Name: Messung von Proteinumsatzraten in seneszenten und nicht teilenden kultivierten Zellen mit metabolischer Markierung und Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Proteinumsatzraten in seneszenten Zellen mit pulsiertem SILAC und Massenspektrometrie messen. Diese Methode ermöglicht hochdurchsatzfähige Analysen zur Untersuchung von Proteostase und Zellalterung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) und dem Intramural Research Program (IRP) des National Institute on Aging (NIA) unterstützt. NB wurde von Longevity Impetus Grants und dem Office of Dietary Supplements (ODS) Scholars Program unterstützt. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.

Die Autoren haben keine Offenlegungen.

pSILAC ist eine leistungsstarke Technik, die die globale Quantifizierung von Proteinumsatzraten über mehrere zelluläre Bedingungen hinweg ermöglicht. Dieses Papier beschreibt die Verwendung von pSILAC zum Vergleich der globalen Proteinhalbwertszeiten zwischen seneszenten und ruhenden Zellen, einschließlich Anweisungen für die Herstellung von seneszenten und ruhenden Zellen, die SILAC-Markierung und -Ernte und schließlich die Analyse mittels DDA-Massenspektrometrie. Zusätzlich wird ein zweistufiger Test zur Validierung des Seneszenz-Phänotyps unter Verwendung der SA-βGal- und RT-qPCR-Analyse eines Panels von mRNAs, die für Seneszenz-assoziierte Proteine kodieren, beschrieben. Neben der Validierung der Seneszenz mit den beiden beschriebenen Ansätzen kann eine dritte Validierung der Seneszenz nach einer massenspektrometrietischen Analyse durchgeführt werden, indem nach Veränderungen bekannter Seneszenzmarker zwischen seneszenten und ruhenden Zellen auf proteomischer Ebene gesucht wird. Seneszenz-assoziierte Proteine, von denen erwartet wird, dass sie erhöht sind, umfassen unter anderem p16, p21 und BCL2, die an anderer Stelle beschriebenwerden 44,45. In dem oben beschriebenen Protokoll wurde ionisierende Strahlung für die Induktion von Seneszenz und Serumhunger für ruhende Zellen verwendet. Für die Induktion der Seneszenz stehen mehrere Optionen zur Verfügung und es gibt eine erhebliche Heterogenität unter ihnen41,42,46. Derzeit gibt es keine seneszente Methode, die als die "physiologischste" angesehen wird, so dass die Wahl des seneszenten Induktors weitgehend auf dem Kontext des Experiments basiert. Es wird jedoch empfohlen, Experimente mit dem Ziel, ein allgemeines Phänomen über die Seneszenz zu bestimmen, mindestens zwei verschiedene seneszente Induktoren zu verwenden. Die Diskussion der Bandbreite der Seneszenzparadigmen würde den Rahmen dieses Papiers sprengen, aber einige gängige Methoden zur Induktion von Seneszenz umfassen das Auslösen von DNA-Schäden (IR, Doxorubicin, replizierende Erschöpfung), die Expression onkogener Proteine (HRAS, BRAF) und die Störung der Mitochondrienfunktion2.
Neben der Wahl des seneszenten Induktors ist die Wahl der Kontrollzellen eine ebenso wichtige Überlegung. Seneszente Zellen stehen definitionsgemäß unter unbefristetem Wachstumsstillstand, so dass oft ein Vergleich mit anderen wachstumshemmenden Zellen gewählt wird. Für pSILAC sind Zellzyklus-blockierte Zellen im Allgemeinen vorzuziehen, da sie sich nicht replizieren und daher einfacher für Proteinhalbwertszeiten zu verwenden sind47. Da kultivierte Zellen jedoch oft einige sich teilende Zellen behalten, ist es wichtig, dass die Methoden, die zur Induktion des Zellzyklusstillstands verwendet werden, eine möglichst homogene Reaktion erzeugen, um Fehler von Zellen zu minimieren, die sich noch vermehren. Um Proteinabbauraten für zyklische Zellen mit pSILAC zu berechnen, sind zusätzliche Berechnungen erforderlich, um die Rate zu kompensieren, mit der Protein in Tochterzellen verdünnt wird27. Der Stillstand des ruhenden Wachstums selbst ist jedoch nicht ohne Komplikationen. Es gibt zwei allgemeine Methoden für den Zellzyklus-Arrest: Serumentzug und Kontakthemmung48. Nicht alle Zellen können durch Kontakthemmung zur Ruhe gebracht werden, obwohl gezeigt wurde, dass einige Fibroblasten nach mehreren Tagen der Kultivierung Ruhe zeigen49. Diese Methode verwendete Serumentzug, da sie häufiger für Vergleiche von seneszenten Zellen verwendet wird, obwohl sie erfordert, dass die seneszente Zelle für genaue Vergleiche ähnlich serumberaubt ist. Serum aktiviert den mTOR-Komplex, und somit hat Serumentzug neben dem Zellzyklus-Arrest50 mehrere nachgelagerte Effekte auf die Zelle. Insbesondere wurde gezeigt, dass seneszente Zellen bei Serumentzug oder mTOR-Hemmung eine reduzierte SASP aufweisen51,52.
Ein weiterer wichtiger Punkt, der in pSILAC zu berücksichtigen ist, ist, wie viele Zeitpunkte getestet werden sollen. Dieses Protokoll sammelte Zellen zu einem einzigen Zeitpunkt (3 Tage leichte oder schwere Markierung), was die resultierende Analyse erheblich vereinfacht. Die Wahl des Zeitpunkts sollte auf dem Ziel des Experiments basieren. Für die globale Analyse wird erwartet, dass 3 Tage eine Mehrheit der Proteine einfangen, obwohl Halbwertszeiten für kurzlebige Proteine, die innerhalb von 3 Tagen vollständig umschlagen (das gesamte Lichtsignal geht verloren), zu diesem Zeitpunkt nicht gemessen werden können. Umgekehrt sind langlebige Proteine mit sehr wenig Umsatz in 3 Tagen ebenfalls schwer zu quantifizieren und scheinen oft extrem große Halbwertszeiten (in der Größenordnung von Wochen) zu haben, die typischerweise nur eine Folge einer sehr geringen starken Signalakkumulation sind. Aufgrund der nichtlinearen Beziehung im Verhältnis von schweren und leichten Peptidsignalen zum Prozentsatz des neu synthetisierten Proteins zu kürzeren und längeren Zeitpunkten könnte die Quantifizierung von Halbwertszeiten durch Hinzufügen zusätzlicher Markierungszeitpunkte verbessert werden. Für relative Vergleiche zwischen zwei Zellzuständen, wie in diesem Protokoll, kann eine ungefähre Halbwertszeit ausreichen, aber zusätzliche Zeitpunkte können verwendet werden, um die quantitative Genauigkeit zu verbessern.
Dieses Protokoll beschreibt, wie eine ungezielte DDA-basierte Analyse des Proteinumsatzes durchgeführt wird. Die Proteinumsatzberechnungen können jedoch im Allgemeinen auf jedes Akquisitionsschema angewendet werden, das in der Lage ist, die relative Häufigkeit von schweren und leichten Peptidpaaren abzuleiten. So können beispielsweise auch MS2-basierte Methoden wie die datenunabhängige Erfassung (DIA/SWATH) zur Berechnung von Fluktuationsraten erfolgreich angewendetwerden 53. Darüber hinaus können andere als die in diesem Protokoll beschriebenen Instrumentierungs- und Softwarepipelines verwendet werden, um DDA-Analysen, Proteinidentifikationen und Proteinquantifizierungen durchzuführen. Bei der Verwendung von Proteinquantifizierungssoftwareplattformen wie Skyline zur Extraktion von Peptid-Peak-Bereichen ist es ratsam, extrahierte Ionenchromatogramme im Dokumentenarbeitsbereich manuell zu inspizieren, fälschlicherweise integrierte Peaks und nicht-quantitative Peaks zu identifizieren und das Dokument entsprechend zu kuratieren. Eine umfangreiche Sammlung von Tutorials ist online für Skyline (skyline.ms) verfügbar.
pSILAC stellt aufgrund des überlegenen Multiplexings (Proteomabdeckung) und Durchsatzes eine der idealsten Methoden zur globalen Quantifizierung von Proteinhalbwertszeiten in kultivierten Zellen dar. Während pSILAC keine direkten Synthese- oder Abbauraten liefert, da die Änderung des leichten und schweren Signals auf einen Zusammenfluss von Faktoren zurückzuführen ist, ist pSILAC sehr nützlich für Vergleiche zwischen Bedingungen und verschiedenen Zelltypen. Low-Throughput-Methoden fallen oft in zwei Arten: 1) Behandlung von Zellen mit Cycloheximid, um die Proteinsynthese und -ernte in Zeitabständen nach der Zugabe zu blockieren, um den Zerfall zu überwachen, oder 2) Behandlung von Zellen mit einem Inhibitor des Proteinzerfalls und der Ernte in Zeitabständen nach der Zugabe, um die Ansammlung von Protein zu überwachen und so Proteinzerfallsraten abzuleiten. Die Einschränkung beider Methoden besteht darin, dass solche Behandlungen unweigerlich zu erheblichen Veränderungen der zellulären Physiologie führen werden. Im Gegensatz dazu erfordert pSILAC keinen wesentlichen Eingriff und hat theoretisch keine nachweisbaren Auswirkungen auf die zelluläre Physiologie, da sich isotopische Aminosäuren nur um ein einziges Neutron von ihren nicht-isotopischen Gegenstücken unterscheiden. Somit stellt die hier beschriebene Methode für pSILAC ein einfaches Protokoll zur globalen Messung der physiologischesten Proteinhalbwertszeiten in sich nicht teilenden Zellen dar.
Veränderungen des Proteinumsatzes stehen in engem Zusammenhang mit dem Altern, altersbedingten Erkrankungen, Neurodegeneration und Langlebigkeit54,55. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Abfrage dieser Beziehungen durch die Verwendung einer stabilen Isotopenmarkierung von Aminosäuren in Zellkultur, um Proteinumsatzraten in Seneszenzzellen zu messen. Es gibt jedoch zahlreiche analoge Methoden, um Studien im Zusammenhang mit dem Altern und der Neurodegeneration in vivo in ganzen Organismen wie Mäusen durchzuführen. Tatsächlich haben diese Studien die Bedeutung der Messung von Proteinumsatzraten im Zusammenhang mit altersbedingten Krankheitenhervorgehoben 56,57,58,59.
In dieser Studie zeichneten sich ribosomale Proteine und Proteine, die sich im endoplasmatischen Retikulum befinden, als zwei Kategorien von Proteinen mit verringerter bzw. erhöhter Halbwertszeit in seneszenten Zellen aus. Während eine weitere Analyse der Steady-State-Spiegel für endgültige Schlussfolgerungen erforderlich ist, deuten diese Ergebnisse weiter darauf hin, dass seneszente Zellen die Translation durch verringerte Halbwertszeiten ribosomaler Proteine einzigartig regulieren können. In Zukunft wird die Anwendung stabiler Isotopenmarkierungsansätze zur Untersuchung der Beziehung zwischen zellulärer Seneszenz und Neurodegeneration in vivo in Mausmodellen eine vielversprechende Erweiterung des in diesem Protokoll beschriebenen Isotopenmarkierungsansatzes sein.

