Name: Experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Erfahren Sie die experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion. Diese Methode ermöglicht die Bewertung der Vektorkompetenz von Aedes aegypti für Arboviren.

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Diese Arbeit wurde durch das Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501) unterstützt.

1. Vorbereitung von Viren und Mücken
<ol><li>Präparation von Viren HINWEIS: Alle Prozesse wurden in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt. Der Grad der verwendeten biologischen Sicherheit sollte durch die Risikobewertung des Erregers und die länder- und regionsspezifischen Vorschriften bestimmt werden. Der Prozess muss in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.<ol><li>1 x 106 C6 /36-Zellen in einen T75-Kulturkolben impfen. Füllen Sie den Kolben mit 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium, das 10 % hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S) enthält. HINWEIS: Das L-15-Medium von Leibovitz (L15) oder das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco können ebenfalls zur Erhaltung von C6/36-Zellen verwendet werden.</li>
		<li>Halten Sie die Zellen über Nacht in 5% CO2 bei 28 °C und entfernen Sie den Zellüberstand am nächsten Tag, wenn die Zellen zu 80%-90% konfluent sind.</li>
		<li>Geben Sie 1 ml Virusverdünnung (Multiplicity of Infection (MOI) = 0,01) in den Kolben und inkubieren Sie die Zellen 1 h lang in 5% CO2 bei 28 °C. Das Ebinur Lake Virus (EBIV)15, ein durch Stechmücken übertragenes Orturbunyavirus, wurde als Modellvirus für dieses Protokoll verwendet.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen 3x mit 5 ml PBS. Füllen Sie den Kolben mit 15 ml neuem RPMI-Medium mit 2 % FBS. Halten Sie den Kolben in 5% CO2 bei 28 °C.</li>
		<li>Sammeln Sie den überstehenden Virus, wenn der erforderliche Virustiter erreicht ist (nach fast 5 Tagen, je nach verwendetem Virus). Für EBIV lag dieser Titerwert bei 107 plaquebildenden Einheiten (PFU)/ml. Verpacken Sie sie in einzelne 2-ml-Aufbewahrungsröhrchen mit Schraubverschluss und lagern Sie die Röhrchen mit 0,5-1 ml Virus bei -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestimmung des Virustiters HINWEIS: Bestimmen Sie den Virustiter durch die Plaque-Assays16. BHK-21 wurde verwendet, um den viralen Titer von EBIV zu bestimmen, aufgrund der offensichtlichen zytopathischen Wirkung (CPE), die in infizierten Zellen beobachtet wurde.<ol><li>Beimpfen Sie 1 x 105 BHK-21-Zellen in jede Vertiefung der 24-Well-Platten. Füllen Sie jede Vertiefung mit 1 ml DMEM-Medium, das 10 % FBS und 1 % P/S enthält. Halten Sie die Zellen über Nacht in 5 % CO2 bei 37 °C.</li>
		<li>Machen Sie sechs (10-6) aufeinanderfolgende 10-fache Verdünnungen des virushaltigen Überstands mit frischem DMEM-Medium, das 10 % FBS und 1 % P/S enthält.</li>
		<li>Geben Sie 100 μl Virusverdünnungsmittel in jede Vertiefung von 24-Well-Platten, die die Monoschicht BHK-21 enthalten. Das Virusverdünnungsmittel wird nach 1 h Inkubationszeit in 5 % CO2 bei 37 °C verworfen. Geben Sie 500 μl DMEM mit 1,5 % Methylcellulose in jede Vertiefung.</li>
		<li>Kulturzellen in 5% CO2 bei 37 °C für 48 h (das scheinbare CPE wurde nach 48 h für EBIV gefunden). Fixieren Sie die Zellen über Nacht mit 750 μl 3,7% Formaldehyd.</li>
		<li>Färben Sie sie mit 200 μl 2% Kristallviolett für 15 min. Zählen Sie die Anzahl der Plaques, um den Virustiter zu berechnen.</li>
	</ol></li>
	<li>Mückenzucht im Labor HINWEIS: Rückwärtige Mücken in einem Labor der Eindämmungsstufe 1 (ACL-1) für Arthropoden.<ol><li>Für die Zubereitung des entchlorten Wassers füllen Sie einen 20-Liter-Eimer mit Leitungswasser und lassen Sie ihn 7-8 Tage ohne Licht stehen. Decken Sie den Deckel nicht ab.</li>
		<li>Halten Sie Eier und Larven von Ae. aegypti in einem Moskitoraum unter folgenden Bedingungen: 28 ± 1 °C mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 h und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 75 % ± 5 %.</li>
		<li>Bewahren Sie fast 1.000 Larven nach dem Schlüpfen der Eier in einer flachen Schale (22 cm x 15 cm x 6 cm) mit dechloriertem Wasser auf. Füttern Sie sie mit fast 1/8 Teelöffel Mäusefutterpulver. Frischen Sie das Futter täglich auf und wechseln Sie das Wasser alle 2 Tage.</li>
		<li>Sobald sich die Larven nach 5-7 Tagen verpuppen, verwenden Sie eine einmalige Pipette, um die Puppen in einen Plastikbecher (7 oz) zu übertragen, der mit entchlortem Wasser gefüllt ist.</li>
		<li>Geben Sie fünf Becher mit Puppen (ca. 200 pro Tasse) in einen Gitterkäfig (30 cm x 30 cm x 30 cm) und halten Sie die Käfige unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 1.3.2 im Insektenbrutkasten.</li>
		<li>Legen Sie einen winzigen Schwamm mit einer 8%igen (m/w) Glukoselösung auf jeden Gitterkäfig, um erwachsene Mücken zu füttern. Nehmen Sie nach dem Schlüpfen der erwachsenen Tiere die Becher ohne Puppen heraus. Halten Sie die Netzkäfige mit etwa 1.000 erwachsenen Mücken pro Käfig im selben Insektenbrutkasten.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vorbereitung auf orale Infektionen
<ol><li>Bereiten Sie weibliche Mücken auf eine orale Infektion vor. Verwenden Sie die Mückenabsorptionsmaschine, um 5-8 Tage alte Mücken zu sammeln. Betäuben Sie sie bei -20 °C für 1 min und prüfen Sie, ob den Mücken schwindelig ist. Wenn nicht, betäuben Sie sie für eine weitere Minute bei -20 °C.</li>
	<li>Gießen Sie sie schnell in die Plastikbecher (24 oz) mit etwa 200 Mücken (weiblich und männlich) pro Tasse. Decken Sie jede Tasse schnell mit einem gut geschnittenen Moskitonetz ab, gefolgt von einem Deckel mit einem Loch (ca. 6 cm Durchmesser) in der Mitte.</li>
	<li>Lassen Sie die Mücken 24 Stunden vor der oralen Infektion aushungern und bereiten Sie infektiöse Blutmahlzeiten wie folgt zu.</li>
