Induktion der Polypenrettung in Korallenkolonien, um individualisierte Mikropropagate für den experimentellen Laboreinsatz zu erhalten

Die Mikrovermehrung von Korallen steckt noch in den Kinderschuhen. Die Optimierung von Protokollen für die Rettung von Polypen ist der Schlüssel, um diese Lücke zu schließen, die es Wissenschaftlern ermöglicht, Polypen als Modelle zur Untersuchung von Korallen in Laborumgebungen zu verwenden. Polyp Bail-out ermöglicht es, mehrere Vermehrungen aus kleinen Korallenfragmenten zu erzeugen.

Polypen können in verschiedenen Experimenten verwendet werden, um beispielsweise mikroskopische Prozesse in Korallen zu beobachten. Korallenriffe sind bedroht. Unser Ziel ist es, dieses replizierbare Modell zu nutzen, um Strategien zu entwickeln, um Korallen effizient und nichtinvasiv vor Bleichung und anderen Umweltbedrohungen zu schützen.

Diese Methode könnte die Untersuchung der Korallenphysiologie, der Mikrobiom-Interaktionen des Wirts und der an der Bleichung beteiligten Mechanismen unterstützen. Solche Erkenntnisse können beispielsweise zur Optimierung von Korallenprobiotika beitragen. Die Verwendung von Meerwasser mit einem ausreichenden Salzgehalt ist der Schlüssel.

Der Salzgehalt muss auf dem Niveau der natürlichen Umgebung der Koralle beginnen und langsam ansteigen, damit der Stress nicht übermäßig schädlich ist. Polypen im richtigen Moment zu sammeln und diejenigen auszuwählen, die am intaktesten sind, ist entscheidend für ihr Überleben. Eine visuelle Demonstration kann entscheidend sein, um diese Hinweise zu verstehen.

Verwenden Sie zunächst diagonale Schneidzangen, um kleine Fragmente aus einer Korallenkolonie zu schneiden, und legen Sie sie dann in kleine Petrischalen mit 12 Millilitern Meerwasser, an die sich die Korallenkolonie gewöhnt hat. Lassen Sie die Platte etwa 24 Stunden bei Umgebungstemperatur offen, damit das Wasser verdunstet und sein Salzgehalt allmählich zunimmt. Wenn die Gewebeverdauung zwischen den Polypen beobachtbar ist, verwenden Sie eine 1-Milliliter-Transferpipette, um einen sanften Fluss in der Nähe des Korallengewebes zu erzeugen.

Der Fluss wird langsam dazu beitragen, die Ablösung von Polypen, die das Gewebe um sie herum bereits aus dem Skelett verdaut haben, zu vervollständigen, dann mit der Pipette langsam das Wasser in der Petrischale mit isosmotischem Wasser auszutauschen. Um Meerwasser mit hohem Salzgehalt herzustellen, nehmen Sie normales Meerwasser und fügen Sie Natriumchlorid zum Meerwasser hinzu, um drei Liter Meerwasser mit hohem Salzgehalt herzustellen, bis der Salzgehalt um 85% ansteigtNachdem Sie kleine Korallenfragmente geschnitten haben, wie zuvor gezeigt, legen Sie sie in einen 10-Liter-Behälter mit drei Litern isosmotischem Meerwasser, das an eine Peristaltikpumpe angeschlossen ist. Füllen Sie diesen Behälter mit drei Litern zuvor vorbereitetem Meerwasser mit hohem Salzgehalt für 24 Stunden mit einer Rate von 126 Millilitern pro Stunde, um den Salzgehalt um etwa 40% zu erhöhenVerwenden Sie eine Pipette, um einen sanften Wasserfluss zu erzeugen, um die Polypen aus dem Skelett zu lösen.

Tauschen Sie langsam das Wasser im Behälter mit isosmotischem Meerwasser aus. Fügen Sie 26,29 Gramm Natriumchlorid, 0,872 Gramm Kaliumchlorid, 2,16 Gramm Magnesiumsulfat, 11,94 Gramm Magnesiumchlorid, 3,42 Gramm Natriumsulfat und 0,26 Gramm Natriumbicarbonat zu einem Liter deionisiertem Wasser hinzu, um kalziumfreies Meerwasser herzustellen, und füllen Sie dann Petrischalen mit diesem kalziumfreien Meerwasser. Nachdem Sie kleine Korallenfragmente geschnitten haben, tauchen Sie sie in kalziumfreies Meerwasser in die Petrischale.