Seneszenz wurde zuerst als ein Zustand des unbestimmten Wachstumsstillstands identifiziert, der von kultivierten Primärzellen nach Erreichen der replizierten Erschöpfung gezeigtwurde 1. Seitdem hat sich gezeigt, dass Seneszenz als Reaktion auf zahlreiche zelluläre Beleidigungen entstehen kann, darunter genotoxische, mitochondriale und onkogene Belastungen, unter anderem2. Während die Seneszenz mehrere physiologisch wichtige Rollen spielt, wie z.B. Tumorsuppression und Wundheilung, ist die Ansammlung von seneszenten Zellen während des Alterns mit einer Vielzahl schädlicher Auswirkungen auf die Gesundheitverbunden 3, einschließlich mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen 4,5,6. Zelluläre Seneszenz tritt in mehreren Gehirnzelltypen auf, einschließlich Neuronen 7,8,9,10, Astrozyten 11, Mikroglia 12 und Oligodendrozytenvorläufer 13, und trägt zu Neurodegeneration und kognitiver Dysfunktion bei. Amyloid-Beta-Oligomere, eines der Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit 14, beschleunigen nachweislich die neuronale Seneszenz13,15,16. Eine erhöhte Prävalenz von seneszenten Zellen wurde auch mit der Parkinson-Krankheit 17 in Verbindung gebracht, insbesondere aufgrund von Umweltstressoren11,18. Wichtig ist, dass die selektive Eliminierung seneszenter Zellen in präklinischen Modellen die Lebensdauer verlängert und eine Vielzahl von altersbedingten Krankheitenmildert 3,5,12 und kognitive Defiziteverbessert 8,11,12,13. Seneszente Zellen haben sich damit zu vielversprechenden therapeutischen Angriffspunkten für die Behandlung vieler altersbedingter Erkrankungen entwickelt.
Ein Großteil der schädlichen Wirkung seneszenter Zellen wird durch den seneszenzassoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) verursacht, eine komplexe Mischung aus bioaktiven Molekülen, die von seneszenten Zellen abgesondert werden und lokale Entzündungen, Angiogenese, Zerstörung der extrazellulären Matrix und Ausbreitung der Seneszenz im umgebenden Gewebe verursachen können19,20,21 . Das SASP stellt auch ein interessantes biologisches Phänomen der Seneszenz dar, da es während eines Zellzyklusstillstands einen erheblichen transkriptionellen und translationalen Aufwand erfordert. Tatsächlich wurde gezeigt, dass seneszente Zellen eine Abnahme der Ribosom-Biogenese22,23,24 aufweisen, die die Proteinsynthese reduzieren sollte. Stattdessen übersetzen seneszente Zellen einige Proteine, insbesondere SASP-Faktoren, robust und beeinflussen den Stoffwechsel des umgebenden Gewebes25. Daher besteht ein erhebliches Interesse daran, zu verstehen, wie seneszente Zellen, die sich einem permanenten Zellzyklusstillstand unterziehen, weiterhin die Proteinhomöostase aufrechterhalten und gleichzeitig SASP-Faktoren und andere ausgewählte Proteine robust exprimieren.
Diese Methode beschreibt, wie Massenspektrometrie und pulsstabile Isotopenmarkierung durch Aminosäuren in Zellkultur (pSILAC) eingesetzt werden können, um die Halbwertszeiten von Proteinen in seneszenten Zellen auf einer proteomweiten Skala global zu messen. In traditionellem SILAC werden kultivierte Zellen vollständig metabolisch mit schweren und leichten nicht-radioaktiven Isotopen von Aminosäuren markiert, um die Proteinhäufigkeit nachzubilden. Diese Methode wurde bereits angewendet, um Abundanzänderungen im SASP von kultivierten Fibroblasten umfassend und quantitativ zu bewerten26. In pSILAC werden Zellen in ähnlicher Weise metabolisch mit einem Puls aus schwerem Isotop markiert, der der Vormarkierung mit leichtem Isotop folgt, und dann in einem oder mehreren Zeitintervallen geerntet. Die Einbauraten schwerer Isotope in Bezug auf bereits existierende leichte Isotope werden dann verwendet, um die relativen Proteinumsatzraten zu berechnen. Im Allgemeinen werden Isotope von Arginin und Lysin verwendet, weil Trypsin an diesen Rückständen spaltet; Daher enthalten alle Peptide aus der Standardverdauung möglicherweise das Heavy-Label. Paare von Peptiden, die sich nur durch das Vorhandensein oder Fehlen von schwerem Lysin oder Arginin unterscheiden, sind chemisch identisch und können durch ein Massenspektrometer differenziert und quantifiziert werden. Nach der massenspektrometrieren Analyse können Peptide als neu synthetisiert oder bereits vorhanden identifiziert werden, basierend auf dem Vorhandensein oder Fehlen der Isotopenmarkierung in den resultierenden Peptididentifikationen. Proteinumsatzraten können dann bestimmt werden, indem das Verhältnis von schweren (13 C-15 N) über leichten (12 C-14N) Peptiden für ein gegebenes Protein an kinetische Modelle für exponentielles Wachstum oder Zerfallangepasst wird 27,28. pSILAC wurde in mehreren Vergleichen von Proteinumsatzraten 29,30,31,32 eingesetzt und ist derzeit die umfassendste und durchsatzfähigste Methode zur Messung von Proteinhalbwertszeiten.
Dieses Protokoll beschreibt die Präparation seneszenter Zellen parallel zu ähnlich wachstumshemmenden Ruhezellen in Kultur, gefolgt von der metabolischen Markierung mit pSILAC. Die Zellen werden dann geerntet, zu Lysaten homogenisiert und für die massenspektrometrische Erfassung und Analyse verarbeitet. Die aus der Massenspektrometrie gewonnenen Daten werden dann verwendet, um Proteinhalbwertszeiten mit einer vereinfachten quantitativen Methode zu bestimmen, die einen einzigen Zeitpunkt und Halbwertszeiten in einer Tabelle verwendet. Mit diesem Ansatz können Schätzungen der Proteinhalbwertszeiten auf eine umfassende und quantitative Weise gemessen werden, die für ungestörte zelluläre Bedingungen authentischer ist als Protokolle, die Blocker der Proteinsynthese oder des Proteinumsatzes verwenden.

