Name: Intravitreale Injektionen in das Schafauge (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 37 s
Description: Erfahren Sie das Protokoll für intravitreale Injektionen im Schafauge als Modell für humane Augenbehandlungen. Diese Methode ermöglicht die gezielte Gentherapie zur Behandlung von Netzhautdegenerationen.

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Die Autoren danken Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) für seine Unterstützung bei der Erstellung dieses Protokolls und der Durchführung der von Murray et al.15 beschriebenen Injektionen. Die Autoren würdigen auch die Finanzierung durch CureKids New Zealand, die Canterbury Medical Research Foundation, Neurogene Inc und die Batten Disease Support and Research Association.

Alle experimentellen Protokolle wurden vom Lincoln University Animal Ethics Committee genehmigt und entsprechen den Richtlinien der US National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Tieren in der Forschung und dem New Zealand Animal Welfare Act (1999). Borderdale-Schafe wurden bei der Geburt14 diagnostiziert und auf Forschungsfarmen der Lincoln University gepflegt. Drei 3 Monate alte homozygote (CLN5-/-) Mutterschafe erhielten eine einzige IVT-Injektion in das linke Auge, wobei das unbehandelte rechte Auge als interne Kontrolle diente. Elektroretinographie- und Pathologiedaten wurden mit historischen gesunden und betroffenen Kontrolldaten verglichen. Der in dieser Studie verwendete virale Vektor war ein selbstkomplementärer Adeno-assoziierter Virus-Serotyp 9, der den Chicken Beta Action (CBh)-Promotor und das Codon-optimierte Schaf CLN5 (scAAV9/CBh-oCLN5opt) enthielt. Der virale Vektor wurde von der University of North Carolina Vector Core, NC, USA zur Verfügung gestellt.
1. Prächirurgie
<ol><li>Autoklavieren Sie das OP-Kit (Abbildung 1).</li>
	<li>Fasten Sie die Schafe für 24 Stunden vor der Operation.</li>
	<li>Erfassen Sie Lebendgewichte vor der Operation.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig01.jpg"> Abbildung 1: Intravitreales Chirurgie-Kit. Zu den Instrumenten, die für die IVT-Operation erforderlich sind, gehören (1) ein Spekulum, um die Augenlider offen zu halten, und (2) ein Paar gebogene Nasenzangen, um die bulbäre Bindehaut zu greifen und das Auge zu drehen. (3) Ein gerader Nasenhämostat ist auch als alternatives Instrument enthalten, um die bulbäre Bindehaut zu greifen und das Auge an Ort und Stelle zu halten, wenn es in die Augenhöhle zurückgerollt ist. Dieses Kit wird vor der Operation autoklaviert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
2. Chirurgischer Eingriff
<ol><li>Halten Sie das Tier fest und rasieren Sie die Wolle mit elektronischen Haarschneidern von einer Seite des Halses über die Halsvene.</li>
	<li>Verschließen Sie die Halsvene, indem Sie Druck auf die Basis der Jugularrille ausüben und die erhöhte Vene visualisieren.</li>
	<li>Die entsprechende Menge Diazepam (0,3 mg/kg) und Ketamin (7,5 mg/kg) in eine sterile Spritze geben und eine sterile 20 g Nadel anbringen. Führen Sie die Nadel in die Halsvene ein und ziehen Sie den Kolben vorsichtig zurück, um sicherzustellen, dass Blut in die Nabe gelangt und sich die Nadel in der Vene befindet. Nach der Bestätigung durch intravenöse (juguläre) Verabreichung induzieren.</li>
	<li>Legen Sie das Tier unmittelbar nach der Induktion in eine dorsale Liege, strecken Sie den Hals aus und halten Sie die Zunge mit einem Laryngoskop nach oben, um den Kehlkopf zu visualisieren. Führen Sie eine endotracheale Intubation durch, indem Sie beim Ausatmen des Tieres vorsichtig einen Endotrachealtubus (Größe 6,0-9,0 je nach Größe des Schafes) zwischen die Stimmbänder einführen. Blasen Sie die Endotrachealmanschette sofort auf und sichern Sie den Schlauch mit einer Krawatte um den Unterkiefer. Bestätigen Sie den Luftstrom durch das Rohr.</li>
	<li>Legen Sie die Schafe auf den OP-Tisch und legen Sie sie in seitliche Liege.</li>
	<li>Verbinden Sie sofort den Endotrachealtubus mit den Schläuchen des Anästhesiegeräts, um Isofluran in 100% Sauerstoff abzugeben. Beginnen Sie zunächst mit 3% -4% Isofluran und reduzieren Sie dann auf 2% -3% für die Wartung. Beobachten Sie die spontane Belüftung der Schafe.</li>
