Demonstration der haarigen und kahlen Hautinnervation in einem 3D-Muster unter Verwendung mehrerer fluoreszierender Färbe- und Gewebereinigungsansätze
20. Mai 2022
Die Dicke der Gewebeschnitte schränkte die morphologische Untersuchung der Hautinnervation ein. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einzigartige Gewebereinigungstechnik zur Visualisierung von kutanen Nervenfasern in dicken 300 μm Gewebeschnitten unter konfokaler Mikroskopie.
Unser Protokoll bot eine praktikable Methode, um den Sync-Abschnitt mit einem konfokalen Mikroskop zu beobachten, was eine Präzision bei der Beobachtung der Nervenfasern gewährleisten konnte. Ein einfaches und leichtes Tissue-Reinigungsprotokoll ist ein Hauptvorteil dieser Technik. Der Tissue-Reinigungsprozess ist effizient und dauert etwa 30 Minuten bis zu einer Stunde.
Führen Sie eine Perfusion an der eingeschläferten Ratte durch, wie im Textmanuskript erwähnt. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Haut des Rückens und der Sohle von der Hinterpfote zu entfernen. Für Proben, die einen gefrorenen Abschnitt erfordern, fixieren Sie das Gewebe in 4% aus Aldehyd in 0,1 molaren PB für zwei Stunden.
Nach dem Waschen betten Sie die Hauttücher bei 37 Grad Celsius in 2% Agarose ein und legen Sie sie zur Kühlung in die Eisbox. Fixieren Sie das montierte Gewebe mit Eiswasser auf dem Vibrationsmikroton und schneiden Sie es mit einer Dicke von 500 Mikrometern in Querrichtung auf. Entfernen Sie nach dem Schneiden die Agarose aus den Abschnitten und lagern Sie sie in einer Sechs-Well-Platte mit 1x PBS.
Inkubieren Sie die Gewebeabschnitte in einer Lösung von 2% Triton X-100 in 1x PBS über Nacht bei vier Grad Celsius. Legen Sie die Gewebeabschnitte in den Sperrpuffer und drehen Sie sie mit 72 Umdrehungen pro Minute auf dem Shaker über Nacht bei vier Grad Celsius. Die Gewebeabschnitte werden in die Lösung mit den primären Antikörpern des monoklonalen Anti-CGRP-Antikörpers der Maus und des polyklonalen Anti-LYVE-1-Antikörpers der Schafe im Verdünnungspuffer im Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Dann zwei Tage bei vier Grad Celsius auf dem Shaker drehen. Waschen Sie die Gewebepartien zweimal mit Waschpuffer bei Raumtemperatur und halten Sie sie dann über Nacht bei vier Grad Celsius im Waschpuffer auf dem Shaker. Am nächsten Tag die Gewebeabschnitte in die Mischlösung mit den sekundären Antikörpern in einem Mikrozentrifugenröhrchen überführen und mit 72 Umdrehungen pro Minute auf dem Shaker fünf Stunden lang bei vier Grad Celsius rotieren.
Waschen Sie die Gewebeabschnitte in einer Platte mit sechs Vertiefungen mit Waschpuffer zweimal für eine Stunde bei Raumtemperatur. Halten Sie die Gewebeabschnitte im Waschpuffer auf dem Shaker über Nacht bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die Gewebeabschnitte in das Gewebereinigungsreagenz und drehen Sie sich mit 60 Umdrehungen pro Minute sanft für eine Stunde bei Raumtemperatur.
Montieren Sie das klare Gewebe auf dem Objektträger, umkreisen Sie dann das Gewebe mit einem Abstandshalter und kleben Sie den Spalt mit frischem Gewebereinigungsreagenz und Deckschlitten. Das 3D-Muster zeigte, dass die CGRP-positiven Nervenfasern durch das Unterhautgewebe und die Dermis zur Epidermis gelangten. Diese Nervenfasern verliefen in Bündeln im Unterhautgewebe, die innerhalb der Dermis verzweigt und in der Epidermis abgeschlossen waren.