	<li>In einer Biosicherheitswerkbank unter BSL-2-Bedingungen den Virenbestand aus dem -80 °C Gefrierschrank entnehmen und auf Eis auftauen. Verdünnen Sie den Virusbestand auf eine Konzentration von 2 x 106 PFU/ml mit RPMI 1640 Medium, das 10 % FBS und 1 % P/S enthält. Mischen Sie die Virusverdünnung mit einer gleichen Menge defibriertem Pferdeblut. HINWEIS: Die Prozesse wurden in einer Biosicherheitswerkbank in einem ACL-2-Labor durchgeführt.</li>
</ol>3. Führen Sie eine orale Infektion durch
HINWEIS: Alle Schritte wurden in einem ACL-2-Labor durchgeführt. Der Vorgang muss im Handschuhfach durchgeführt werden, um zu verhindern, dass Mücken entkommen.
<ol><li>Führen Sie eine künstliche Fütterung durch, indem Sie das künstliche Mückenfütterungssystem für 1 Stunde verwenden.<ol><li>Schneiden Sie die Kollagenmembranen auf die entsprechende Größe (ca. 5 cm Durchmesser) zu, befestigen Sie sie mit O-Ringen an den Reservoirs und geben Sie dann das Virus-Blut-Gemisch (ca. 3 ml) in die Reservoirs. Verwenden Sie Kunststoffstopfen, um die Behälter abzudichten und Leckagen zu vermeiden. HINWEIS: Diese Schritte wurden in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt.</li>
		<li>Legen Sie die Plastikbecher (24 oz) mit Mücken in das Handschuhfach. Schrauben Sie die versiegelten Behälter auf den FU1 Feeder und setzen Sie einen Behälter auf eine Tasse, dann schalten Sie das Netzteil ein. Füttern Sie die Mücken 1 h lang</li>
	</ol></li>
	<li>Betäuben Sie Mücken mit CO2 für einige Sekunden, bis sie ohnmächtig werden. Kurz gesagt, platzieren Sie die Kohlendioxid-Spritzpistole in der Mitte des Netzes durch das Loch auf dem Becher mit den Mücken, öffnen Sie den Wert und lassen Sie große Mengen Kohlendioxid ausspucken, um Mücken zu betäuben.</li>
	<li>Gießen Sie sie in eine auf Eis gestellte Petrischale und decken Sie den Deckel schnell ab. Wähle die angeschwollenen weiblichen Mücken mit einer Pinzette aus. Zur Identifizierung haben Männchen gefiederte Fühler und Weibchen einfache Fühler. Übertragen Sie sie in neue Plastikbecher mit 50 weiblichen Mücken pro Becher. HINWEIS: Die angeschwollenen weiblichen Mücken wurden ausgewählt, um die Konsistenz zu erhalten, da die Futtermenge den Virusgehalt beeinflusst.</li>
	<li>Wickeln Sie den Becher mit einem geschnittenen Moskitonetz ein und decken Sie ihn dann mit einem Deckel mit einem Loch in der Mitte ab. Schneiden Sie den Biskuit in ein kleines Stück und legen Sie ihn auf die Tasse.</li>
	<li>Geben Sie 8%ige Glukoselösung mit einer Einwegpipette aus Kunststoff auf den Schwamm. Bewahren Sie die Becher mit weiblichen Mücken 10 Tage lang im Inkubator bei 27 °C und 80 % Luftfeuchtigkeit auf. Ersetzen Sie alle 72 Stunden einen neuen glukosegesättigten Schwamm.</li>
</ol>4. Vorbereitung der intrathorakalen Inokulation
<ol><li>Bereiten Sie die Mikroinjektionsnadeln wie folgt vor. Verwenden Sie eine PUL-1000, um Mikroinjektionsnadeln (Abbildung 1A) mit den folgenden Parametern im Nadelzieherprogramm herzustellen: Wärmeindex = 450, Kraft (g) = 110, Abstand (mm) = 1,00 und Verzögerung (s) = 0.</li>
	<li>Schneiden Sie die Spitze einer gezogenen Nadel mit einer Pinzette unter dem Präpariermikroskop bei 16-facher Vergrößerung ab (Abbildung 1B). Machen Sie die Spitze nicht zu groß, da sie sonst den Mücken schaden kann.</li>
	<li>Bereiten Sie weibliche Mücken wie in Schritt 2.1 vor. HINWEIS: Die folgenden Prozesse wurden in einem ACL-2-Labor durchgeführt.</li>
	<li>Bereiten Sie die Verdünnung des infektiösen Virus wie folgt vor:<ol><li>Nehmen Sie den Virenvorrat aus dem -80 °C Gefrierschrank und tauen Sie ihn auf Eis auf. Verdünnen Sie das Virus auf eine 100-nL-Virusverdünnung, die 100-500 PFU-Viren enthält, mit RPMI 1640-Medium, das 10 % FBS und 1 % P/S enthält. Lassen Sie die Virusverdünnung auf Eis.</li>
	</ol></li>
	<li>Füllen Sie die Nadel mit Mineralöl über eine sterile Einwegspritze auf. Setzen Sie die Nadel gemäß den Anweisungen auf der Maschine in den Injektor ein.</li>
	<li>Führen Sie die Nadel in ein Röhrchen ein, das die Verdünnung des infektiösen Virus enthält. Brechen Sie die Nadelspitze nicht ab. Drücken Sie die FILL-Taste , um die Nadel mit Virenlösung zu füllen. Das Endvolumen der Viruslösung in der Nadel beträgt ca. 4,0 μl. Sobald die Nadel mit dem Virus gefüllt ist, achten Sie darauf, sie nicht zu berühren und zu beschädigen. HINWEIS: Die Schritte wurden in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt.</li>
</ol>5. Führen Sie die Virusinjektion unter einem Seziermikroskop durch
HINWEIS: Alle Schritte wurden in einem ACL-2-Labor durchgeführt.
<ol><li>Betäuben Sie die Mücken bei -20 °C für 1 min. Gießen Sie sie in eine auf Eis gestellte Petrischale und decken Sie den Deckel schnell ab.</li>
	<li>Suchen Sie fast 50 weibliche Mücken mit einer Pinzette aus und legen Sie sie auf den Eisteller. Legen Sie die Eisplatte unter den Injektor und führen Sie die Nadel unter dem Präpariermikroskop in die Brusthöhle der Mücke ein (Abbildung 1C).</li>
	<li>Stellen Sie das Injektionsvolumen auf 100 nL und die Rate auf 50 nL/s ein. Drücken Sie die INJECT-Taste , um die Virenlösung in die Mücke fließen zu lassen. Bei erfolgreicher Injektion wölbt sich der Bauch leicht.</li>
	<li>Geben Sie die infizierte Mücke in einen neuen Plastikbecher (24 oz), der auf Eis gestellt wird. Wenn die Anzahl der infizierten Mücken ausreicht, wickeln Sie den Becher mit einem geschnittenen Moskitonetznetz ein und decken Sie ihn dann mit dem Deckel ab.</li>
	<li>Bewahren Sie den Becher mit infektiösen Mücken 10 Tage lang im Inkubator bei 27 °C und 80 % Luftfeuchtigkeit auf. Füttern Sie die Mücken wie in Schritt 3.5.</li>
</ol>6. Verarbeitung der infizierten weiblichen Stechmücken