	<li>Überwachen Sie die Herzfrequenz (Pulsfrequenz), die Atemfrequenz, die Sauerstoffsättigung, die endtidalen CO2-Werte und die rektale Körpertemperatur während des gesamten Verfahrens. Siehe Tabelle 1 für physiologische Werte für diese Parameter bei betäubten Schafen (variabel, aber als Orientierungshilfe zu verwenden).</li>
	<li>Legen Sie einen großen, sterilen, quadratischen Vorhang auf einen chirurgischen Operationswagen, gefolgt von den sterilen Instrumenten.</li>
	<li>Positionieren Sie einen sterilen, fenestrierten chirurgischen Vorhang über dem zu injizierenden Auge.</li>
	<li>Desinfizieren Sie das Auge aseptisch mit einer sterilen 20-ml-Spritze, um das Auge mit 1-5% iger Povidon-Jod-Lösung zu spülen.</li>
	<li>Tragen Sie 1-2 Tropfen Alcain 0,5% W/V Augenlösung als Lokalanästhetikum auf das Auge auf.</li>
	<li>Bringen Sie ein Nopa Barraquer-Colibri Augenspekulum (10 mm) an die Augenlider, um das Auge offen zu halten.</li>
	<li>Fassen Sie die bulbäre Bindehaut auf dem dorsolateralen Aspekt des Auges mit einer Pinzette und drehen Sie die Augenkugel ventromedial.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Bewusst</td>
			<td>Betäubt</td>
			<td>Empfohlener kritischer Interventionspunkt</td>
		</tr><tr><td>Herzfrequenz (Schläge/Min.)</td>
			<td>50-80 (Ruhe) bis 280 (aktiv)</td>
			<td>50-80</td>
			<td>&lt;50, &gt;100</td>
		</tr><tr><td>Atemfrequenz (Atemzüge/min)</td>
			<td>15-40 (Rest) bis 350 (überhitzt)</td>
			<td>10-30</td>
			<td>&lt;8, &gt;40</td>
		</tr><tr><td>Sauerstoffsättigung (mm Hg)</td>
			<td>95-100</td>
			<td>98-100</td>
			<td>&lt;90</td>
		</tr><tr><td>Endtidales CO2 (mm Hg)</td>
			<td>35-45</td>
			<td>35-45</td>
			<td>&gt;55</td>
		</tr><tr><td>Körpertemperatur (°C)</td>
			<td>38.5-39.5</td>
			<td>38.5-39.5</td>
			<td>&lt;36, &gt;40</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Physiologische Werte der bei betäubten Schafen zu überwachenden Parameter.
3. Virale Vorbereitung
<ol><li>Bewahren Sie AAV-Vektoraliquots bis zur Verwendung bei −80 °C auf.</li>
	<li>Am Tag der Operation tauen Sie die erforderliche Anzahl von Fläschchen für die IVT-Lieferung auf Eis auf.</li>
	<li>Unmittelbar vor der Verabreichung den viralen Vektoraliquot vortex und 10 s bei 400 × g zentrifugieren, um den Inhalt zu sammeln.</li>
	<li>Verdünnen Sie jeden viralen Vektoraliquot in steril filtrierter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf die gewünschte Dosis in einem Endvolumen von 100 μL. Bereiten Sie Vektorverdünnungen in einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger Proteinbindung unter Verwendung steriler Filterpipettenspitzen vor. Entsorgen Sie alle Verbrauchsmaterialien, die mit dem viralen Vektor in Kontakt gekommen sind, in Desinfektionslösung (siehe Materialtabelle). ANMERKUNG: In der Originalpublikation15 wurde die Dosis des Therapeutikums (AAV9. CLN5) war 1,9 x10 10 virale Genome. Die empfohlene Dosierung variiert je nach verabreichtem Therapeutikum; Daher wurde eine Dosierung nicht in das hier vorgestellte Standardprotokoll aufgenommen.</li>
	<li>Ziehen Sie die vollen 100 μL des AAV-Vektorpräparats in eine sterile, totraumarme 1-ml-Spritze mit einer fest angebrachten 28 G x 1/2-in-Nadel zur sofortigen Injektion. Stellen Sie sicher, dass die Zeitspanne von der Zubereitung bis zur Injektion weniger als 2 Minuten beträgt.</li>
</ol>4. Virale Verabreichung
<ol><li>Führen Sie die Nadel etwa 7 mm hinter der Sklera auf der lateralen Seite des Auges ein und schwenken Sie sie nach hinten, um die Linse zu vermeiden (Abbildung 2 und Abbildung 3). Verabreichen Sie die einmalige Injektion von 100 μL als Bolus so nah wie möglich an der Netzhaut, ohne die Netzhautoberfläche zu stören.</li>
	<li>Spülen Sie das Auge mit ca. 10-15 ml 1-5% iger Povidon-Jod-Lösung, gefolgt von 10 ml Kochsalzlösung, bevor Sie das Spekulum entfernen und abdecken.</li>
	<li>Drehen Sie die Schafe um und wiederholen Sie dies bei Bedarf mit dem anderen Auge.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig02.jpg"> Abbildung 2: Ventromediale Rotation der Augenkugel . (A) Fassen Sie die bulbäre Bindehaut mit einer Zange ohne Zahn und (B) drehen Sie sich ventromedial (d. h. nach unten und zur Schnauze hin), um die dorsolaterale Oberfläche des Auges für die Injektion freizulegen. Abkürzungen: V = ventral, D = dorsal, M = medial, L = lateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig03.jpg"> Abbildung 3: Injektionsposition und -tiefe. Die Nadel wird auf den dorsolateralen Aspekt der Augenkugel injiziert und die gesamte Länge des Nadelschaftes (0,5 Zoll / 12,7 mm) wird in das Auge eingeführt. Beachten Sie den Winkel der Nadel zum hinteren Teil des Auges, um die Linse zu vermeiden und so nah wie möglich an die Netzhaut zu injizieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
