Visualisierung der Narbenentwicklung mit SCAD Assay - einem Ex-situ Hautnarbentest

Zuvor verwendeten In-vitro- oder Ex-vivo-Modellen fehlen dermale Zellbestandteile und Komplexität des Hautgewebes. Dieser Ex-situ-SCAD-Assay überwindet eine festgelegte Einschränkung und ermöglicht die Untersuchung der Entwicklung von Narben außerhalb des verwundeten Tieres. Der SCAD-Assay ermöglicht die Visualisierung der Migration von Fibroblasten und der Narbenbildung in Mikroumgebungen der Haut.

Es ermöglicht Screening-Bibliotheken von Aktivatoren oder Inhibitoren, die mechanistischen Grundlagen der Narbenbildung zu verstehen. Hochdurchsatz-Screening-Assays von flachen Bibliotheken unter Verwendung des SCAD-Modells zum Verständnis des grundlegenden Prozesses und des Molekülverlaufs, der an der Wundreparatur beteiligt ist. Der SCAD-Assay ist mit den Hautexplantaten einfach durchzuführen.

Für eine konsistente Narbe wird empfohlen, die Haut nach der Geburt am Tag Null oder am ersten Tag auszuwählen. Nachdem Sie den postnatalen Tag Null oder den ersten Tag eines neugeborenen Welpen geopfert haben, verwenden Sie ein steriles chirurgisches Skalpell, um vorsichtig 1,5 x 1,5 Zentimeter große Rückenhaut in voller Dicke bis zur Skelettmuskelschicht zu entfernen. Schälen Sie die Haut mit sterilen gekrümmten Pinzetten und stellen Sie sicher, dass die oberflächliche Faszie mit dem darunter liegenden Musculus panniculus carnosus intakt ist.

Waschen Sie das ausgeschnittene Gewebe mit 50 bis 100 Millilitern kaltem DMEM F-12-Medium, um kontaminierendes Blut zu entfernen. Waschen Sie dann das Gewebe mit Hanks ausgewogener Salzlösung, um die Lebensfähigkeit von Gewebe und Zellen zu erhalten. Legen Sie die Haut kopfüber mit oberflächlicher Faszie in eine 10 Zentimeter große Petrischale mit DMEM F-12 Medium.

Schneiden Sie dann mit einem Einweg-Zwei-Millimeter-Biopsiestempel runde Hautstücke in voller Dicke aus, um Schorfgewebe zu erzeugen, und stellen Sie sicher, dass die oberflächliche Faszie mit dem darunter liegenden Musculus panniculus carnosus bis zur Epidermis intakt ist. Fügen Sie 200 Mikroliter frisches DMEM F-12-Komplettmedium ohne Phenolrot in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu. Mit sterilen Pinzetten können Sie einzelnes Schorfgewebe kopfüber in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte übertragen und vollständig eintauchen.

Überführen Sie die Platte in einen Zellkulturinkubator, der unter Standardbedingungen gewartet wird. Entfernen Sie an den Tagen zwei und vier der Kultur das Medium, das 10 Mikroliter im Bohrloch verbleibt, und fügen Sie frisches, vorgewärmtes DMEM F-12-Komplettmedium zusammen mit den Behandlungsverbindungen hinzu, um die Lebensfähigkeit von Zellen und Geweben aufrechtzuerhalten. Für die Live-Bildgebung von SCADs bereiten Sie 30 Milliliter 2 bis 3% niedrig schmelzende Agaroselösung in PBS in einer Glasflasche durch Erhitzen in einer Mikrowelle vor.

Nach dem Kochen sofort die Flasche umfüllen und die flüssige Agaroselösung in einem 40 Grad Celsius warmen Wasserbad abkühlen. Als nächstes übertragen Sie das SCAD-Gewebe mit Faszien oder Narben, die nach oben zeigen, auf die Mitte einer 35-Millimeter-Schale. Dann betten Sie den SCAD bei Raumtemperatur ein, indem Sie mit einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze langsam 40 Grad Celsius flüssige Agarose auf das Gewebe gießen.

Agarose polymerisiert innerhalb von zwei Minuten. Nach der Polymerisation zwei Milliliter vorgewärmtes DMEM F-12 Vollmedium hinzufügen. Erfassen Sie dann mit einem konfokalen oder einem Multiphotonenmikroskop, das mit geeigneten Inkubationssystemen ausgestattet ist, die im Manuskript erläutert werden, Zeitrafferbilder vom Tag Null bis zum ersten Tag.

Für die Gewebeentnahme waschen Sie das Gewebe zu relevanten Zeitpunkten, indem Sie die Medien durch steriles PBS ersetzen. Übertragen Sie jede SCAD mit steriler Pinzette auf ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 500 Mikroliter 2% Paraformaldehyd enthält, um das Gewebe über Nacht bei vier Grad Celsius zu fixieren. Waschen Sie am nächsten Tag das Gewebe dreimal mit PBS, bevor Sie mit der zwei- oder dreidimensionalen Immunfluoreszenzfärbung fortfahren, wie im Textmanuskript beschrieben.

Hier werden die repräsentativen Ganzfeld-Hellfeldbilder von SCADs an den Tagen Null und fünf gezeigt. Die trichrome Färbung der vertikalen Gewebeabschnitte des Masson zeigt Signaturen von Gewebenarbenbildung, Gewebekontraktion und Akkumulation von extrazellulärer Matrix am Narbenkern an den Tagen Null und Fünf. Die Immunfluoreszenzfärbung von SCADs an den Tagen Null und fünf wird gezeigt.

Von der Narbe im Früh- und Spätstadium wird der tief verwurzelte positive Fibroblast in Grün und der tief verwurzelte negative Fibroblast in Rot dargestellt. Für die dreidimensionale Bildgebung wurden Gewebe in Agaroselösung eingebettet und mit PBSGT überzogen. Die repräsentativen Bilder zeigen die exklusive Lokalisierung des N-Cadherin-Proteins an der Narbenstelle eines SCAD am fünften Tag.

Der dreidimensionale Zeitraffer-Bildgebungsaufbau, der mit einer Inkubationskammer ausgestattet war, zeigte frühe Ereignisse des Fortschreitens der Fibroblastenschwärme in den ersten 12 Stunden oder frühe Stadien der Narbenentwicklung. Die grafische Darstellung von einzellig verfolgten zellulären Trajektorien einzelner Fibroblasten über die Narbenentwicklung wird hier vorgestellt. Es ist wichtig, das SCAD-Gewebe verkehrt herum in der Bohrlochplatte zu platzieren, so dass die Faszie nach oben zeigt.

Würde dies nicht geschehen, würde dies zu unvermeidlichen Schwankungen der Migrationsmuster führen. Dieses Verfahren ermöglicht es, dermale Schichten für Behandlungen oder Kultur mit chemischen Modulatoren, neutralisierenden Antikörpern oder viralen Methoden zu untersuchen. Dies hilft bei der Beurteilung pathologischer fibrotischer Reaktionen in verschiedenen medizinischen Umgebungen.

Wir zeigten die Expression von Connexin-43 und N-Cadherin als Schlüsselmoleküle, die an der Faszienmobilisation bei der Wunde beteiligt sind. Die SCAD-Methodik ermöglicht die Identifizierung neuartiger therapeutischer Strategien zur Eindämmung von Narbenbildung und Fibrose.