<table><tbody><tr><td>Acetonitril (LC-MS-Qualität)</td><td>Grainger</td><td>AH015</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Millipore-Sigma</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>BCA Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreotol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>12430112</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, zertifiziert, hitzeinaktiviert</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma</td><td>27001</td><td></td></tr><tr><td>Gammacel 40 Exactor</td><td>Best Theratronics</td><td>Cäsium-Bestrahlungsgerät</td><td></td> für Zellen</tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Iodacetamid (IAA)</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td>Lichtempfindliche</td></tr><tr><td>IMR-90 primäre Lungenfibroblasten</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td></td></tr><tr><td>iRT Kit (indizierte Retentionszeit)</td><td>Biognosys</td><td>Ki-3002-2</td><td>Indexierte Retentionszeit Peptidstandards</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>ThermoFisher</td><td>423835000</td><td></td></tr><tr><td>Mascot</td><td>Matrix Science</td><td>Mascot Daemon 2.8</td><td>Proteomic Datenbank-Suchsoftware</td></tr><tr><td>Maxima Reverse Transcritase (200 U/&micro; L)</td><td>ThermoFisher</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Nano LC System</td><td>ThermoFisher</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB Festphasenextraktionskartuschen</td><td>für Wässer</td><td>186000383</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap-Massenspektrometer</td><td>ThermoFisher</td><td>Q Exactive HF Orbitrap</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8,0</td><td>ThermoFisher</td><td>327110025</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A33972</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Random Hexamer Primer</td><td>ThermoFisher</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Seneszenz &beta;-Galactosidase Staining Kit</td><td>Cell Signaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Skyline</td><td>University of Washington</td><td>Skyline-Daily v21.2.1.424</td><td>Kostenlose und quelloffene qantiative Proteomik-Software. Verfügbar für www.skyline.ms</td></tr><tr><td>Sonicator Wasserbad</td><td>Branson</td><td>CPX-952-516R</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagenz</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td>Im Text als Phenol bezeichnet; gefährlich</td></tr><tr><td>TRYPle Express</td><td>ThermoFisher</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (Sequenzierqualität)</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>TURBO Dnase (2U/ uL)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>ThermoFisher</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>Wasser (LC-MS Qualität)</td><td>Grainger</td><td>AH365</td><td></td></tr></tbody></table>

messung von proteinumsatzraten in seneszenten und nicht teilenden kultivierten zellen mit metabolischer markierung und massenspektrometrie