ANMERKUNG: Von jeder weiblichen Mücke wurden drei verschiedene Gewebe/Organe präpariert: der Darm zur Berechnung der Virusinfektionsrate (VIR), der Kopf zur Berechnung der Virusausbreitungsrate (VDR) und Speichel zur Berechnung der Virusübertragungsrate (VTR). VIR wurde definiert als die Anzahl der Stechmücken mit viruspositiven Eingeweiden. VDR wurde definiert als die Anzahl der Mücken mit viruspositiven Köpfen geteilt durch die Anzahl der Mücken mit viruspositiven Eingeweiden durch 100. Die VTR wurde definiert als die Anzahl der Mücken mit viruspositivem Speichel geteilt durch die Anzahl der Mücken mit viruspositiven Eingeweiden durch 100.
<ol><li>Speichelentnahme der infizierten weiblichen Mücken HINWEIS: Die Prozesse müssen in einem ACL-2-Labor durchgeführt werden.<ol><li>Betäuben Sie die infizierten weiblichen Stechmücken durch Kohlendioxid-Betäubung wie in Schritt 3.2. Gießen Sie sie in eine auf Eis gestellte Petrischale und schließen Sie den Deckel schnell.</li>
		<li>Legen Sie 10 μL Pipettenspitzen, die mit Immersionsöl gefüllt sind, nebeneinander auf den Gummischlamm.</li>
		<li>Suchen Sie weibliche Mücken mit einer Pinzette heraus und legen Sie sie auf einen Eisteller. Entfernen Sie ihre Beine und Flügel mit einer Pinzette. Setzen Sie das Mundwerkzeug einer Mücke auf jede Pipettenspitze.</li>
		<li>Sammeln Sie den Speichel, der von den Mücken in das Öl abgesondert wird, für die nächsten 45-60 Minuten bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Legen Sie die Pipettenspitzen in 1,5-ml-Röhrchen mit 200 μl Virusverdünnungsmedium (RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS und 1 % P/S). Zentrifugieren Sie sie bei 5.000 x g für 5 min bei 4 °C, um Speichel in Röhrchen auszustoßen. Lagern Sie diese Röhrchen bei -80 °C zur späteren Bestimmung der Übertragungsraten.</li>
	</ol></li>
	<li>Sezieren Sie die infizierten weiblichen Mücken HINWEIS: Die Prozesse müssen in einem ACL-2-Labor durchgeführt werden.<ol><li>Verwenden Sie eine Pinzette, um die Köpfe der weiblichen Mücken nach der Speichelsammlung abzuschneiden. Legen Sie jeden Kopf in ein einzelnes Röhrchen mit 200 μl RPMI 1640 Medium.</li>
		<li>Fassen Sie den Brustkorb mit einer Pinzette, dann das vorletzte Segment des Bauches mit einer anderen Pinzette und ziehen Sie es heraus. Der Darm wird herausgezogen. Reinigen Sie den herausgezogenen Darm von verirrtem Gewebe und Organen.</li>
		<li>Waschen Sie den Darm mit PBS und geben Sie jeden Darm in ein einzelnes Röhrchen mit 200 μl RPMI 1640 Medium. Lagern Sie diese Röhrchen bei -80 °C zur anschließenden Bestimmung der Virusinfektionsrate und der Verbreitungsrate.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Datenanalyse
<ol><li>RNA-Extraktion<ol><li>Mahlen Sie das Gewebe mit einer Niedertemperatur-Tissue-Homogenisator-Schleifmaschine, die auf die folgenden Parameter eingestellt ist, in Stücke: Betriebsfrequenz = 60 Hz, Betriebszeit = 15 s, Pausenzeit = 10 s, Zyklen = 2 und Einstelltemperatur = 4,0 °C.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA jeder Probe mit einem automatisierten Nukleinsäure-Extraktionssystem gemäß den Anweisungen des Geräts.</li>
	</ol></li>
	<li>Durchführung der qRT-PCR<ol><li>Verwenden Sie das einstufige RT-PCR-Kit, um die viralen RNA-Kopien mit einem quantitativen PCR-Instrument17 zu quantifizieren. Verwenden Sie die folgenden Primer für den Nachweis des EBIV-S-Segments F: ATGGCATCACCTGGGAAAG und R: TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA. Richten Sie den Reaktionsprozess wie folgt ein: Stufe 1: 42 °C für 5 min, 95 °C für 10 s; Stufe 2: 40 Zyklen bei 95 °C für 5 s und 60 °C für 20 s.</li>
		<li>Bestimmen Sie die niedrigste Virusdosis für die Infektion in den Zellen durch die seriellen 10-fachen Verdünnungen, die auf Zellen inokuliert werden. Verwenden Sie die BHK-21-Zellen, um die niedrigste Virusdosis von EBIV zu bestimmen, wobei Verdünnungen bis 10-7 verwendet werden, wie in Schritt 1.2 beschrieben.</li>
		<li>Berechnen Sie den Ct-Wert der niedrigsten Virusdosis mittels qRT-PCR. Verwenden Sie den Cutoff-Wert für EBIV-positiv mittels qRT-PCR als < 35. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Kopien von EBIV in jeder Stichprobe zu berechnen: y = -4,0312x + 3,384 [x = log (die Kopien von EBIV), y = Ct-Wert, R2 = 0,9905]</li>
		<li>Berechnen Sie die Infektionsrate, die Ausbreitungsrate und die Übertragungsrate wie folgt: Infektionsrate (%) = 100 x (Anzahl der viruspositiven Mückendärme / Anzahl der Stechmücken) Ausbreitungsrate (%) = 100 x (Anzahl der viruspositiven Mückenköpfe / Anzahl der viruspositiven Mückendärme) Übertragungsrate (%) = 100 x (Anzahl der viruspositiven Mückenspeichel / Anzahl der viruspositiven Mückendärme)</li>
		<li>Analysieren Sie die Unterschiede in kontinuierlichen Variablen und Unterschiede in den Infektionsraten, Ausbreitungsraten und Übertragungsraten von Mücken, indem Sie die nicht-parametrische Kruskal-Wallis-Analyse für Mehrfachvergleiche und gegebenenfalls den exakten Test nach Fisher verwenden.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101(2016).</li>
<li>Elizondo-Quiroga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+competence+of+Aedes+aegypti+and+Culex+quinquefasciatus+from+the+metropolitan+area+of+Guadalajara%2C+Jalisco%2C+Mexico+for+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus.</a> Scientific reports. 9 (1), 16955(2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das Ziel dieser Methode war es, eine umfassende Risikobewertung für ein durch Stechmücken übertragenes Virus zu ermöglichen, indem die Vektorkompetenz durch orale Ernährung und intrathorakale Inokulation bewertet wurde.
Bei dem oralen Fütterungsexperiment müssen die angeschwollenen Mücken herausgesucht und in einen neuen Behälter umgepflanzt werden, was ein ernsthaftes Risiko für die Bediener darstellt. Der Grund dafür ist, dass jede Mücke, einschließlich nicht infizierter Mücken, eine Infekti...