5. Postoperatives Management
<ol><li>Beenden Sie nach Abschluss des Verfahrens die Isoflurangasinhalationsanästhesie, spülen Sie die Leitung mit 100% Sauerstoff, trennen Sie den Schlauch vom Endotrachealtubus und bringen Sie die Schafe in den Aufwachraum.</li>
	<li>Legen Sie die Schafe in eine sternale Liege, wobei die Beine darunter versteckt sind, und überwachen Sie sie, bis sie sich vollständig erholt haben. Stellen Sie sicher, dass das Maul des Tieres frei von Hindernissen ist.</li>
	<li>Wenn der Schluckreflex beobachtet wird, entleeren Sie die Manschette des Endotrachealtubus teilweise und entfernen Sie den Schlauch vorsichtig aus dem Mund.</li>
	<li>Verabreichen Sie ein intramuskuläres nichtsteroidales entzündungshemmendes Mittel in den Bizeps femoris-Muskel der Hintergliedmaße, subkutane Antibiotika an der Seite des Halses oder hinter der Schulter und 0,5% Chloramphenicol Augentropfen auf die Oberfläche der Augenkugel.</li>
	<li>Stellen Sie Wasser und Futter (Luzernepellets und Spreu) bereit, sobald die Schafe ohne Hilfe stehen können.</li>
	<li>Verabreichen Sie 0,5% Chloramphenicol Augentropfen 2-3 pro Tag für 7 Tage nach der Operation.</li>
	<li>Halten Sie die Schafe über Nacht drinnen, bevor sie etwa 24 Stunden nach der Operation auf die Außenkoppel zurückkehren.</li>
	<li>Aufzeichnung der rektalen Temperaturen täglich für 3 Wochen. Überwachen Sie auf Veränderungen des Pulses oder der Atemfrequenz, der Nahrungsaufnahme, des Neuroverhaltens, der Körpertemperatur, des Gewichts, der Körperhaltung, der Augengesundheit und der klinischen Anzeichen von Krankheit. Suchen Sie eine geeignete tierärztliche Behandlung auf, wenn es Anzeichen für unerwünschte Ereignisse gibt.</li>
</ol>6. Bewertung der Wirksamkeit in vivo
<ol><li>Wenn das Ziel der IVT-Injektion darin besteht, das Sehvermögen zu erhalten, überwachen Sie die Wirksamkeit in vivo durch Methoden wie Labyrinthtests oder Elektroretinographie (ERG) zur Beurteilung der Netzhautzellfunktion oder optische Kohärenztomographie (OCT) zur Beurteilung der Netzhautstruktur. HINWEIS: Diese Wirksamkeitsmaßnahmen wurden nach der IVT-Gentherapie 11,15,16 gut beschrieben.</li>
</ol>7. Postmortale Gewebeanalyse
<ol><li>Durchführung der Schafeuthanasie nach einer zugelassenen Methode an einem geeigneten Endpunkt nach intravitrealer Injektionsoperation. ANMERKUNG: Vorgeschlagene Euthanasiemethoden, wie intravenöse veterinärmedizinische Euthanasiemedikamente oder ein eindringender Bolzen an der Halswirbelsäule, gefolgt von einer schnellen Exsanguination, sind an anderer Stelle15,16 detailliert beschrieben.</li>
	<li>Ernten Sie Schafaugenkugeln mit einer chirurgischen scharfen / stumpfen gebogenen Schere. Schneiden Sie die laterale und mediale Canthus, um die Öffnung der Augenhöhle zu vergrößern, und schneiden Sie dann systematisch durch die Bindehautfalten, das Bindegewebe, die Muskeln und den Sehnerv, um die Augenkugel von der Augenhöhle zu befreien.</li>
	<li>Intakte, enukleierte Augenkugeln in 10% Formalin für 2 h eintauchen, gefolgt von einer Nachfixierung in Bouins Lösung für 4 h, wobei ein kleiner (0,5 cm) Schnitt in der Sklera vorgenommen wird, um eine ausreichende Durchblutung zu ermöglichen. Alternativ können Sie die Augenkugeln für 48 Stunden in Davidsons Lösung eintauchen.</li>
	<li>Verarbeiten Sie Schnitte des Augengewebes durch routinemäßiges Einbetten und Schneiden von Paraffinwachs bei 3-5 μm. ANMERKUNG: Färbeverfahren für Hämatoxylin- und Eosin (H&amp;E)-Färbung und immunhistochemische Analyse wurden zuvorbeschrieben 15,16.</li>
	<li>Beurteilen Sie die Wirksamkeit in postmortalem Gewebe durch Maßnahmen wie Gesamtdicke der Netzhaut, Dicke der Netzhautschicht, Anzahl der Zellreihen der äußeren Kernschicht und immunhistochemische Färbung für retinale Zelltypen, retinale Gliazellen oder Proteine von Interesse. HINWEIS: Protokolle für diese Analysen finden Sie in früheren Publikationen15,16.</li>
</ol>