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Immer mehr Beweise haben gezeigt, dass die Ansammlung von seneszenten Zellen im zentralen Nervensystem zu neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson beiträgt. Zelluläre Seneszenz ist ein Zustand des permanenten Zellzyklusstillstands, der typischerweise als Reaktion auf die Exposition gegenüber subletalen Belastungen auftritt. Wie andere sich nicht teilende Zellen bleiben seneszente Zellen jedoch metabolisch aktiv und erfüllen viele Funktionen, die einzigartige transkriptionelle und translationale Anforderungen und weit verbreitete Veränderungen der intrazellulären und sezernierten Proteome erfordern. Zu verstehen, wie sich Proteinsynthese und Zerfallsraten während der Seneszenz ändern, kann die zugrunde liegenden Mechanismen der zellulären Seneszenz beleuchten und potenzielle therapeutische Wege für Krankheiten finden, die durch seneszente Zellen verschlimmert werden. Dieser Beitrag beschreibt eine Methode zur Proteom-skaligen Bewertung von Proteinhalbwertszeiten in nicht teilenden Zellen unter Verwendung der gepulsten stabilen Isotopenmarkierung durch Aminosäuren in Zellkultur (pSILAC) in Kombination mit der Massenspektrometrie. pSILAC beinhaltet die metabolische Markierung von Zellen mit stabilen schweren isotopenhaltigen Versionen von Aminosäuren. In Verbindung mit modernen massenspektrometrie-Ansätzen ermöglicht pSILAC die Messung des Proteinumsatzes von Hunderten oder Tausenden von Proteinen in komplexen Gemischen. Nach der metabolischen Markierung kann die Umsatzdynamik von Proteinen basierend auf der relativen Anreicherung schwerer Isotope in Peptiden, die durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden, bestimmt werden. In diesem Protokoll wird ein Workflow für die Erzeugung von seneszenten Fibroblastenkulturen und ähnlich gestoppten ruhenden Fibroblasten sowie ein vereinfachter pSILAC-Markierungszeitverlauf mit einem einzigen Zeitpunkt beschrieben, der die Abdeckung der erwarteten Proteinumsatzraten maximiert. Darüber hinaus wird eine Pipeline für die Analyse von pSILAC-Massenspektrometriedaten und die benutzerfreundliche Berechnung von Proteinabbauraten mithilfe von Tabellenkalkulationen vorgestellt. Die Anwendung dieses Protokolls kann über seneszente Zellen hinaus auf alle nicht teilenden kultivierten Zellen wie Neuronen ausgedehnt werden.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum globalen Vergleich von Proteinhalbwertszeiten zwischen seneszenten und nicht teilenden, ruhenden Kontrollzellen unter Verwendung von pSILAC und minimalen Zeitpunkten. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von seneszenten und ruhenden Zellen in Kultur, die metabolische Markierung von Zellen mit stabilen Isotopen von Arginin und Lysin über 3 Tage, die Quantifizierung der relativen Häufigkeiten schwerer und leichter Peptidisotope durch Massenspektrometrie und eine einfache und zugängliche Berechnung der Proteinhalbwertszeiten mithilfe von Tabellenkalkulationsformeln (Abbildung 1). Diese Methode ist hochflexibel und kann an zahlreiche Zelltypen und -bedingungen angepasst werden.
Im Rahmen der Generierung seneszenter Zellen für dieses Protokoll werden zwei Methoden der Seneszenzvalidierung verwendet: SA-βGal-positive Zellen, die durch Mikroskopie visualisiert wurden, und erhöhte Mengen an seneszenten Markern, die mittels RT-qPCR-Analyse quantifiziert wurden. Die Messung von seneszenten Markern sollte klare Unterscheidungen zwischen ruhenden und seneszenten Zellen ergeben, damit Vergleiche der beiden Zellpopulationen als gültig angesehen werden können. Für die SA-βGal-Aktivität sollten seneszente Zellen blau erscheinen, während ruhende Kontrollzellen keine oder nur eine sehr geringe Farbe haben (Abbildung 2A). Dieser Assay kann quantifiziert werden, indem die positiven, blau gefärbten Zellen als Prozentsatz der Gesamtzahl der Zellen gezählt und dann die prozentuale Positivitätsrate zwischen Ruhekontroll- und seneszenten Zellen verglichen wird. Es ist wichtig, dass dieses Protokoll gleichzeitig für den Vergleich beider Zellzustände durchgeführt wird; Die SA-βGal-Aktivität hängt vom pH-Wert der Färbelösung ab, so dass die Ergebnisse zwischen den Assays erheblich variieren können und als qualitatives Maß betrachtet werden sollten.
Die RT-qPCR-Analyse seneszenter Marker zeigt in den meisten seneszenten Modellen hohe Konzentrationen der mRNAs, die für SASP-Faktoren (IL6, CXCL8, IL1B) und Zellzyklusinhibitoren (CDKN2A/p16, CDKN1A/p21) kodieren. Obwohl eine gewisse Variation basierend auf Zelltyp, Kulturzustand und seneszentem Induktor 41,42 erwartet wird, zeigen die meisten seneszenten Zellen mehr als fünfmal höhere Konzentrationen von IL6-, CXCL8- und CDKN1A/p21-mRNAs im Vergleich zu ruhenden Kontrollzellen; Umgekehrt sollten die Spiegel von LMNB1- und PCNA-mRNAs, die für Proliferationsmarker kodieren, in seneszenten Zellen im Vergleich zu ruhenden Zellen niedrig oder nicht vorhanden sein (Abbildung 2B). Zusammengenommen reichen ein signifikanter Prozentsatz der SA-βGal-Positivität und die erwartete Expression eines Panels von seneszenzassoziierten mRNA-Markern aus, um die Induktion der Seneszenz in einem Experiment zu bestätigen.