Durch Stechmücken übertragene Viren (MBVs), eine heterogene Gruppe von RNA-Viren, können in Mückenvektoren persistieren und sich anschließend auf Wirbeltierwirte ausbreiten1. Die klinisch bedeutsamen MBVs sind hauptsächlich in vier Virusfamilien verteilt, nämlich Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae und Peribunyavividae 2,3. In den letzten Jahrzehnten wurden diese Viren auf der ganzen Welt gemeldet und verursachten Probleme für die öffentliche Gesundheit. Als eines der bekanntesten MBVs hat sich das Dengue-Virus (DENV) in den letzten 20 Jahren in über 100 Ländern zum am weitesten verbreiteten neu auftretenden oder wieder auftretenden Arbovirus entwickelt4. Seit der Entdeckung des Zika-Virus (ZIKV) im Landesinneren haben fast alle tropischen und subtropischen Länder und Territorien des Kontinents ZIKV-Infektionen beim Menschen gemeldet5. Um das Risiko einer Virusübertragung abschätzen zu können, haben sich in den letzten Jahren zahlreiche Studien auf die Vektorkompetenz von Stechmücken für diese Viren konzentriert 6,7. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, durch Vektoren übertragene Krankheiten wirksam zu verhindern und zu kontrollieren.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), eine der am leichtesten zu züchtenden Stechmücken im Labor, ist ein wichtiger Vektor von DENV, ZIKV, Chikungunya-Virus (CHIKV) und Gelbfiebervirus (YFV)8. Lange Zeit kam Ae. aegypti nur auf dem afrikanischen Kontinent und in Südostasien vor, hat aber in den letzten Jahren fast alle Kontinente besiedelt9. Darüber hinaus hat die weltweite Häufigkeit von Ae. aegypti kontinuierlich zugenommen, mit einem geschätzten Anstieg von 20 % bis zum Ende des Jahrhunderts10. Von 2004 bis 2009 gab es in China einen deutlichen Anstieg der Ae. aegypti-Vektorkompetenz für DENV aufgrund höherer Tagestemperaturen11. Der Status von Ae. aegypti als pathogener Vektor ist in China deutlich gestiegen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, ist es daher notwendig, die Vektorkompetenz von Ae. aegypti zur Übertragung von Viren zu untersuchen.
Als hämatophager Gliederfüßer durchbohrt die weibliche Stechmücke die Haut eines Wirbeltierwirts und ernährt sich vom Blut. Stechmücken erwerben gelegentlich Viren von virusinfizierten Wirten und übertragen die Viren dann auf einen neuen Wirt. Um die Vektorkompetenz zu bestimmen, werden Stechmücken daher über ein Fütterungssystem in der Laborumgebung mit einem künstlichen Blutmehl gefüttert, das Arboviren enthält12. Einzelne Stechmücken werden einige Tage nach der Infektion in Köpfe, Körper und Speichelsekrete getrennt. Zur Messung der Virusinfektion, -verbreitung und -übertragungsraten wurden Virustiter mittels quantitativer Reverse-Transkriptions-PCR (qRT-PCR) oder Plaque-Assay nachgewiesen. Allerdings entwickeln nicht alle Mücken Mitteldarminfektionen und die Fähigkeit, ein Virus nach der Blutfütterung auf den nächsten Wirt zu übertragen. Es ist mit den physiologischen Barrieren der Mücken verbunden, die das Eindringen von Krankheitserregern in den Körper verhindern und eine wichtige Rolle für ihre angeborene Immunität spielen13. Die Mitteldarmbarrieren, insbesondere die Mitteldarm-Infektionsbarriere (MIB) und die Mitteldarm-Escape-Barriere (MEB), beeinflussen, ob das Virus den Vektor systemisch infizieren kann und mit welcher Effizienz es sich ausbreitet. Es behindert die Analyse der Infektion anderer Gewebe, wie z. B. Speicheldrüsen, die ebenfalls eine Speicheldrüseninfektion aufweisen, und Fluchtbarrieren13,14. Um die Infektion von Mitteldärmen und Speicheldrüsen im Vektor besser charakterisieren zu können, wird hier ein detailliertes Protokoll für die orale Ernährung und intrathorakale Inokulation von Arboviren bei Ae. aegypti vorgestellt. Dieses Protokoll könnte auf zusätzliche Arbovirusinfektionen in einer Vielzahl von Mückenvektoren angewendet werden, wie z. B. die DENV- und ZIKV-Infektion bei Aedes spp., und könnte sich als praktikables Verfahren erweisen.

