / min auf dem Shaker über Nacht bei 4 ° C. HINWEIS: Die Blockierpufferzusammensetzung besteht zu 10% aus normalem Eselserum, 1% Triton-X 100 und 0,2% Natriumazid in 1x PBS (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Die Gewebeabschnitte werden in die Lösung mit den primären Antikörpern des monoklonalen Anti-CGRP-Antikörpers (1:500) der Maus und des polyklonalen Anti-LYVE1-Antikörpers (1:500) im Verdünnungspuffer im Mikrozentrifugenröhrchen (siehe Materialtabelle) überführt und 2 Tage lang bei 4 °C auf dem Shaker gedreht. HINWEIS: Die Zusammensetzung des Verdünnungspuffers beträgt 1% normales Eselserum, 0,2% Triton-X 100 und 0,2% Natriumazid in 1x PBS.</li>
	<li>Waschen Sie die Gewebepartien zweimal mit Waschpuffer bei Raumtemperatur und halten Sie sie dann über Nacht bei 4 °C im Waschpuffer auf dem Shaker. HINWEIS: Die Zusammensetzung des Waschpuffers beträgt 0,2% Triton-X 100 in 0,1 M PB (pH 7,4).</li>
	<li>Am nächsten Tag die Gewebeabschnitte in die Mischlösung mit den sekundären Antikörpern von Esel-Anti-Maus-IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) und Esels-Antischaf-IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500) sowie Alexa-Flour594 Phalloidin (1:1000) (siehe Materialtabelle) in einem Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei 72 U/min auf dem Shaker 5 h bei 4 °C drehen.</li>
	<li>Waschen Sie die Gewebeabschnitte in einer Sechs-Well-Platte mit Waschpuffer für 1 h, zweimal, bei Raumtemperatur. Halten Sie die Gewebeabschnitte im Waschpuffer auf dem Shaker über Nacht bei 4 °C.</li>
	<li>Übertragen Sie die Gewebeabschnitte in das Gewebereinigungsreagenz (siehe Materialtabelle, ihr Volumen war fünfmal höher als das Probenvolumen) und drehen Sie sie mit 60 U / min auf dem Shaker sanft für 1 h bei Raumtemperatur. HINWEIS: Nach dieser Behandlung werden die Gewebeabschnitte deutlich (Abbildung 2B).</li>
	<li>Montieren Sie das gereinigte Gewebe auf dem Objektträger, umkreisen Sie das Gewebe mit einem Abstandshalter und kleben Sie den Spalt mit frischem Gewebereinigungsreagenz und Deckglas.</li>
</ol>3. Dreifachfluoreszierende Färbung mit CGRP, Phalloidin und LYVE1 nach dem konventionellen Ansatz
HINWEIS: Zum Vergleich: Die gleiche Färbung wurde an Gewebeschnitten mit einer Dicke von 30 μm nach herkömmlichen Techniken durchgeführt.
<ol><li>Schneiden Sie die Gewebeschnitte bei 30 μm auf einem Mikrotom in Querrichtung und montieren Sie sie auf dem Objektträger.</li>
	<li>Fügen Sie eine Blocklösung mit 3% normalem Eselserum und 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PB hinzu und inkubieren Sie die Abschnitte für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie die blockierende Lösung und inkubieren Sie die Abschnitte mit der Lösung, die die primären Antikörper des monoklonalen Anti-CGRP-Antikörpers der Maus (1:500) und des polyklonalen Anti-LYVE1-Antikörpers (1:500) enthält, in Verdünnungspuffer über Nacht bei 4 °C.</li>
	<li>Am nächsten Tag die Gewebeschnitte dreimal mit 0,1 M PB (pH 7,4) waschen, die Mischlösung mit den sekundären Antikörpern von Esel Anti-Maus IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) und Esel Anti-Schaf IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500) sowie Alexa-Flour594 Phalloidin (1:1000) auf die Abschnitte geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Vor der mikroskopischen Beobachtung die Abschnitte dreimal in 0,1 M PB (pH 7,4) waschen und dann mit Deckgläsern aus 50% Glycerin abdecken.</li>
</ol>4. Bildgebung und Analysen
<ol><li>Beobachten Sie die gefärbten Proben unter einem fluoreszierenden Mikroskop und nehmen Sie dann die Bilder mit einem konfokalen Mikroskop auf.</li>
	<li>Erfassen Sie 30 Bilder (Z-Stacks) in jeweils 10-μm-Frames aus jedem 300 μm dicken Schnitt und integrieren Sie ein einzelnes In-Fokus-Bild mit einem Bildprozessor des konfokalen Mikroskopiesystems (siehe Materialtabelle).<ol>
<li>Führen Sie die folgenden Schritte in der Bildverarbeitungssoftware des konfokalen Aufbaus für die dreidimensionale (3D) Analyse durch: Legen Sie die | der Startfokalebene fest Endfokalebene | einstellen Festlegen der Schrittgröße | Tiefenmuster | auswählen | zur Bilderfassung Z-Serie. HINWEIS: Die Anregungs- und Emissionswellenlängen der blauen Fluoreszenzsignale betrugen 401 nm bzw. 421 nm. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen grüner Fluoreszenzsignale betrugen 499 nm bzw. 519 nm. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen roter Fluoreszenzsignale betrugen 591 nm bzw. 618 nm. 152 μm ist der Durchmesser des konfokalen Lochs (10x Objektivlinse, NA: 0,4). Die Bildaufnahmeauflösung betrug 1024 × 1024 Pixel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für die herkömmlichen Proben (Schritt 3) werden 30 Bilder (Z-Stacks) in 1 μm Frames aus jedem 30 μm dicken Abschnitt aufgenommen und diese Bilder wie oben erwähnt weiter behandelt (Schritte 4.1-4.2).</li>
	<li>Demonstrieren Sie die Bilder im Muster der 3D-Rekonstruktion mit dem Bildverarbeitungssystem.</li>
	<li>Führen Sie 3D-Rekonstruktionen durch, indem Sie konfokale Z-Stack-Bilder in Imaris 9.0 importieren (Zellbildgebungssoftware, siehe Materialtabelle) und Oberflächenrenderings basierend auf Fleckenintensitäten erstellen: Neue Oberflächen | hinzufügen Quellkanal | auswählen Bestimmen Sie die Parameter in der Option "Glatt" der | "Oberflächendetails" Bestimmen Sie die Parameter in der Schwellenwertoption der absoluten Intensität | Oberflächen | klassifizieren Fertigstellen.</li>
	<li>Erfassen Sie Daten im Bereich positiver Nervenfasern mit der Zellbildgebungssoftware. Wählen Sie das gerenderte Bild | aus Statistiken | Detaillierte | Spezifische Werte | Volumen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die vorliegende Studie liefert eine detaillierte Demonstration der kutanen Nervenfasern in der behaarten und kahlen Haut durch die Verwendung von Immunfluoreszenz auf dickeren Gewebeabschnitten mit Clearing-Behandlung und einer 3D-Ansicht, um die Hautinnervation besser zu verstehen. Die Antikörper-Inkubationszeit von bis zu 1-2 Tagen und ein Reinigungsprozess über Nacht sind wichtig. Diese beiden Schlüsselschritte wirken sich direkt auf die Immunfluoreszenzfärbungswirkung von dicken Abschnitten aus. Ein weiteres Problem ...