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<li>Henein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics+of+intravitreal+injections+into+liquid+vitreous+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics of intravitreal injections into liquid vitreous substitutes.</a> Pharmaceutics. 11 (8), 371(2019).</li>
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<li>Kiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Considerations+for+Ocular+Gene+Therapy.+Adeno-associated+virus+vectors+offer+a+safe+and+effective+tool+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Retinal+Physician%22%5BJournal%5D)">Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery.</a> Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).</li>
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<li>Kleine Holthaus, S. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+brain-directed+gene+therapy+rescues+a+mouse+model+of+neurodegenerative+CLN6+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease.</a> Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).</li>
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Intravitreale Injektionen sind eines der häufigsten chirurgischen Verfahren in der menschlichen Ophthalmologie und haben sich bei der Verabreichung von AAV-vermittelten Gentherapien an die Netzhaut von Schafen als wirksam erwiesen. Wir hatten zuvor die Wirksamkeit von AAV9 nachgewiesen. Die CLN5-Gentherapie führte intravitreal zur Abschwächung von Netzhautdysfunktion und Degeneration bei Schafen mit CLN5 NCL15. Es ist zu hoffen, dass sich auch die Übertragung dieses Verabreichungsweges an menschli...

Mehrere Methoden können verwendet werden, um Therapeutika an die Netzhaut abzugeben, einschließlich intravitrealer (IVT), subretinaler, suprachoroidaler, periokularer oder topischer Verabreichung. Jeder Verabreichungsweg beinhaltet die Überwindung von Barrieren wie der Blut-Netzhaut-Schranke oder den inneren und äußeren Begrenzungsmembranen und hat je nach verabreichtem Arzneimittel und spezifischem Netzhautzielunterschiedliche Wirksamkeitsraten 1,2.
IVT Medikamentenabgabe beinhaltet eine Injektion in den Glaskörper des Auges, eine gallertartige Substanz, die die hintere Augenkammer besetzt. Die Hauptfunktion des Glaskörpers besteht darin, die Form der Augenkugel zu erhalten und Augengewebe wie Linse und Netzhaut an Ort und Stelle zu halten. Der Glaskörper besteht größtenteils aus Wasser, mit geringen Mengen an Kollagen, Hyaluronsäure und anderen nicht-kollagenen Proteinen3. Die IVT-Injektion ist ein einfaches und gebräuchliches Verfahren, das routinemäßig zur Behandlung einer Vielzahl von Augenerkrankungen angewendet wird, einschließlich altersbedingter Makuladegeneration, diabetischer Makulaödeme, diabetischer Retinopathie, Netzhautvenenverschluss und mehrerer erblicher Netzhautdystrophien 4,5.
Neuronale Ceroid-Lipofuszinosen (NCL; Batten-Krankheit) sind eine Gruppe von tödlichen lysosomalen Speicherkrankheiten, die eine schwere Degeneration des Gehirns und der Netzhaut verursachen. Derzeit sind 13 Varianten von NCL bekannt, die aus Mutationen in verschiedenen Genen (CLN1-8, CLN10-14) resultieren, die überwiegend Kinder betreffen, aber unterschiedliches Erkrankungsalter und Krankheitsschweregrad6 aufweisen. Die NCLs teilen gemeinsame progressive Symptome, einschließlich kognitivem und motorischem Verfall, Krampfanfällen und Sehverlust. Es gibt keine Heilung für NCL; Die gehirngesteuerte Enzymersatztherapie befindet sich jedoch derzeit in klinischen Studien für die CLN2-Krankheit7,8, und die AAV-vermittelte Gentherapie hat sich in präklinischen Studien als vielversprechend erwiesen, wobei eine klinische Studie für die CLN5-Gentherapie voraussichtlich 2022 beginnen wird 9,10.
Viele andere Arten entwickeln natürlich vorkommende Formen von NCL, einschließlich Katzen, Hunde, Schafe und Kühe. Zwei NCL-Schafmodelle werden derzeit in Neuseeland aktiv untersucht: ein CLN5-Krankheitsmodell bei Borderdale-Schafen und ein CLN6-Krankheitsmodell bei Schafen in South Hampshire. Betroffene Schafe weisen viele der klinischen und pathologischen Merkmale der menschlichen Krankheit auf, einschließlich Netzhautatrophie und Sehverlust10,11. Obwohl die gehirngesteuerte CLN5-Gentherapie bei Schafen mit CLN5-Krankheit Hirnatrophie und klinischen Verfall verhindern oder stoppen kann, verlieren die behandelten Schafe immer noch ihrSehvermögen 9. Dies unterstrich die Notwendigkeit, die Netzhaut zu behandeln, um das Sehvermögen zu erhalten und eine bessere Lebensqualität zu erhalten, was zur Erstellung eines Protokolls für die Augengentherapie bei Schafen führte.
Das Schafauge stellt aufgrund seiner Ähnlichkeit in den Augenkugelabmessungen, dem Glaskörper und der Netzhautstruktur10,12,13 ein gutes Modell des menschlichen Auges dar. Dieser Artikel beschreibt das chirurgische Protokoll für die IVT-Abgabe eines kleinen Volumens (≤100 μL) therapeutischen viralen Vektors an das Schafauge.