<table><tbody><tr><td>Aedes aegypti&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Rockefeller-Stamm</td></tr><tr><td>Automatisiertes Nukleinsäure-Extraktionssystem&nbsp;</td><td>NanoMagBio</td><td>S-48</td><td></td></tr><tr><td>BHK-21 Zellen</td><td>Nationales Virusressourcenzentrum, Wuhan Institut für Virologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eimer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C6/36 Zellen&nbsp;</td><td>Nationales Virus-Ressourcenzentrum, Wuhan Institut für Virologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kohlendioxid-Spritzpistole&nbsp;</td><td>wuhan Yihong</td><td>YHDFPCO2</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugalmaschine</td><td>Himac&nbsp;</td><td>CF16RN</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch-Echtzeit-PCR-Nachweissystem&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96 Touch</td><td></td></tr><tr><td>Ebinur Lake Virus</td><td></td><td></td><td>Cu20-XJ Isolierung</td></tr><tr><td>Formaldehyd&nbsp;</td><td>Wuhan Baiqiandu</td><td>B0003</td><td></td></tr><tr><td>Handschuhfach&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Hushi</td><td>10010518</td><td></td></tr><tr><td>Immersionsöl&nbsp;</td><td>Cargille</td><td>16908-1</td><td></td></tr><tr><td>Insekteninkubator</td><td>Memmert</td><td>HPP750T7</td><td></td></tr><tr><td>Niedertemperatur-Gewebehomogenisator-Schleifmaschine &nbsp;</td><td>Servicebio</td><td>KZ-III-F</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Virus Genome Extraction Kit</td><td>NanoMagBio</td><td>NMG0966-16</td><td></td></tr><tr><td>Netzkäfige (30 x 30 x 30 cm)</td><td>Huayu</td><td>HY-35</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Calbiochem</td><td>17851</td><td></td></tr><tr><td>Futterpulver für Mäuse&nbsp;</td><td>BESSN</td><td>BS018</td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektrodenabzieher</td><td>WPI</td><td>PUL-1000</td><td>PUL-1000&nbsp; ist ein mikroprozessorgesteuerter horizontaler Abzieher zur Herstellung von Mikropipetten oder Mikroelektroden aus Glas, der für intrazelluläre Aufzeichnungen, Patch-Clamp-Studien, Mikroperfusion oder Mikroinjektion verwendet wird.</td></tr><tr><td>Moskitonetz-Maschen&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoject III Programmierbarer Nanoliter-Injektor</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>One Step TB Grün PrimeScript PLUS RT-PCR Kit&nbsp;</td><td>Takara</td><td>RR096A</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>151140-122</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikbecher (7 oz) &</td><td>Hubei Duoanduo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikbecher (24 oz) &nbsp;</td><td>Anhui shangji</td><td>PET32-Tub-1</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Tropfer</td><td>aus Kunststoff Biosharp</td><td>BS-XG-O3L-NS</td><td></td></tr><tr><td>Kühlschrank (-80 &deg; C)</td><td>sanyo</td><td>MDF-U54V</td><td></td></tr><tr><td>Ersatz Glaskapillaren</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>RPMI mittel 1640&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>Aufbewahrungsröhrchen mit Schraubverschluss (2 mL) biofil</td><td></td><td>&nbsp; </td><td></td>FCT010005</tr><tr><td>Flache Gerichte&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schwamm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriles defibrilliertes Pferdeblut</td><td>Wuhan Purity Biotechnology</td><td>CDHXB413</td><td></td></tr><tr><td>T75 Kulturflasche</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Das künstliche Mückenfütterungssystem&nbsp;</td><td>Hemotek</td><td>Hemotek PS6</td><td></td></tr><tr><td>Das Präpariermikroskop&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>&nbsp; stemi508</td><td></td></tr><tr><td>Die Eisplatten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Die Mückenabsorptionsmaschine&nbsp;</td><td>Ningbo Bangning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Die Pipettenspitzen&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>TF</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Dumont</td><td>0203-5-PO</td><td></td></tr></tbody></table>