Die Haut, das größte Organ im Körper, das als Schlüsselschnittstelle zur Umwelt dient, wird von vielen Nervenfasern dicht innerviert 1,2,3. Obwohl die Hautinnervation zuvor mit verschiedenen histologischen Methoden, wie der Färbung auf ganzer Haut und Gewebeabschnitten 4,5,6, umfassend untersucht wurde, ist der detaillierte effektive Nachweis von Hautnervenfasern immer noch eine Herausforderung 7,8. Vor diesem Hintergrund entwickelte das vorliegende Protokoll eine einzigartige Technik, um kutane Nervenfasern im dicken Gewebeabschnitt deutlicher darzustellen.
Aufgrund der Grenze durch die Dicke der Abschnitte ist die Beobachtung von innervierten Hautnervenfasern nicht präzise genug, um die Beziehung zwischen Calcitonin-Gen-related Peptide (CGRP) Nervenfasern und lokalen Geweben und Organen aus den aufgenommenen Bildinformationen genau darzustellen. Das Aufkommen der 3D-Gewebereinigungstechnologie bietet eine praktikable Methode, um dieses Problem zu lösen 9,10. Die schnelle Entwicklung von Gewebe-Clearing-Ansätzen hat in jüngster Zeit viele Werkzeuge zur Untersuchung von Gewebestrukturen, ganzen Organen, neuronalen Projektionen und ganzen Tieren angeboten11. Das transparente Hautgewebe könnte in einem viel dickeren Abschnitt durch konfokale Mikroskopie abgebildet werden, um die Daten zur Visualisierung von kutanen Nervenfasern zu erhalten.
In der aktuellen Studie wurde die Plantar- und Rückenhaut eines Rattenhinterfußes als die beiden Zielstellen von behaarter und kahler Hautausgewählt 3,4,7. Um die Hautnervenfasern in größerer Entfernung zu verfolgen, wurde das Hautgewebe in einer Dicke von 300 μm für die immunhistochemische und histochemische Färbung geschnitten, gefolgt von einer Gewebereinigungsbehandlung. CGRP wurde verwendet, um die sensorischen Nervenfasern12,13 zu kennzeichnen. Um die kutanen Nervenfasern auf dem Gewebehintergrund hervorzuheben, wurden außerdem Phalloidin und der endotheliale Hyaluronrezeptor 1 (LYVE1) verwendet, um die Blutgefäße bzw. Lymphgefäße14,15 zu markieren.
Diese Ansätze lieferten eine einfache Methode, die angewendet werden kann, um eine hochauflösende Ansicht der kutanen Nervenfasern zu demonstrieren und auch die räumliche Korrelation zwischen den Nervenfasern, Blutgefäßen und Lymphgefäßen in der Haut zu visualisieren, was viel mehr Informationen liefern kann, um die Homöostase der normalen Haut und die Hautveränderung unter den pathologischen Bedingungen zu verstehen.