Die Verarbeitung von Proteinproben für die Massenspektrometrie-Analyse besteht aus dem Aufschluss in Lösung (2 Tage) und der Festphasenextraktion (4-6 h). Um eine ungezielte proteomische Analyse durchzuführen, werden die resultierenden Peptide zur LC-MS/MS-Analyse mittels datenabhängiger Erfassung (DDA) eingereicht. Auf Orbitrap-Instrumenten kann eine DDA-Methode im Methodeneditor der Massenspektrometrie-Instrumentensoftware spezifiziert werden. Die in dieser Studie verwendeten Massenspektrometereinstellungen sind in Abbildung 3A dargestellt. Flüssigkeitschromatographie-Einstellungen können auch im Methodeneditor festgelegt werden. Für diese Studie wurde ein linearer 90-minütiger Gradient mit zunehmender organischer Phase (Acetonitril) verwendet (Abbildung 3B). Nach einer erfolgreichen Erfassung sollte der Gesamtionenstrom (TIC) während des linearen Gradientenabschnitts der Methode ein intensives Signal enthalten (Abbildung 3C). Dieses Protokoll beschreibt ein Beispielprotokoll auf einem Orbitrap-Instrument, aber die Berechnung der Proteinhalbwertszeiten kann mit Daten durchgeführt werden, die von jedem Massenspektrometer erhalten wurden, das im DDA-Modus gesammelt wurde, das auf verschiedenen Arten von Instrumenten (z. B. Orbitraps und Time-of-Flight-Instrumenten) und Anbietern verfügbar ist. Die Erfassungseinstellungen sind für den Typ und die Konfiguration des verwendeten Instruments einzigartig, und es wird empfohlen, die von der Massenspektrometrieeinrichtung vorgeschlagenen Einstellungen zu verwenden. Diese Methode ist auch mit Nicht-DDA-Methoden (SRM, PRM, DIA) kompatibel, solange quantitative chromatographische Peakflächen für schwere und leichte Peaks aus den Rohdatendateien extrahiert und in die Tabellenkalkulationsformeln eingegeben werden können.
Rohe Massenspektrometriedateien werden mit einem der vielen verfügbaren proteomischen Datenbank-Suchwerkzeuge durchsucht, um Peptide und Proteine zu identifizieren. Zum Beispiel verwendete diese Studie die Suchmaschine Mascot43. Um chromatographische Peakbereiche für die Quantifizierung schwerer und leichter Peptide zu erhalten, werden Datenbanksuchergebnisse in eine proteomische Software importiert, die chromatographische Peakbereiche wie Skyline 39,40 unterstützt. Die Untersuchung der extrahierten Ionenchromatogramme von Peptiden (Abbildung 4) zeigt den relativen Anteil schwerer und leichter Peptidsignale. Ein geringerer Anteil des schweren Peptidsignals im Verhältnis zum leichten Peptidsignal in seneszenten Zellen weist auf eine langsamere Proteinumsatzrate hin (Abbildung 4A), und ein höheres schweres Peptidsignal im Verhältnis zum Licht weist auf eine schnellere Proteinumsatzrate hin (Abbildung 4B). Die unmarkierten Proben sollten wenig oder kein schweres Peptidsignal zeigen. Jedes scheinbar schwere Peptidsignal in den unmarkierten Proben wird als Hintergrundrauschen betrachtet und während der endgültigen Berechnungen subtrahiert. Die Quantifizierung chromatographischer Peakbereiche für leichte und schwere Peptide für alle Behandlungs- und Markierungsbedingungen muss zur anschließenden Berechnung der Proteinumsatzraten und zur statistischen Analyse exportiert werden.
Durch die Verwendung der Einzelzeitpunktanalyse ist die Quantifizierung der Proteinhalbwertszeiten einfach durchzuführen und kann bequem in Tabellenkalkulationen durchgeführt werden. In Tabelle 3 wurden die Halbwertszeiten für 695 Proteine berechnet, die aus der Massenspektrometrie-Analyse identifiziert wurden. Ausgehend von den schweren und leichten Isotopenhäufigkeiten auf Proteinebene für jedes Protein in den Proben (Eingabe für das 1) Rohdatenblatt ) wird dann automatisch ein prozentschweres Isotop (genannt Ratio, R) auf dem Blatt mit dem Titel 2) Verhältnis H | berechnet H + L. Bei diesem Schritt wird das R aus schwer markierten Proben normalisiert, indem das R von unmarkierten Proben subtrahiert wird, um ein endgültiges R für die ruhenden und seneszenten Triplikatoren zu erhalten. Da unmarkierte Proben kein exogen zugesetztes schweres Isotop enthalten sollten, werden sie verwendet, um das Hintergrundsignal zu eliminieren. Aus R wird der kdeg (Fluktuationsrate) nach folgender Formel berechnet:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq01.jpg" style="margin: auto;">
Die Halbwertszeit (H, in Tagen) wird für jedes Protein in den Ruhekontroll- und seneszenten Triplikaten (Blatt mit dem Titel 3) Halbwertszeit (Tage)) mit der folgenden Formel bestimmt:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq02.jpg" style="margin: auto;">
Diese Halbwertszeiten werden dann zwischen den ruhenden und seneszenten Triplikaten gemittelt, um eine ruhige und seneszente mittlere Halbwertszeit für jedes Protein sowie einen p-Wert zu erzeugen. Berechnete Halbwertszeiten werden dann nach negativen Werten gefiltert, was auftritt, wenn das schwere Signal von hellmarkierten Zellen (der Hintergrund) größer ist als das schwere Signal von schwer markierten Zellen. Diese Filterung führte zu 707 Proteinen aus 841, die mit gültigen Halbwertszeiten für die hier vorgestellten Ergebnisse identifiziert wurden.