experimentelle virusinfektion bei adulten stechmücken durch orale fütterung und mikroinjektion

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Durch Stechmücken übertragene Viren (MBVs), die infektiöse Krankheitserreger für Wirbeltiere sind, werden von vielen Mückenarten verbreitet und stellen eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Nach der Aufnahme müssen die Viren die Mitteldarmbarriere der Mücken überwinden, um die Hämolymphe zu erreichen, von wo aus sie sich möglicherweise auf die Speicheldrüsen ausbreiten können. Wenn eine Mücke sticht, werden diese Viren auf neue Wirbeltierwirte übertragen. In ähnlicher Weise kann die Mücke verschiedene Viren aufnehmen. In der Regel kann nur ein winziger Teil der Viren über den Darm in die Speicheldrüsen gelangen. Die Übertragungseffizienz dieser Viren auf die Drüsen wird durch die beiden physikalischen Barrieren beeinflusst, die bei verschiedenen Mückenarten zu finden sind: Mitteldarmbarrieren und Speicheldrüsenbarrieren. Dieses Protokoll stellt eine Methode zum Virusnachweis in Speicheldrüsen von Aedes aegypti nach oraler Nahrungsaufnahme und intrathorakaler Injektionsinfektion dar. Darüber hinaus kann die Feststellung, ob der Darm und/oder die Speicheldrüsen die Virusausbreitung behindern, bei der Risikobewertung von MBVs helfen, die von Aedes aegypti übertragen werden.