<table><tbody><tr><td>1 mL Sicherheitsspritze mit niedrigem Totraum und fest angebrachter 0,5-Zoll-Nadel</td><td>Fisher Scientific, Auckland, Neuseeland</td><td>05-561-28</td><td>Covidien Monoject Tuberculin Sicherheitsspritze oder ähnlich</td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HS4323</td><td>Autoklavenröhrchen zur Sterilisation vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>Anästhesiegerät mit Gasbank und Monitor;</td><td>Hyvet Anesthesia, Christchurch, Neuseeland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiotische Augentropfen&nbsp;</td><td>Teva Pharma Ltd, Auckland, Neuseeland</td><td></td><td>Handelsname: Chlorafast (0,5 % Chloramphenicol)</td></tr><tr><td>BrightMount plus Anti-Fade-Eindeckmedium</td><td>Abcam, Cambridge, Vereinigtes Königreich</td><td>ab103748</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4& prime; ,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, Vereinigte Staaten</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Diazepam-Beruhigungsmittel</td><td>Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, Neuseeland</td><td></td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Endotrachealkanülen</td><td>Flexicare Medical Ltd, Eberesche, Vereinigtes Königreich</td><td></td><td>Standard, mit Manschette. Größen 7, 7,5 oder 8 je nach Schafgröße</td></tr><tr><td>Augenspekulum</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Neuseeland</td><td>KP151/14</td><td>Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)</td></tr><tr><td>Fenestiertes OP-Tuch</td><td>Amtech Medical Ltd, Whanganui, Neuseeland</td><td>DI583</td><td>Oder ähnliches&nbsp;</td></tr><tr><td>Filterspitzen</td><td>Interlab, Auckland, Neuseeland</td><td></td><td>10, 200 und 1.000 & micro; L&nbsp;</td></tr><tr><td>Formaldehydlösung (37%)</td><td>Fisher Scientific, Auckland, Neuseeland</td><td>AJA809-2.5PL</td><td>Herstellung von bis zu 10% in destilliertem Wasser mit 0,9% NaCl</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen Carlsbad, CA, USA</td><td>&nbsp; A-11012</td><td>Anwendung in einer Verdünnung von 1:500</td></tr><tr><td>Isofluran-Anästhetikum</td><td>Attane, Bayer Animal Health, Auckland, Neuseeland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamin HCl Anästhetikum/Analgetikum</td><td>PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, Neuseeland</td><td></td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Laryngoskop (Veterinärmedizin)</td><td>KaWe Medical, Dänemark</td><td></td><td>Miller C-Klinge, Größe 2</td></tr><tr><td>Nadeln&nbsp;</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Neuseeland</td><td>302025</td><td>BD Injektionsnadeln oder ähnliche</td></tr><tr><td>nichtsteroidale entzündungshemmende</td><td>Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, Neuseeland</td><td>49402/008</td><td>Handelsname: Metacam 20 (20 mg/mL Meloxicam)</td></tr><tr><td>Nicht gezahnte Pinzette</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Neuseeland</td><td>AB864/16</td><td>Oder ähnliches&nbsp;</td></tr>Nicht <tr><td>gezahntes Blutstillungsmittel</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Neuseeland</td><td>AA150/12</td><td>Oder ähnliches&nbsp;</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Thermo Fisher Scientific, Christchurch, Neuseeland</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoff (medizinisch)</td><td>BOC Gas, Christchurch, Neuseeland</td><td></td><td>D2-Flasche, Gascode 180</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Christchurch, Neuseeland</td><td>10010023</td><td>Sterile, gefilterte</td></tr><tr><td>Povidon-Jod-Lösung</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Neuseeland</td><td>005835</td><td>Handelsname: Betadin (10 % Povidon-Jod)</td></tr><tr><td>Saures Kaninchen-Anti-Kuh-Gliafibrilläres Protein (GFAP)</td><td>Dako, Glostrup, Dänemark</td><td>Z0334</td><td>Verwendung in einer Verdünnung von 1:2.500</td></tr><tr><td>Selbstkomplementäres Adeno-assoziiertes Virus Serotyp 9, das den Chicken Beta Action (CBh)-Promotor und Codon-optimiertes Schaf CLN5</td> enthält <td>University of North Carolina Vector Core, NC, USA.</td><td>scAAV9/CBh-oCLN5opt</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid 0,9% IV-Lösung</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Neuseeland</td><td>AHB1322</td><td>Handelsname: Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Subkutane Antibiotika</td><td>Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, Neuseeland</td><td></td><td>Handelsname: Duplocillin LA (150.000 I.E./ml Procain-Penicillin und 115.000 I.E./ml Benzathin-Penicillin)</td></tr><tr><td>Chirurgische, scharfe, stumpfe, gebogene Schere&nbsp;</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Neuseeland</td><td>SSSHBLC130</td><td></td></tr><tr><td>Terumo Spritze Luer Lock</td><td>Amtech Medical Ltd, Whanganui, Neuseeland</td><td>SH159/SH160</td><td>Sterile Spritzen; 10 mL zur Herstellung von Induktionsmedikamenten, 20 mL zur Herstellung von Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Virkon Desinfektionspulver EBOS</td><td>Group Ltd, Christchurch, NZ</td><td>28461115</td><td></td></tr></tbody></table>