<table><tbody><tr><td>1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>P1020</td><td>pH 7,2-7,4, 0,01 mol</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromethanol</td><td>Sigma Life Science</td><td>T48402-5G</td><td></td></tr><tr><td>Konfokale Fluoreszenzmikroskopie</td><td>Olympus Corporation</td><td>Fluoview FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus IgG H& L Alexa-Flour488</td><td>Abcam plc.</td><td>ab150105</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Schafe IgG H& L Alexa-Flour405</td><td>Abcam plc.</td><td>ab175676</td><td></td></tr><tr><td>EP-Röhre</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td><td>615001</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Gefriertisch-Gleitmikrotomsystem</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Oxford Instruments</td><td>v.9.0.1</td><td></td></tr><tr><td>IRIS Standardschere</td><td>WPI (World Precision Instruments Inc.)</td><td></td><td></td>503242</tr><tr><td>iSpacer</td><td>SunJin Lab co.</td><td>IS005</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozange-Str</td><td>RWD</td><td>F11020-11</td><td></td></tr><tr><td>Maus monoklonaler Anti-CGRP-Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-57053</td><td></td></tr><tr><td>Neutral gepuffertes Formalin</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>G2161</td><td>10%</td></tr> <tr><td>Normales Eselsserum</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>017-000-12</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Peristaltische Pumpe</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td><td>BT300-2J</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.52 Lösung</td><td>SunJin Lab co.</td><td>RC152001</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Regular Agarose</td><td>Gene Company Limited</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>SEMKEN 1 x 2 Zähne Gewebezange-Str</td><td>RWD</td><td>F13038-12</td><td></td></tr><tr><td>Schaf polyklonaler Anti-LYVE1 Antikörper</td><td>R& D Systems, Inc.</td><td>AF7939</td><td></td></tr><tr><td>Six-Well-Platte</td><td>Corning Incorporated</td><td>3335</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma Life Science</td><td>S2002</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Life Science</td><td>V900116</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td><td>Henkel AG & Co. KG</td><td>Pattex 502</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Griffe</td><td>RWD</td><td>S32003-12</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>9002-93-1</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Urethan</td><td>Sigma Life Science</td><td>U2500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>VANNAS Federschere</td><td>RWD</td><td>S1014-12</td><td></td></tr><tr><td>Vibrationsmikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

demonstration der haarigen und kahlen hautinnervation in einem 3d-muster unter verwendung mehrerer fluoreszierender färbe- und gewebereinigungsansätze

Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

Hautinnervation ist ein wichtiger Teil des peripheren Nervensystems. Obwohl das Studium der kutanen Nervenfasern schnell vorangekommen ist, stammt der größte Teil des Verständnisses ihrer verteilungsbedingten und chemischen Eigenschaften aus der konventionellen histochemischen und immunhistochemischen Färbung auf dünnen Gewebeschnitten. Mit der Entwicklung der Gewebereinigungstechnik ist es möglich geworden, die Hautnervenfasern auf dickeren Gewebeschnitten zu betrachten. Das vorliegende Protokoll beschreibt die mehrfache fluoreszierende Färbung auf Gewebeschnitten mit einer Dicke von 300 μm aus der Plantar- und Rückenhaut von Rattenhinterfuß, den beiden typischen behaarten und kahlen Hautstellen. Hier markiert das Calcitonin-Gen-verwandte Peptid die sensorischen Nervenfasern, während Phalloidin und der endotheliale Hyaluronrezeptor 1 des Lymphgefäßes die Blut- bzw. Lymphgefäße markieren. Unter einem konfokalen Mikroskop wurden die markierten sensorischen Nervenfasern vollständig auf längere Distanz verfolgt, in Bündeln in der tiefen Hautschicht und Freestyle in der oberflächlichen Schicht. Diese Nervenfasern verliefen parallel zu den Blutgefäßen oder umgaben sie, und Lymphgefäße bildeten ein dreidimensionales (3D) Netzwerk in der behaarten und kahlen Haut. Das aktuelle Protokoll bietet einen effektiveren Ansatz zur Untersuchung der Hautinnervation als die bestehenden konventionellen Methoden aus methodischer Sicht.

Nach der dreifach fluoreszierenden Färbung wurden die Nervenfasern, Blutgefäße und Lymphgefäße in der behaarten und kahlen Haut deutlich mit CGRP, Phalloidin bzw. LYVE1 markiert (Abbildung 3,4). Mit der Clearing-Behandlung können die CGRP-positiven Nervenfasern, Phalloidin-positiven Blutgefäße und LYVE1-positiven Lymphgefäße in größerer Tiefe abgebildet werden, um die vollständige Strukturinformation der Haut zu erfassen (Abbildung 3). Als diese...

Die Dicke der Gewebeschnitte schränkte die morphologische Untersuchung der Hautinnervation ein. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einzigartige Gewebereinigungstechnik zur Visualisierung von kutanen Nervenfasern in dicken 300 μm Gewebeschnitten unter konfokaler Mikroskopie.

Demonstration der haarigen und kahlen Hautinnervation in einem 3D-Muster unter Verwendung mehrerer fluoreszierender Färbe- und Gewebereinigungsansätze

