Molekulare und immunologische Techniken in einem gentechnisch veränderten Mausmodell des gastrointestinalen Stromatumors

Unser Protokoll beschreibt die Zucht, Wartung, Dissektion und Probenverarbeitung des einzigen immunkompetenten Mausmodells, GIST, das derzeit verwendet wird. Wir hoffen, dass zukünftige Forscher in der Lage sein werden, dieses Mausmodell zu nutzen, um die translationale Forschung in GIST voranzutreiben. Traditionelle Therapien in GIST beinhalten eine gezielte molekulare Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren.

Dieses Modell ermöglicht es Forschern, Immuntherapien in GIST zu testen. Sterilisieren Sie zunächst alle Instrumente, tragen Sie während des gesamten Eingriffs Handschuhe und pflegen Sie ein steriles Feld. Bereiten Sie den Bereich des Einschnitts mit 70% Ethanol vor.

Machen Sie mit einer Schere einen vertikalen Schnitt in der Mitte von zwei Zentimetern und betreten Sie die Bauchhöhle. Lyse alle intraabdominalen Adhäsionen scharf. Um den drainierenden mesenterialen Lymphknoten zu entfernen, identifizieren Sie den Blinddarm und heben Sie sein Mesenterium überlegen an.

Ungefähr in der Mitte der Basis des Dickdarmmesenteriums identifizieren Sie den mesenterialen Lymphknoten und sezieren Sie ihn scharf. Teilen Sie das Lymphknotengewebe bei Bedarf in Drittel für Proteinisolierung, Histologie und Einzelzellsuspension auf. Legen Sie Lymphknotengewebe in 20 Milliliter RPMI-Medium für Einzelzellsuspensionen und halten Sie es auf Eis.

Der Blinddarm wird bei den Kit558-Mäusen meist durch einen GIST ersetzt. Zur Isolierung von GIST und Blinddarm trennen Sie vorsichtig die ileokolische Verbindung von der Basis des Tumors. Dann teilen Sie den Blinddarm wieder, zwei Zentimeter distal zur Basis des Tumors.

Bei 50 bis 60% der Kit558-Mäuse enthält der Kopf des Tumors eine Kappe aus cecal tissue, die typischerweise seröse Flüssigkeit enthält, aber selten Eiter enthalten kann. Sezieren Sie das Kappengewebe scharf vom Tumorgewebe weg. Teilen Sie das Tumorgewebe und den Blinddarm in Drittel für Proteinisolierung, Histologie und Einzelzellsuspension.

Für Einzelzellsuspensionen legen Sie Tumorgewebe oder Blinddarm in HBSS mit 2% FCS, genug, um die Probe zu bedecken, und halten Sie es auf Eis. Gießen Sie RPMI-Medien mit der Lymphknotenprobe über einen 100-Mikrometer-Filter. Bewegen Sie den Filter auf ein neues 50-Milliliter-Konikum und zerdrücken Sie den Lymphknoten mit dem weichen Ende einer Drei-Milliliter-Kunststoffspritze.

Waschfilter mit 20 Millilitern RPMI-Medien. Zentrifugieren Sie die Proben und aspirieren Sie den Überstand. Schwebe das Pellet in 20 Milliliter Perlenpuffer und gieße es über einen 40-Mikrometer-Filter.

Sammeln Sie das Zellfiltrat. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer. Zentrifugieren Sie die Proben und entsorgen Sie den Überstand.

Dann resuspendieren Sie in Perlenpuffer für die Durchflusszytometrie. Bereiten Sie den Kollagenasepuffer wie im Textmanuskript beschrieben vor. Geben Sie GIST in eine sterile Schale und fügen Sie 2,5 Milliliter Kollagenasepuffer hinzu.