intravitreale injektionen in das schafauge

Intravitreal Injections in the Ovine Eye

Es gibt mehrere Methoden für die Abgabe von Therapeutika an die Netzhaut, einschließlich intravitrealer (IVT), subretinaler, suprachoroidaler, periokularer oder topischer Verabreichung. IVT Medikamentenabgabe beinhaltet eine Injektion in den Glaskörper des Auges, eine gallertartige Substanz, die die hintere Augenkammer füllt und die Form der Augenkugel beibehält. Obwohl der IVT-Weg weniger spezifisch ausgerichtet ist als die subretinale Abgabe, ist er viel weniger invasiv und wird häufig in klinischen Umgebungen für eine Reihe von Augenerkrankungen eingesetzt. 
Wir haben zuvor die Wirksamkeit der intravitrealen Verabreichung eines Adeno-assoziierten Virus (AAV)-vermittelten Gentherapieprodukts (AAV9) nachgewiesen. CLN5) bei Schafen mit einer natürlich vorkommenden CLN5-Form der neuronalen Ceroid-Lipofuszinose (NCL). Betroffene Schafe erhielten eine IVT-Gentherapie auf einem Auge, wobei das andere unbehandelte Auge als interne Kontrolle diente. Die Netzhautstruktur und -funktion blieb im behandelten Auge bis zu 15 Monate nach der Behandlung erhalten, während das unbehandelte Auge während der postmortalen Untersuchung eine zunehmend abnehmende Funktion und eine schwere Atrophie zeigte. Basierend auf den Schafstudien wurde das Gentherapieprodukt CLN5 im September 2021 von der US-amerikanischen Food and Drug Administration als Kandidat für ein neues Prüfpräparat (IND) zugelassen. Dieser Artikel beschreibt das chirurgische Protokoll für die IVT-Verabreichung eines therapeutischen viralen Vektors an das Schafauge.