Die Halbwertszeit wird dann als logarithmisches2-Verhältnis von seneszenten über ruhenden Kontrollzellen (log2FC) angegeben und in einem Vulkandiagramm aufgetragen (Abbildung 5). Wenn man sich beispielsweise das 5) Analyseblatt ansieht, kann man sehen, dass das Gerinnungs-II-Thrombinrezeptor-Protein (F2R) eine Halbwertszeit in ruhenden Zellen von 0,51 Tagen (Spalte B) und eine Halbwertszeit in seneszenten Zellen von 1,07 Tagen (Spalte C) aufweist, die einen log2FC von ~ 1,06 (Spalte D) mit einem p-Wert von 0,001 ergab.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig01.jpg"> Abbildung 1: Diagramm des pSILAC-Workflows für seneszente und ruhende Kontrollzellen. Humane IMR-90-Fibroblasten wurden verwendet, um ruhende (niedrigserum) oder seneszente (IR) Zellkulturen für den Vergleich von Proteinhalbwertszeiten vorzubereiten. Die Zellen wurden dann 3 Tage lang mit SILAC Light oder SILAC Heavy media mit Isotopen-Arginin und Lysin markiert. Lysate wurden aus Zellen extrahiert, verdaut, entsalzt und mittels Massenspektrometrie analysiert. Schwere und leichte Peptidisotopenpeaks entsprechen neu synthetisierten bzw. bereits bestehenden Peptiden. Halbwertszeiten wurden mit einer Gleichung für den exponentiellen Zerfall berechnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig02.jpg"> Abbildung 2: Validierung seneszenter Phänotypen mittels SA-βGal- und RT-qPCR-Analysen . (A) Seneszente und ruhende Zellen werden zum Zeitpunkt der Ernte zu einer 6-Well-Platte umplattiert und mit dem SA-βGal-Färbekit für SA-βGal gefärbt. Die blaue Farbe im Zellkörper ist positiv für die Seneszenz. Die Bilder werden im Hellfeld mit Farbe bei 10-facher Vergrößerung, Größenmarkierung in Rot aufgenommen. (B) RT-qPCR-Analyse, die seneszente Zellen (rot) und zyklische Zellen (grau) aus einem nicht verwandten Experiment vergleicht. Ein Anstieg der Spiegel der CDKN1A/p21-, CXCL8- und IL6-mRNAs weist auf eine Seneszenz hin, ebenso wie die Abnahme der LMNB1-mRNA-Spiegel . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig03.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative Methoden für datenabhängige Akquisitionsscans (DDA) und Flüssigkeitschromatographiegradienten von pSILAC-Kulturen auf dem Q-Exactive HF Orbitrap-Massenspektrometer. (A) Empfohlene Instrumenteneinstellungen in der Gerätesoftware zur datenabhängigen Analyse von Ganzzelllysaten aus einem pSILAC-Experiment. (B) Beispieleinstellung der Flussgradientenmethode der Flüssigkeitschromatographie. Peptide werden über einen linearen 90-minütigen Gradienten von 5% bis 35% Puffer B (0,2% Ameisensäure und 99,8% Acetonitril) eluiert, gefolgt von einer 10-minütigen Wäsche mit 80% Puffer B und 25 min Gleichgewicht mit 5% Puffer B. (C) Ein repräsentatives Gesamtionenchromatogramm (TIC) einer massenspektrometrieartigen Aufnahme von IMR-90-Fibroblastenpeptiden, die mit den angegebenen Einstellungen aufgenommen wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig04.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative extrahierte Ionenchromatogramme von Peptiden mit verändertem Umsatz während der Seneszenz . (A) Chromatographische Peakbereiche des Peptids FQMTQEVVCDECPNVK++ aus dem Protein DnaJ homolog Unterfamilie B Member 11 (DNAJB11) in seneszenten und nicht-seneszenten Zellen. Nach 3 Tagen SILAC bauen seneszente Zellen im Vergleich zu ruhenden (nicht seneszenten) Zellen weniger schwere Isotope in dieses Peptid ein, was durch eine Verringerung der Peakfläche des schweren isotopenhaltigen Peptids (blau) relativ zum leichten Peptid (rot) angezeigt wird, was darauf hindeutet, dass dieses Peptid den Umsatz in seneszenten Zellen reduziert hat. (B) Chromatographische Peakbereiche des Peptids VQAQVIQETIVPK++ aus dem Protein Spleißfaktor 3a Untereinheit 1 (SF3A1) in seneszenten und nicht-seneszenten Zellen. Nach 3 Tagen SILAC bauen seneszente Zellen einen höheren Anteil an schweren Isotopen in dieses Peptid ein als ruhende (nicht seneszente) Zellen, was durch eine Verringerung der Peakfläche des schweren isotopenhaltigen Peptids (blau) relativ zum leichten Peptid (rot) angezeigt wird, was darauf hindeutet, dass dieses Peptid den Umsatz in seneszenten Zellen erhöht hat. Die unmarkierten (Tag 0) Bedingungen zeigen wie erwartet keine Aufnahme von schweren Isotopen für beide Peptide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig05.jpg"> Abbildung 5: Vergleich der Proteinhalbwertszeiten in seneszenten und ruhenden Zellen, ermittelt aus der pSILAC-Markierung. (A) Vulkandiagramm mit dem logarithmischen2-Verhältnis von seneszent / Kontrolle (Ruhe) für jedes der 695 identifizierten Proteine; In diesem Experiment enthielten Light and Heavy-Markierungsmedien keine Glukose und kein Phenolrot. (B) Tabellen mit den Top 10 Proteinen mit den meisten erhöhten oder verringerten Halbwertszeiten in ruhenden Zellen im Vergleich zu seneszenten Zellen (links bzw. rechts). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Tabelle 1: In diesem Protokoll verwendete Medien und Puffer <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%201-63835R1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2: In diesem Protokoll verwendete RT-qPCR-Primer <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%202-63835R1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 3: SILAC-Analyse-Arbeitsbuch zur Berechnung von Protein-Halbwertszeiten, Faltenänderungen und t-Tests. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%203%20v3.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt den Workflow für die metabolische Markierung von seneszenten und nicht teilenden Zellen mit gepulstem SILAC, ungezielter Massenspektrometrie-Analyse und einer optimierten Berechnung der Proteinhalbwertszeiten.