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

Unser Protokoll bot eine praktikable Methode, um den Sync-Abschnitt mit einem konfokalen Mikroskop zu beobachten, was eine Präzision bei der Beobachtung der Nervenfasern gewährleisten konnte. Ein einfaches und leichtes Tissue-Reinigungsprotokoll ist ein Hauptvorteil dieser Technik. Der Tissue-Reinigungsprozess ist effizient und dauert etwa 30 Minuten bis zu einer Stunde.Führen Sie eine Perfusion an der eingeschläferten Ratte durch, wie im Textmanuskript erwähnt. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Haut des Rückens und der Sohle von der Hinterpfote zu entfernen. Für Proben, die einen gefrorenen Abschnitt erfordern, fixieren Sie das Gewebe in 4% aus Aldehyd in 0,1 molaren PB für zwei Stunden.Nach dem Waschen betten Sie die Hauttücher bei 37 Grad Celsius in 2% Agarose ein und legen Sie sie zur Kühlung in die Eisbox. Fixieren Sie das montierte Gewebe mit Eiswasser auf dem Vibrationsmikroton und schneiden Sie es mit einer Dicke von 500 Mikrometern in Querrichtung auf. Entfernen Sie nach dem Schneiden die Agarose aus den Abschnitten und lagern Sie sie in einer Sechs-Well-Platte mit 1x PBS.Inkubieren Sie die Gewebeabschnitte in einer Lösung von 2% Triton X-100 in 1x PBS über Nacht bei vier Grad Celsius. Legen Sie die Gewebeabschnitte in den Sperrpuffer und drehen Sie sie mit 72 Umdrehungen pro Minute auf dem Shaker über Nacht bei vier Grad Celsius. Die Gewebeabschnitte werden in die Lösung mit den primären Antikörpern des monoklonalen Anti-CGRP-Antikörpers der Maus und des polyklonalen Anti-LYVE-1-Antikörpers der Schafe im Verdünnungspuffer im Mikrozentrifugenröhrchen überführt.Dann zwei Tage bei vier Grad Celsius auf dem Shaker drehen. Waschen Sie die Gewebepartien zweimal mit Waschpuffer bei Raumtemperatur und halten Sie sie dann über Nacht bei vier Grad Celsius im Waschpuffer auf dem Shaker. Am nächsten Tag die Gewebeabschnitte in die Mischlösung mit den sekundären Antikörpern in einem Mikrozentrifugenröhrchen überführen und mit 72 Umdrehungen pro Minute auf dem Shaker fünf Stunden lang bei vier Grad Celsius rotieren.Waschen Sie die Gewebeabschnitte in einer Platte mit sechs Vertiefungen mit Waschpuffer zweimal für eine Stunde bei Raumtemperatur. Halten Sie die Gewebeabschnitte im Waschpuffer auf dem Shaker über Nacht bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die Gewebeabschnitte in das Gewebereinigungsreagenz und drehen Sie sich mit 60 Umdrehungen pro Minute sanft für eine Stunde bei Raumtemperatur.Montieren Sie das klare Gewebe auf dem Objektträger, umkreisen Sie dann das Gewebe mit einem Abstandshalter und kleben Sie den Spalt mit frischem Gewebereinigungsreagenz und Deckschlitten. Das 3D-Muster zeigte, dass die CGRP-positiven Nervenfasern durch das Unterhautgewebe und die Dermis zur Epidermis gelangten. Diese Nervenfasern verliefen in Bündeln im Unterhautgewebe, die innerhalb der Dermis verzweigt und in der Epidermis abgeschlossen waren.Im Gegensatz dazu sind Phalloidin in positiven Blutgefäßen und LYVE-1-positive Lymphgefäße im Unterhautgewebe und in der Dermis verteilt. Im Allgemeinen verliefen die CGRP-positiven Nervenfasern parallel zu den Blutgefäßen und Lymphgefäßen und umgaben sie und bildeten ein 3D-Netzwerk in der behaarten und kahlen Haut. Beim konventionellen Ansatz waren zwar die Nervenfasern Blutgefäße und Lymphgefäße in den dünnen Abschnitten eindeutig mit CGRP-Phalloidin und LYVE-1 markiert, die Beobachtung dieser Strukturen war jedoch durch die Schichtdicke begrenzt und kann nicht vollständig beobachtet werden.In dem Abschnitt mit einer Dicke von 30 Mikrometern gab es keinen Unterschied zwischen behaarter Haut und kahler Haut in der Oberfläche von CGRP-positiven Nervenfasern. In den 300 Mikrometern dicken Gewebeabschnitten wurde im Vergleich zu behaarter Haut die Oberfläche von CGRP-positiven Nervenfasern der kahlen Haut signifikant vergrößert. Es ist wichtig, den Reinigungspuffer mit hohem osmotischem Druck nach der Antikörperinkubation zu verwenden.Mehrmals ist die Reinigungszeit notwendig, die für die Immunfluoreszenzfärbung benötigt wird. Nach diesem Verfahren glauben wir, dass es auch eine Möglichkeit der Färbung und Beobachtung anderer Gewebe und Organe in sechs Abschnitten gibt. Diese Technik könnte neurowissenschaftlichen Forschern helfen, auf die Oberfläche und den Zustand von Neurofasern zu stoßen.Es hilft uns auch, die Innovation von Geweben und Organen zu beobachten.

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Demonstration der haarigen und kahlen Hautinnervation in einem 3D-Muster unter Verwendung mehrerer fluoreszierender Färbe- und Gewebereinigungsansätze (Video) | JoVE Journal

Demonstration der haarigen und kahlen Hautinnervation in einem 3D-Muster unter Verwendung mehrerer fluoreszierender Färbe- und Gewebereinigungsansätze

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