Die Wirksamkeit der IVT-Verabreichung eines CLN5-Gentherapievektors bei der Abschwächung von Netzhautdysfunktion und Degeneration bei Schafen mit CLN5 NCL wurde bereits von dieser Forschungsgruppe15 nachgewiesen. Die betroffenen Schafe erhielten eine einmalige 100 μL IVT-Injektion von CLN5, verpackt in einem AAV-Serotyp 9 (AAV9) Vektor (AAV9). CLN5) in ein Auge, wobei das kontralaterale Auge als unbehandelte innere Kontrolle dient. Das Sehvermögen wurde monatlich vom Injektionsalter (3 Monate) bis...

Intravitreale Injektionen wurden im Schafauge mit dem Ziel durchgeführt, eine viral vermittelte Gentherapie an die Netzhaut zu verabreichen.

Intravitreale Injektionen in das Schafauge

There are several methods for the delivery of therapeutic agents to the retina, including intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periocular, or ...

Intravitreale Injektionen können verwendet werden, um Therapeutika an die Netzhaut abzugeben. Ein Protokoll für intravitreale Injektionen in das Schafauge, als Modell des menschlichen Auges, wird hier vorgestellt. Intravitreale Injektionen sind viel weniger invasiv als andere Augeninjektionen.Intravitreale Injektionen können erfolgreich verwendet werden, um ein Gentherapieprodukt zu verabreichen und Netzhautdegeneration bei Schafen mit natürlich vorkommenden neuronalen Ceroid-Lipofuszinosen zu behandeln. Sobald das Schaf betäubt ist, beginnen Sie mit der aseptischen Desinfektion des zu injizierenden Auges, indem Sie es mit einer 20-Milliliter-Spritze mit 1 bis 5% Povidon-Jodlösung spülen. Positionieren Sie dann einen sterilen, fenestrierten chirurgischen Vorhang über dem Auge.Befestigen Sie ein Augenspekulum an den Augenlidern, um das Auge offen zu halten. Fassen Sie die bulbäre Bindehaut auf dem dorsalen lateralen Aspekt des Auges mit einer Pinzette und drehen Sie die Augenkugel ventromedial. Führen Sie die Nadel etwa sieben Millimeter hinter der Sklera auf der lateralen Seite des Auges ein und sind Sie nach hinten abgewinkelt, um die Linse zu vermeiden.Verabreichen Sie die einmalige Injektion von 100 Mikrolitern als Bolus, so nah wie möglich an der Netzhaut, ohne die Netzhautoberfläche zu stören. Spülen Sie das Auge mit etwa 10 bis 15 Milliliter 1 bis 5% Povidon-Jodlösung, gefolgt von 10 Milliliter Kochsalzlösung, bevor Sie das Spekulum entfernen und abdecken. Die Elektroretinographie-Analyse zeigte eine erhaltene Netzhautfunktion im behandelten Auge, während das unbehandelte Auge ähnlich wie bei CLN5-betroffenen Tieren abnahm.Die Netzhauthistologie war im behandelten Auge nahezu normalisiert und hatte eine Gesamtnetzhautdicke, die mit der gesunder Kontrolltiere in der zentralen Netzhaut vergleichbar war. Im Gegensatz dazu war die Dicke der unbehandelten Netzhaut vergleichbar mit CLN5-betroffenen Tieren. Die Expression des sauren Gliafibrillenproteins oder GFAP, ein Marker für Netzhautstress und Astroglia, war bei den behandelten Augen niedriger als bei den unbehandelten Augen, was darauf hindeutet, dass die krankheitsassoziierte Entzündung nach der Behandlung abgeschwächt wurde.Mit der Etablierung eines Protokolls für intravitreale Injektionen in das Schafauge konnten nun Schafe verwendet werden, um die Sicherheit und Wirksamkeit vieler intravitreell verabreichter Therapeutika zu testen.