Messung von Proteinumsatzraten in seneszenten und nicht teilenden kultivierten Zellen mit metabolischer Markierung und Massenspektrometrie

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

Wie Zellen die Proteinhomöostase aufrechterhalten, ist im Zusammenhang mit zellulärem Stress und Seneszenz nicht gut verstanden. In diesem Protokoll bieten wir eine einfache und genaue Möglichkeit, den Proteinumsatz zu berechnen, der eine Schlüsselkomponente der Proteinhomöostase in lebenden Zellen ist. Pulse SILAC gibt einem Experimentator die Möglichkeit, den Proteinumsatz für einzelne Proteine und das gesamte Proteom in einer Hochdurchsatzweise zu messen, die auch für biologische Systeme authentischer ist als andere Methoden.Die Prinzipien dieser Methode können auf jedes System angewendet werden, das metabolisch markiert werden kann, einschließlich ganzer Organismen. Diese Methode kann auch zu Erkenntnissen über zelluläre Seneszenz, Alterung und neurodegenerative Erkrankungen führen. Die massenspektrometrische Analyse ist hochempfindlich gegenüber bestimmten chemischen Verunreinigungen wie Reinigungsmitteln.Verwenden Sie während dieses gesamten Vorgangs Reagenzien der LC-MS-Klasse, um eine qualitativ hochwertige Datenerfassung zu gewährleisten. Um mit der metabolischen Markierung der Zellen zu beginnen, ersetzen Sie die Medien für jeweils drei Platten von seneszenten und ruhenden Zellen durch 30 Milliliter SILAC Light-Medien. Ersetzen Sie das Medium für drei seneszente und drei ruhende Platten separat durch 30 Milliliter SILAC Heavy.Züchten Sie die Zellen drei Tage lang, ohne das Medium zu wechseln. Um die Zellen von den Kulturplatten zu lösen, fügen Sie jeder Platte fünf Milliliter vorgewärmtes Trypsin-Reagenz hinzu und inkubieren Sie die Platten fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Später suspendieren Sie die abgelösten Zellen in fünf Millilitern des gleichen Mediums, das für die Kultur verwendet wird, auf ein Gesamtvolumen von 10 Millilitern.Als nächstes übertragen Sie die Zellen auf Eis und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal G bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie das Pellet zweimal gewaschen haben, drehen Sie die Zellen erneut nach unten und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in 150 Mikroliter frisch zubereitetem achtmolaren Harnstoff und 50-Millimolar Ammoniumbicarbonat-Lysepuffer wieder suspendieren. Mischen Sie den Inhalt des Rohres, indem Sie es nach oben und unten pipettieren.Aliquot 50 Mikrogramm der Proteinprobe in ein neues Röhrchen und bringt Proben auf gleiche Volumina mit Lysepuffer. Dann Dithiothreitol zu einer Endkonzentration von 20-Millimolar in das Röhrchen geben und die Probe bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten mit Schütteln inkubieren. Lassen Sie die Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie Jodoacetamid zu einer Endkonzentration von 40 Millimolar hinzufügen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.Dann verdünnen Sie die Probe mit einem 50-Millimollar-Ammoniumbicarbonat-Puffer auf unter einmolaren Harnstoff. Fügen Sie ein Mikrogramm Trypsin für 50 Mikrogramm Startprotein oder bei 1: 50 Trypsin zu Protein-Verhältnis zur Probe hinzu. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln, um Proteine zu Peptiden zu verdauen.Am nächsten Tag fügen Sie Ameisensäure zu 1% Volumen der Probe hinzu, um die Proteinverdauung zu stoppen. Für die Probenreinigung legen Sie eine Festphasen-Extraktionspatrone auf einen Vakuumverteiler, wobei Sie für jede Probe eine Extraktionspatrone gemäß den Richtlinien des Herstellers verwenden. Nach der Extraktion die Peptidproben aus dem Vakuumverteiler entnehmen und in einem Vakuumkonzentrator vollständig trocknen.Die Trocknung dauert etwa drei Stunden. Für die Massenspektrometrie oder MS-Analyse resuspendiert die Peptidprobe in einer Konzentration von 400 Nanogramm pro Mikroliter in einem 0,2% Ameisensäurepuffer. Um die Peptide aufzulösen, mischen Sie die Probe fünf Minuten lang.Dann beschallen Sie fünf Minuten lang in einem Wasserbad-Ultraschallgerät. Dann zentrifugieren Sie die Probe, um die unlöslichen Materialien zu pelletieren und die Peptidüberstände in MS-Fläschchen zu übertragen. Reichen Sie die Proben für die proteomische Analyse mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie oder LC-MS-MS ein.Verwenden Sie die Einstellungen, die für die ungezielte Analyse durch die Massenspektrometrie empfohlen werden. Laden Sie die Proben auf eine analytische Säule mit einer Durchflussrate von 400 Nanolitern pro Minute, um die Peptide über einen 90-minütigen linearen Gradienten mit einer Mischung aus organischen und anorganischen Lösungsmitteln zu eluieren, wobei das organische Lösungsmittel zwischen 5 und 35 % liegt. Erfassen Sie Massenspektrometriedaten im datenabhängigen Modus mit einem kontinuierlichen Zyklus von MS1-Survey-Scans, gefolgt von 20 datenabhängigen MS2-Scans mit HCD-Fragmentierung. Quantifizieren Sie die Peptid-Peak-Bereiche für schwere und leichte Peptide im Proteome Quantitation-Softwaretool.Exportieren Sie dann die schweren und leichten Peptid-Peak-Bereiche. Für die Berechnung der Protein-Halbwertszeiten öffnen Sie die SILAC-Analyse-Arbeitsmappe zum ersten Blatt mit dem Namen Raw Data und fügen Sie die UniProt-IDs, Gennamen, schweren und leichten Peakbereiche in die angegebenen Spalten ein. Öffnen Sie dann das vierte Blatt mit dem Namen Analyse, und entfernen Sie die Zeilen, in denen die Spalten G und H angeben, dass sich das Beispiel außerhalb des Bereichs befindet, und behalten Sie Zeilen, die innerhalb des Bereichs lesen.Die seneszenten Phänotypen wurden mit Hilfe der seneszenzassoziierten Beta-Galactosidase-Aktivität und der RT-qPCR-Analyse validiert. Für die Beta-Galactosidase-Aktivität erschienen die seneszenten Zellen blau, während die ruhenden Kontrollzellen keine oder nur eine minimale Farbe hatten. In der RT-qPCR-Analyse zeigten die seneszenten Zellen höhere Interleukin-6-, CXCL8- und CDKN1A-P21-mRNAs im Vergleich zu den ruhenden Zellen.Umgekehrt war der Gehalt an Lamin B1, das für den Proliferationsmarker kodiert, in den seneszenten Zellen niedrig oder fehlte. Die extrahierten Ionenchromatogramme von Peptiden zeigten den relativen Anteil schwerer und leichter Peptidsignale. Ein geringerer Anteil schwerer Peptidsignale im Vergleich zu leicht seneszenten Zellen deutete auf eine langsamere Proteinumsatzrate hin, und ein höheres schweres Peptidsignal im Vergleich zu Licht zeigte eine schnellere Proteinumsatzrate an.Die unmarkierten Proben zeigten wenig oder kein schweres Peptidsignal. Die Halbwertszeiten für 695 Proteine, die aus der massenspektrometrischen Analyse identifiziert wurden, wurden berechnet. Die Halbwertszeit wird als Log-Zwei-Verhältnis von seneszenten über ruhenden Zellen berichtet und in einem Vulkandiagramm aufgetragen.Nach der Berechnung der Proteinumschlagsraten in seneszenten Zellen kann die nachgelagerte Analyse mögliche biologische Signalwege aufdecken, die durch Proteostasemechanismen reguliert werden. Pulse SILAC ebnete den Weg für Forscher, die Proteindynamik mit beispielloser Granularität und Durchsatz zu untersuchen, so dass wir Veränderungen in der Proteinhomöostase in vielen einzelnen Proteinen untersuchen konnten.