Im Gegensatz dazu sind Phalloidin in positiven Blutgefäßen und LYVE-1-positive Lymphgefäße im Unterhautgewebe und in der Dermis verteilt. Im Allgemeinen verliefen die CGRP-positiven Nervenfasern parallel zu den Blutgefäßen und Lymphgefäßen und umgaben sie und bildeten ein 3D-Netzwerk in der behaarten und kahlen Haut. Beim konventionellen Ansatz waren zwar die Nervenfasern Blutgefäße und Lymphgefäße in den dünnen Abschnitten eindeutig mit CGRP-Phalloidin und LYVE-1 markiert, die Beobachtung dieser Strukturen war jedoch durch die Schichtdicke begrenzt und kann nicht vollständig beobachtet werden.
In dem Abschnitt mit einer Dicke von 30 Mikrometern gab es keinen Unterschied zwischen behaarter Haut und kahler Haut in der Oberfläche von CGRP-positiven Nervenfasern. In den 300 Mikrometern dicken Gewebeabschnitten wurde im Vergleich zu behaarter Haut die Oberfläche von CGRP-positiven Nervenfasern der kahlen Haut signifikant vergrößert. Es ist wichtig, den Reinigungspuffer mit hohem osmotischem Druck nach der Antikörperinkubation zu verwenden.
Mehrmals ist die Reinigungszeit notwendig, die für die Immunfluoreszenzfärbung benötigt wird. Nach diesem Verfahren glauben wir, dass es auch eine Möglichkeit der Färbung und Beobachtung anderer Gewebe und Organe in sechs Abschnitten gibt. Diese Technik könnte neurowissenschaftlichen Forschern helfen, auf die Oberfläche und den Zustand von Neurofasern zu stoßen.
Es hilft uns auch, die Innovation von Geweben und Organen zu beobachten.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine neuartige Gewebeklärungstechnik zur Visualisierung kutaner Nervenfasern in dicken 300 µm-Gewebeschnitten mittels konfokaler Mikroskopie vor. Die Methode verbessert die morphologische Untersuchung der Hautinnervation und behebt die Einschränkungen herkömmlicher Dünnschnitttechniken.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Gewebebildgebung
- Konfokale Mikroskopie
Hintergrund
- Die Untersuchung der Hautinnervation ist entscheidend für das Verständnis sensorischer Bahnen.
- Herkömmliche Methoden sind durch die Dünne der Gewebeschnitte begrenzt.
- Die Visualisierung von Nervenfasern in dickeren Schnitten kann tiefere Einblicke ermöglichen.
- Das Verfahren zielt darauf ab, die Bildgenauigkeit und Effizienz zu verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung und Validierung einer Gewebeklärungstechnik für dicke Hautschnitte.
- Erleichterung der Beobachtung von Nervenfasern und deren Beziehung zu Blut- und Lymphgefäßen.
- Bereitstellung einer Methode, die zur Untersuchung anderer Gewebe und Organe angepasst werden kann.
Verwendete Methoden
- Die konfokale Mikroskopie wurde verwendet, um Nervenfasern in geklärten Gewebeschnitten sichtbar zu machen.
- Das biologische Modell umfasste euthanasierte Ratten, wobei speziell die Haut des Rückens und der Hinterpfote untersucht wurde.
- Zentrale Schritte beinhalteten die Gewebedurchspülung, Einbettung, Antikörperfärbung und Gewebeklärung.
- Das gesamte Reinigungs- und Abbildungsprotokoll dauert in der Regel 30 Minuten bis eine Stunde.
Hauptergebnisse
- Die Klärtechnik enthüllte erfolgreich CGRP-positive Nervenfasern, die ein dreidimensionales Netzwerk in der Haut bilden.
- Die Ergebnisse zeigten signifikante Unterschiede in der Verteilung der Nervenfasern zwischen behaarter und glatter Haut.