Zerkleinern Sie den Tumor mit einem sterilen Skalpell und einer Schere, bis er sich in feinen Fragmenten befindet. Verwenden Sie eine großkalibrige Pipette, um den Tumor und die Kollagenase in ein 50-Milliliter-Rohr zu aspirieren. Inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten mit 100 Umdrehungen pro Minute und löschen Sie dann die Reaktion mit zwei Millilitern FBS.

Gießen Sie Kollagenase mit GIST-Probe über einen 100-Mikrometer-Filter und zerdrücken Sie den Tumor mit dem weichen Ende einer Drei-Milliliter-Kunststoffspritze und sammeln Sie ihn in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Waschfilter mit 20 Millilitern HBSS. Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 450 RCF fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie dann den Überstand.

Schwebe das Pellet in 20 Milliliter Perlenpuffer und gieße es über einen 40-Mikrometer-Filter Sammeln Sie das Filtrat und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Zentrifugieren und aspirieren Sie den Überstand, dann resuspendieren Sie ihn im Perlenpuffer für die Durchflusszytometrie. Spalten Sie den Blinddarm mit einer Schere in Längsrichtung, um die innere Schleimhaut freizulegen.

Schneiden Sie es in 0,5-Zentimeter-Abschnitte und legen Sie es in ein 50-Milliliter-Rohr mit fünf Millilitern HBSS und 2% FBS. 30 Sekunden lang kräftig schütteln und 20 Sekunden bei 450 RCF zentrifugieren. Verwerfen Sie dann den Überstand.

Fügen Sie fünf bis 20 Milliliter HBSS mit zwei-millimolärem EDTA hinzu. Inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius bei 100 Umdrehungen pro Minute für 15 Minuten. Zentrifugieren und entsorgen Sie den Überstand, dann suspendieren Sie das Pellet in fünf bis 20 Millilitern HBSS.

Schütteln Sie die Mischung 30 Sekunden lang kräftig, zentrifugieren Sie dann bei 450 RCF für 20 Sekunden und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal. Schwebe das Pellet in fünf Milliliter Kollagenasepuffer und inkubiere es dann bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten mit 100 Umdrehungen pro Minute.

Schütteln Sie alle 10 Minuten kräftig und löschen Sie die Reaktion mit zwei Millilitern FBS. Gießen Sie Kollagenase mit Blinddarmprobe über einen 100-Mikrometer-Filter und zerdrücken Sie sie mit dem weichen Ende einer Drei-Milliliter-Kunststoffspritze. Waschen Sie den Filter mit 20 Millilitern HBSS und sammeln Sie das Filtrat.

Zentrieren und verwerfen Sie den Überstand. Schwebe das Pellet in 20 Milliliter Perlenpuffer und gieße es über einen 40-Mikrometer-Filter. Sammeln Sie Filtrat und zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer.

Wiederholen Sie den Zentrifugationsprozess noch einmal und suspendieren Sie das Pellet in einem Perlenpuffer für die Durchflusszytometrie. Die Kit558-Mäuse hatten aufgrund eines fortschreitenden Darmverschlusses eine durchschnittliche Lebensdauer von acht Monaten. Tumore der Kit558-Mäuse exprimierten kanonische Marker von GIST, einschließlich der Tyrosinkinase KIT, des Transmembrankanals Dog1 und des Transkriptionsfaktors ETV1.

Tumore wurden auf Veränderungen im KIT-Signalweg untersucht, wie die nachgeschalteten Marker ERK und AKT oder die Immunmikroumgebung, die das menschliche GIST genau nachahmt. MRT oder CT wurde verwendet, um das Tumorvolumen als genaue Messung der Tumorreaktion zu verfolgen. Die Sezierung des Tumors weg von der ileokolischen Verbindung und weg von der Cecal-Kappe ist wichtig, um das wahre Tumorgewicht und die Immun- und Molekularanalyse zu erfassen.

Innerhalb von GIST hat dieses Modell die Untersuchung der Tumormikroumgebung sowie Immuntherapien ermöglicht.