measurement-protein-turnover-rates-senescent-non-dividing-cultured

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Video zeigt einen auf Durchflusszytometrie basierenden Assay zur Quantifizierung von therapieinduzierten seneszenten Krebszellen mit dualen Seneszenzmarkern. Der Nachweis und die Quantifizierung seneszenter Zellen erfolgt unter Verwendung eines β-Galactosidase-Substrats. Das Substrat wird durch aktive lysosomale β-Galactosidase innerhalb der seneszenten Zellen gespalten, wodurch ein fluoreszierendes Produkt entsteht, das in Verbindung mit autofluoreszierenden Lipofuszin-Granulaten die...

Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierung von therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Ob Seneszenz verhindert oder fördert Tumorentstehung bleibt umstritten. Da Chemotherapeutika Krebszellen veranlassen können, altern, Studium Seneszenz ist für Vorschläge für neue Therapien unerlässlich. Allerdings stellt die Standard-und im Großen und Ganzen verwendet β-Galactosidase Assay große Nachteile. Wir schlagen hier eine schnelle und empfindliche Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Quantifizierung Seneszenz.

Eine empfindliche Methode zur Quantifizierung Seneszente Cancer Cells

Hier beschreiben wir ein robustes Verfahren für die Fraktionierung von pflanzlichen Plasmamembranen in Waschmittel-und Reinigungsmittel beständig löslichen Membranen auf der Basis einer Mischung von unmarkierten und in vivo vollständig 15 N markierten Arabidopsis thaliana Zellkulturen. Das Verfahren ist für die vergleichende Proteom-Studien angewendet, um Signalprozesse zu verstehen.

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fahrwerk Zellkulturen

Dieses Protokoll beschreibt, wie absolute Quantifizierungsassays von Zielproteinen in komplexen biologischen Proben unter Verwendung ausgewählter Reaktionsüberwachung durchgeführt werden. Es wurde verwendet, um Proteine des Chemotaxis-Signalwegs von Mausmakrophagen genau zu quantifizieren. Die Auswahl des Zielpeptids, die Assay-Entwicklung sowie qualitative und quantitative Assays werden ausführlich beschrieben.

Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung

Dieser Bericht beschreibt Protokolle zur Messung der Abbauraten von fehlgefalteten Proteinen entweder durch Western Blot oder fluoreszenzbasierte Assays. Die Methoden können für die Analyse anderer fehlgefalteter Proteine und für das Hochdurchsatz-Screening eingesetzt werden.

Assays für den Abbau fehlgefalteter Proteine ​​in Zellen

Metabolic Kompetenz von in vitro - Systemen ist eine wesentliche Voraussetzung für die Biotransformation und Disposition von Drogen und Giften. In diesem Protokoll beschreiben wir die Anwendung von Referenzstoffwechselsonden Phase I in Zellkulturen des Stoffwechsel zu bewerten.

Massenspektrometrie und luminogenes-basierte Ansätze zur Charakterisierung von Phase I Metabolic Competency von<em&gt; In Vitro</em&gt; Zellkulturen

Zelluläre Seneszenz, der irreversible Zustand der Zellzyklusarrest, kann durch verschiedene Zellspannungen induziert werden. Hier beschreiben wir Protokolle zelluläre Seneszenz und Methoden zu induzieren Marker für Seneszenz zu beurteilen.

Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Bestimmen von Protein in einzelne lebende adhärente Zellen, Halbwertszeiten mit Puls Kennzeichnung und Zeitraffer Fluoreszenz-Bildgebung von Fusionsproteinen SNAP-Tag.

Einzellige Quantifizierung der Protein-Abbauraten von Time-Lapse Fluoreszenzmikroskopie in adhärente Zellkultur

Wir beschreiben unser Protokoll zur Messung biologischer Rhythmen im Proteinkatabolismus über Autophagie und das Proteasom in der Mausleber.

Messung von diurnalen Rhythmen in autophagischen und proteasomalen Flux

Hier wird ein Protokoll zur Überwachung des Abbaus des mit dem photokonvertierbaren Fluorophor Dendra2 verschmolzenen Proteins Huntingtin vorgestellt.

In Vivo Quantifizierung des Proteinumsatzes im Alter C. Elegans mit Photoconvertible Dendra2

Dieser Artikel stellt ein lebendzelliges LysoTracker-Protokoll zur Messung der lysosomalen Remodellierung während der Seneszenz in humanen Fibroblasten von IMR-90 vor.

Lysosomales Profiling mit LysoTracker zur quantitativen Bewertung der zellulären Seneszenz bei humanen Fibroblasten

Erfahren Sie, wie Sie Proteinumsatzraten in seneszenten Zellen mit pulsiertem SILAC und Massenspektrometrie messen. Diese Methode ermöglicht hochdurchsatzfähige Analysen zur Untersuchung von Proteostase und Zellalterung.

Messung von Proteinumsatzraten in seneszenten und nicht teilenden kultivierten Zellen mit metabolischer Markierung und Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal

Messung von Proteinumsatzraten in seneszenten und nicht teilenden kultivierten Zellen mit metabolischer Markierung und Massenspektrometrie

Weitere Videos entdecken