Um die EBIV-Verteilung in den infizierten Stechmücken mittels künstlicher Blutfütterung (der virale Endtiter betrug 6,4 x 106 PFU/ml) und intrathorakaler Injektion (die Virusdosis betrug 340 PFU) zu untersuchen, wurden virale RNAs in Speichel, Kopf und Darm der Mücken 10 Tage nach der Infektion (dpi) bestimmt.
Bei Ae. aegypti war der Virustiter von EBIV in den Eingeweiden, Köpfen und im Speichel der intrathorakal inokulierten weiblichen Stechmücken viel höher als d...

Diese Methodik, die orale Ernährung und intrathorakale Injektionsinfektionen umfasste, konnte den Einfluss von Mitteldarm- und/oder Speicheldrüsenbarrieren auf die Arbovirusinfektion effektiv bewerten.

Experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Dieses Protokoll kann feststellen, ob der Darm und die Schilddrüsen die Ausbreitung des Virus verhindern, und kann bei der Risikobewertung von durch Mücken übertragenen Viren helfen, die von Aedes aegypti übertragen werden. Unser Protokoll umfasste zwei Infektionsmethoden, die orale Ernährung und die intrathorakale Injektion, die die Vektorkompetenz des Arbovirus effektiv beurteilen konnten. Dieses Protokoll könnte auf zusätzliche Arbovirusinfektionen in einer Vielzahl von Mückenvektoren, wie z. B. Dengue-Virus und Zika-Virusinfektion in Aedes, angewendet werden und könnte sich als praktikables Verfahren erweisen.Fei Wang, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren. Um eine künstliche Ernährung mit dem künstlichen Mückenfütterungssystem durchzuführen, schneiden Sie die Kollagenmembranen auf die entsprechende Größe zu und befestigen Sie sie mit den O-Ringen an den Reservoirs. Geben Sie drei Milliliter des Virus-Blut-Gemisches in die Reservoirs und verschließen Sie die Reservoirs mit Plastikstopfen, um Leckagen zu vermeiden.Legen Sie die Plastikbecher mit Mücken in das Handschuhfach. Schrauben Sie die versiegelten Behälter in den FU1-Feeder und

experimental-viral-infection-adult-mosquitoes-oral-feeding

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Methoden für den Einsatz Alphavirus transduzierenden Systeme fluoreszierenden Reporter in vitro und in der Erwachsenenbildung Mücken Ausdruck beschrieben werden. Diese Technik kann an jede Protein von Interesse anstelle oder zusätzlich zu einem Reporter zu äußern.