Research

Forschung

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Medicine

Medizin

Intravitreale Injektion ist eine weit verbreitete Technik in Visual Sciences Forschung für Augenerkrankungen oder als direkte Anwendung der lokalen Behandlung. Dieses Video demonstriert ein Protokoll für die intravitreale Injektion mit einer 1 ml Spritze mit Glaspipette. Nützliche Tipps zum Vermeiden von massiven Blutungen und Linse beschädigen gegeben sind.

Intravitrealen Injektion zur Einrichtung Ocular Krankheiten Modell

Quelle: Park, S. W., et al. Limbaler Zugang-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie im retinalen Pigmentepithel von Mäusen. J. Vis. Exp. (2015)Das Video beschreibt die Methode zur subretinalen Injektion von viralen Vektoren in das retinale Pigmentepithel (RPE) in einem Mausmodell. Es beschreibt das Verfahren von der Anästhesie und der Augenvorbereitung bis hin zur präzisen lentiviralen Vektorverabreichung, um die Genintegration und -expression im RPE sicherzustellen.

Subretinale Injektion von viralen Vektoren in das retinale Pigmentepithel in einem Mausmodell

Kaninchen werden häufig verwendet, um die Pharmakokinetik von intraokularen Arzneimitteln zu untersuchen. Wir beschreiben ein Verfahren zur Durchführung pharmakokinetischer Studien von intraokularen Arzneimitteln mit Kaninchenaugen.

Die Verwendung von Kaninchenaugen in pharmakokinetischen Studien von intraokulare Drugs

Hier zeigen wir einen neuartigen Ansatz zur Verwendung von hochauflösenden spectral-Domain optische Kohärenztomographie (HR-SD-OCT) Lieferung der Gen-Therapie-Agenten in den subretinalen Raum zu unterstützen, beurteilen seine areal Abdeckung und Photorezeptor Vitalität zu charakterisieren.

Höchste Auflösung Maus optische Kohärenztomographie, intraokulare Injektion in die retinale Gentherapie Forschung unterstützen

Retinalen Pigment Epithelzellen könnte als eine Zelle-Ersatz-Therapie für die fortgeschrittene Form der trockene altersbedingte Makuladegeneration dienen. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines großen Augen Modells der geografischen Atrophie und die subretinale Transplantation von menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigment Epithelzellen auf dieses Modell der Krankheit.

Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie

Wir beschreiben hier eine Methode der intravitrealen Injektion und der anschließenden bakteriellen Quantifizierung im Mausmodell der bakteriellen Endophthalmitis. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um die Immunantworten des Wirts und die bakterielle und die Genexpression zu messen.

Intravitreale Injektion und Quantifizierung von Infektionsparametern in einem Mausmodell der bakteriellen Endophthalmitis

In diesem Manuskript wird die subkonjunktivale Injektion als gültige Vektorabgabemethode für Augengewebe bei Mäusen unter Verwendung eines Injektionssystems demonstriert, das aus einer Infusions-/Entnahmespritzenpumpe und einer gasdichten herausnehmbaren Spritze in Verbindung mit Mikroinjektionsnadeln besteht. Dieses Injektionssystem ist auch für andere intraokulare Verabreichungswege anpassbar.

Subkonjunktivale Verabreichung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Kleintiermodellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur intrakameralen Injektion bei Ratten unter Verwendung eines zentralen Hornhautschnitts und eines langen Tunnels in die Vorderkammer. Diese Injektionsmethode minimiert das Risiko einer versehentlichen Gewebeschädigung und verbessert dadurch die Präzision und Reproduzierbarkeit.

Intrakamerale Injektion bei Ratten mit geringem Risiko für Nebenwirkungen

Dieses Protokoll beschreibt eine einzigartige Technik, die einen transkonjunktivalen Ansatz verwendet, um Zugang zum Sehnerv der Ratte für Injektionen zu erhalten.

Transkonjunktivaler Zugang zur Injektion in den Sehnerv der Ratte

Diese Studie stellt eine Methodik für die Verabreichung von Therapeutika in die Netzhaut und die Sehnerven der erwachsenen Ratte vor. Darüber hinaus wird eine einzigartige Gewebeentnahmemethode für eine Top-Down-Entnahme des Sehnervs und der Netzhaut bei einer erwachsenen Ratte eingeführt.

Okuläre therapeutische Verabreichung und fortgeschrittene Gewebeentnahme bei erwachsenen Ratten

Erfahren Sie das Protokoll für intravitreale Injektionen im Schafauge als Modell für humane Augenbehandlungen. Diese Methode ermöglicht die gezielte Gentherapie zur Behandlung von Netzhautdegenerationen.

Intravitreale Injektionen in das Schafauge

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