Legen Sie die Schalen drei Stunden lang mit einer Drehzahl von 80 U / min in einen orbitalen Inkubator, dann geben Sie die Fragmente in Petrischalen um, die mit 20% DMEM gefüllt sind, das mit künstlichem Meerwasser von 40 praktischen Salzgehaltseinheiten zubereitet wird und 100 Milligramm pro Liter Ampicillin enthält. Inkubieren Sie die Fragmente bei 26 Grad Celsius und 80 U / min. Tauschen Sie die Medien jeden Tag aus, bis die Gewebeverdauung zwischen Polypen beobachtbar ist und einzelne Polypen beginnen, sich vom Skelett zu lösen, übertragen Sie dann die Polypen in sterilisiertes Meerwasser und inkubieren Sie für eine Stunde.

Sobald die Polypen mit nicht belastendem Salzgehalt in gefiltertes Meerwasser zurückgeführt wurden, wählen Sie die lebensfähigen Polypen aus, indem Sie die Integrität und Bewegung des Gewebes beobachten, die durch den Ziliarfluss unter einem Stereomikroskop verursacht werden. Legen Sie die ausgewählten Polypen in eine Petrischale und bedecken Sie die Petrischale mit einem Planktonnetz von 200 Mikrometern Maschenweite, damit die Polypen nicht von der Schale wegschwimmen. Stellen Sie die Petrischale in ein Aquarium mit geeigneten Bedingungen für die verwendeten Korallenarten.

Um Algenüberwucherung zu verhindern, öffnen Sie die Petrischale mindestens einmal pro Woche, um das Wasser zu erneuern und die Schale zu reinigen. Nachdem Sie die Polypen wie zuvor gezeigt ausgewählt haben, legen Sie sie mit einer Transferpipette in einen 75 Quadratzentimeter großen Oberflächenzellenkolben, der mit 50 Millilitern isosmotischem Meerwasser gefüllt ist, schließen Sie dann den Kolben und geben Sie sie in einen Inkubatorsatz mit 12-Stunden-Lichtzyklen, 26 Grad Celsius und 40 U / min. Wenn der Kolben mit Algen oder Biofilmen gefüllt wird, geben Sie den Inhalt in einen sauberen Kolben.

In dieser Studie wurde das Polypen-Bail-out durch drei verschiedene Methoden induziert. Die Wasserverdunstungsmethode führte innerhalb von 24 Stunden nach der Inkubation zu einem vollständigen Bail-out, und der Salzgehalt stieg nach 24 Stunden von 40 auf 59 praktische Salzgehaltseinheiten. Die Salzwasserversorgungsmethode führte auch zu einer Polypenrettung nach 24 Stunden Inkubation.

Hier stieg der Salzgehalt nach 12 Stunden Inkubation von 40 auf 52 praktische Salzgehaltseinheiten und nach 24 Stunden auf 59 praktische Salzgehaltseinheiten. Die Bail-out-Induktion durch Inkubation in kalziumfreiem Meerwasser war nach drei Stunden Inkubation von Polypen darin abgeschlossen, gefolgt von 20 Stunden Inkubation in den 20%DMEM-Medien, In allen drei Methoden konnten individualisierte Korallenpolypen erzeugt werden. Korallenpolypen, die durch die Verdunstungsmethode erzeugt werden, könnten sechs Wochen überleben, während diejenigen, die durch die Meerwasserversorgungsmethode mit hohem Salzgehalt erzeugt werden, acht Wochen in Petrischalen in Aquarien überleben könnten.

Polypen, die aus der Meerwasserverdampfungsmethode gewonnen wurden, die in Zellkulturflaschen in Inkubatoren aufbewahrt wurden, überlebten bis zu drei Wochen ohne vollständige Dissoziation ihres Gewebes. Beim Ablösen von Polypen vom Skelett ist es wichtig, sanft zu sein. Wenn sie nicht vollständig abgelöst sind, führt das Erzwingen der Ablösung durch starkes Pipettieren von Wasser zu Schäden und niedrigeren Überlebensraten.

Mit diesen Methoden kann die Abrechnung von Polypen induziert werden. Die Polypenbesiedlung kann Fragen zu ihren Verkalkungs- und Wachstumsprozessen beantworten. Nach der Entwicklung der Polypen-Bail-out-Induktion konnten die Forscher die anfängliche Bildung des Korallenskeletts untersuchen und die Korallenbleiche direkt in der Polypenskala visualisieren.