Alphavirus transduzierenden System: Werkzeuge für die Visualisierung Infektion in Mosquito Vektoren

Quelle: Liu, X. et al. Ein bakterielles orales Fütterungsverfahren mit antibiotikabehandelten Mücken. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt die Erschöpfung der natürlichen Darmmikrobiota bei Mücken mit einer antibiotikahaltigen Saccharoselösung. Darauf folgt eine kontrollierte Rekolonisierung mit einer bakteriellen Suspension, die über ein Membranfütterungssystem geliefert wird, um eine definierte Bakterienpopulation im Mückendarm zu etablieren.

Etablierung einer definierten Darmbakterienpopulation bei erwachsenen Mücken

In diesem Video beschreiben wir ein Verfahren zur Durchführung einer Nanoinjektion eines einzelsträngigen RNA-Virus mit positivem Sinn in erwachsene männliche Drosophila-Fliegen und untersuchen anschließend die antiviralen Reaktionen, die aufgrund der Infektion ausgelöst wurden. Die Polymerase-Kettenreaktionsanalyse identifiziert die Hochregulierung spezifischer Gene in den infizierten Fliegen, die auf die Aktivierung von Immunantwortwegen hinweisen, einschließlich RNA-Interferenz und...

Intrathorakale virale Nano-Injektion zur Untersuchung von Wirt-Virus-Interaktionen bei erwachsenen Fliegen

Wir beschreiben ein Mausmodell der experimentellen zerebralen Malaria und zeigen, wie entzündliche und mikrovaskuläre Pathologien in vivo mit Hilfe der Magnetresonanztomographie verfolgt werden können.

In vivo Verfolgung von Ödementwicklung und mikrovaskulärer Pathologie in einem Modell der experimentellen zerebralen Malaria mit Magnetresonanztomographie

Wir berichten mit einer künstlichen intronischen kleine RNA Ausdruck Strategie, um eine mangelfreie rekombinante Aedes Aegypti Densovirus (AaeDV) in Vivo -Delivery-System zu entwickeln. Eine detaillierte Anleitung für den Bau, die Verpackung und die Quantitative Analyse der rAaeDV Vektoren sowie für Larven Infektion wird beschrieben.

Verwendung von einem rekombinanten Moskito Densovirus als gen Lieferung Vektor für die funktionelle Analyse von Genen in Mückenlarven

Für die effiziente Steuerung der Moskito Virusübertragung zu tragen ist die Kenntnis der Vektor Potential der jeweiligen Mücken von besonderem Interesse. Wir beschreiben erzwungene Speichelfluss als Methode zur vektorkompetenz von Aedes Albopictus und drei verschiedenen Culex Taxa für die Übertragung der Zika-Virus zu analysieren.

Gezwungen Speichelfluss als Methode zur Vektorkompetenz von Stechmücken Analyse

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikroinjektion Methodik, die wir standardisiert und für mehrere Jahre verwendet, um bestimmte Mengen von Nukleinsäuren liefern direkt an die Hämolymphe von Mücken und Stubenfliegen. Dieses Protokoll führt zu minimalen Injektion Sterblichkeit und ermöglicht Dosismessungen korreliert der Fruchtbarkeit.

Reproduzierbare DsRNA Mikroinjektion und Eiablage Bioassay in Mücken und Stubenfliegen

Das vorgestellte Protokoll kann die Vektorkompetenz von Aedes aegypti-Mückenpopulationen für ein bestimmtes Virus, wie Zika, in einer Containment-Umgebung bestimmen.

Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus

Dieser Artikel stellt ein Protokoll vor, um die Wirkung einzelner Mückendarmbakterien zu untersuchen, einschließlich Isolierung und Identifizierung von Mücken-Mittelgut-anbaufähigen Mikroben, Antibiotika-Erschöpfung von Mückendarmbakterien und Wiedereinführung einer bestimmten Bakterienart.

Ein bakterieller oraler Fütterungstest mit antibiotikabehandelten Moskitos

Das Ziel dieses Protokolls ist es, tierische und künstliche Blutmahlzeiten an Aedes aegypti Mücken durch einen künstlichen Membran-Feeder zu liefern und das Volumen der aufgenommenen Mahlzeit genau zu quantifizieren.

Fütterung und Quantifizierung von Tierblut und künstlichen Mahlzeiten in Aedes aegypti Mosquitoes

Die orale Verabreichung von dsRNA, die von Bakterien produziert wird, eine Verabreichungsmethode für RNA-Interferenz (RNAi), die routinemäßig bei Caenorhabditis elegans angewendet wird, wurde hier erfolgreich auf erwachsene Moskitos angewendet. Unsere Methode ermöglicht robuste Studien zur Umkehrgenetik und übertragungsblockierende Vektorstudien ohne den Einsatz von Injektionen.

Effektive orale RNA-Interferenz (RNAi) Verabreichung an erwachsene Anopheles gambiae-Mücken

Erfahren Sie die experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion. Diese Methode ermöglicht die Bewertung der Vektorkompetenz von Aedes aegypti für Arboviren.

Experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion

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