- Die Methode ermöglichte eine detaillierte Beobachtung der strukturellen Beziehungen zu Blut- und Lymphgefäßen.
- Es wurde festgestellt, dass CGRP-positive Fasern parallel zu Blut- und Lymphgefäßen verlaufen oder diese umgeben.
Schlussfolgerungen
- Diese Technik verbessert die Fähigkeit, Hautinnervation umfassend zu visualisieren und zu untersuchen.
- Die verbesserte Visualisierung könnte wertvolle Einblicke in neurobiologische Mechanismen liefern.
- Mögliche Anwendungen erstrecken sich auf verschiedene Gewebe und fördern dadurch die neurowissenschaftliche Forschung in einem weiteren Umfang.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dreidimensionale Visualisierung der Hautinnervation mithilfe von dicken Gewebeschnitten und multiplexer fluoreszenter Färbung schließt eine entscheidende Lücke bei der Abbildung der peripheren Nervenarchitektur. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem er eine umfassende Analyse der Wechselwirkungen zwischen Nerven, Blut- und Lymphgefäßen in krankheitsrelevanten Hautmodellen ermöglicht. Die Methode unterstützt die translationale Kontinuität für forschungs- und entwicklungsspezifische Portfolios im Bereich der Neurobiologie und Dermatologie.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine detaillierte Kartierung der Verteilung sensorischer Nervenfasern in behaarter und glatter Haut.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch Klärung der räumlichen Beziehungen zwischen Nerven und Gefäßen.
- Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung in der Forschung zum peripheren Nervensystem.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erleichtert die Herstellung validierter 3D-Hautmodelle für die nachgeschaltete phänotypische Untersuchung.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit von Assays durch die Standardisierung von Gewebedurchsichtigmachungs- und Färbeprotokollen.
- Liefert quantitative Ergebnisse zur Oberfläche der Nervenfasern und zur Netzwerkkomplexität.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung auf krankheitsrelevante Systeme durch Modellierung der Innervation von behaarter und unbehaarter Haut.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung neurokutaner Zielstrukturen.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem strukturelle Biomarker im Hautgewebe aufgedeckt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese multiplexe Bildgebungsmethode integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Forschung und verbindet frühe mechanistische Studien mit der Entwicklung translationsnaher Modelle.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Überprüfung von Hypothesen zu Nerven-Gefäß-Wechselwirkungen in der Haut.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative 3D-Auswertungen für die Assay-Entwicklung.
- Analytik: Bietet Oberflächenmessungen und Netzwerkkartierungen für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Biomarker-Korrelierung in krankheitsrelevanten Hautmodellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet ein standardisiertes Protokoll, das auf andere Gewebe und Organsysteme übertragbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert Mehrdeutigkeiten bei der Nervenkartierung.
- Operativer Wert: Vereinfacht die Gewebeverarbeitung durch effiziente Klär- und Färbeprozesse.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung zwischen Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem belastbare 3D-Daten für die Zielstrukturbeurteilung bereitgestellt werden.
- Portfolioauswirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von neurokutanen und dermatologischen Programmen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in konfokaler Mikroskopie und multiplexer Immunfluoreszenz.
- Benötigt Zugang zu Gewebe-klarstellenden Reagenzien und bildgebender Infrastruktur.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise bei Färbungs- und Klarstellungprotokollen über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus.
- Kann bei Optimierung der Protokolle auf verschiedene Gewebetypen angewendet werden.
- Hängt von der Qualität der Antikörper und der Effizienz der Klarstellung für optimale Ergebnisse ab.
Biopharma-FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:43
Perfusion, Triple Fluorescent Staining, and Tissue Clearing Treatment
3:10
Results: Enhanced Understanding of the Skin Innervation via Immunofluorescence and a 3D View of the Cutaneous Nerve Fibers in the Hairy and Glabrous Skin
4:31
Conclusion
