Name: Molekulare und immunologische Techniken in einem gentechnisch veränderten Mausmodell des gastrointestinalen Stromatumors (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Zucht, Präparation und Prozessierung des immunokompetenten Kit V558Δ/+ Mausmodells für GIST-Forschung. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung von Immuntherapien bei gastrointestinalen Stromatumoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

KitV558Δ/+ Mäuse wurden gentechnisch verändert und von Dr. Peter Besmer10 geteilt. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01 CA102613 und T32 CA251063 unterstützt.

Alle Mäuse wurden unter pathogenfreien Bedingungen an der University of Pennsylvania nach NIH-Richtlinien und mit Genehmigung der University of Pennsylvania IAUC untergebracht. Euthanasie wurde nach den Standardarbeitsanweisungen der University of Pennsylvania Laboratory Animal Resources durchgeführt.
1. KitV558Δ/+ Mauszucht
<ol><li>Überqueren Sie die KitV558Δ/+ Mäuse mehr als 10 Mal auf einem C57BL/6J-Hintergrund mit C57BL/6J-Mäusen. Züchten Sie dazu die männlichen KitV558Δ/+ Mäuse mit weiblichen C57BL/6J Mäusen im Verhältnis 1:2. HINWEIS: Der homozygote Kit V558 Δ/V558Δ Genotyp ist in utero tödlich. Es ist möglich, weibliche KitV558Δ / + Mäuse mit männlichen C57BL / 6J-Mäusen zu züchten, aber die Wurfgröße ist etwa halb so groß wie bei weiblichen Wildtyp-C57BL / 6J-Mäusen. Darüber hinaus produzieren weibliche KitV558Δ/+ Mäuse nach 4 Monaten begrenzte Würfe.</li>
	<li>Genotypisieren Sie die Welpen im Alter von 7-14 Tagen durch Zehenclipping, um das Vorhandensein des KitV558Δ/+ Genotyps zu bestätigen. Verwenden Sie den Vorwärtsprimer: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; Reporter 1: CCTCGACAACCTTCCA; Reverse-Primer: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; und Reporter 2: TCTCCTCGACCTTCCA für Genotypisierung.</li>
</ol>2. KitV558Δ/+ Mausbehandlung
<ol><li>Alter und Geschlecht stimmen mit dem KitV558Δ/+Mäuse vor der Behandlung überein. Verwenden Sie die alters- und geschlechtsangepassten Mäuse in Kohorten, da Tumore von weiblichen KitV558Δ / + Mäusen größer sind als die bei männlichen Mäusen. Behandeln Sie die Mäuse im Alter von 8-12 Wochen, zu welchem Zeitpunkt Tumore festgestellt werden (Abbildung 1).</li>
	<li>Tyrosinkinase-Hemmer oral oder durch intraperitoneale (i.p.) Injektion geben; KitV558Δ/+ Tumore sind empfindlich gegenüber Tyrosinkinase-Hemmern. Bieten Sie Imatinib in einer Dosis von 600 mg/l im Trinkwasser oder i.p. Injektionen von 45 mg/kg zweimal täglich an. Messen Sie die Tumorgewichtsreduktion mit digitalen Waagen nach der Dissektion des Tumors, wie in Schritt 3 gezeigt, die etwa 50% nach 1 Woche und 80% nach 4 Wochen nach der Behandlung mit Imatinib beträgt (Abbildung 2).</li>
</ol>3. BausatzV558Δ/+ Maus Organentnahme
<ol><li>Euthanasie Mäuse durch CO2 Narkose mit einer Durchflussrate von 60% Kammervolumen pro min. Lassen Sie die Mäuse mindestens 2 Minuten nach Beendigung der Atmung in der Kammer und führen Sie dann eine Zervixdislokation durch, um den Tod zu bestätigen.</li>
	<li>Sterilisieren Sie alle Instrumente, tragen Sie während des gesamten Eingriffs Handschuhe und pflegen Sie ein steriles Feld. Bereiten Sie die Haut mit 70% Ethanol vor. Machen Sie einen vertikalen Schnitt von 2 cm in der Mitte mit einer Schere und betreten Sie die Bauchhöhle. Lyse alle intraabdominalen Adhäsionen scharf.</li>
	<li>Um den drainierenden mesenterialen Lymphknoten zu entfernen, führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus.<ol>
<li>Identifizieren Sie den Blinddarm und heben Sie sein Mesenterium überlegen an. Ungefähr in der Mitte der Basis des Dickdarmmesenteriums identifizieren Sie den mesenterialen Lymphknoten und sezieren Sie ihn scharf. Der Lymphknoten ist cremefarben und etwa 0,5 cm x 0,5 cm groß.</li>
		<li>Teilen Sie das Lymphknotengewebe in Drittel für die Proteinisolierung, Histologie und Einzelzellsuspension, je nach Bedarf. Für Einzelzellsuspensionen legen Sie Lymphknotengewebe in 20 ml serumfreie Medien (RPMI) und halten Sie es auf Eis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie zur Isolierung von GIST und Blinddarm die unten beschriebenen Schritte aus.<ol>
<li>Der Blinddarm in KitV558Δ/+ Mäusen wird meist durch einen GIST ersetzt. Teilen Sie die ileokolische Verbindung vorsichtig von der Basis des Tumors ab. Um den Blinddarm zu sammeln, teilen Sie den Dickdarm wieder, 2 cm proximal zur Basis des Tumors.</li>
		<li>Bei 50%-60% der KitV558Δ/+ Mäuse enthält der Kopf des Tumors eine Kappe aus zeralem Gewebe, die typischerweise seröse Flüssigkeit enthält, aber selten Eiter enthalten kann (Abbildung 3). Sezieren Sie das Kappengewebe scharf vom Tumorgewebe weg.</li>
		<li>Teilen Sie Tumorgewebe und / oder Blinddarm in Drittel für Proteinisolierung, Histologie und Einzelzellsuspension, je nach Bedarf. Für Einzelzellsuspensionen legen Sie Tumorgewebe oder Blinddarm in HBSS mit 2% FCS, genug, um die Probe zu bedecken und auf Eis zu halten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Western Blot Analyse von GIST-Gewebe
<ol><li>Herstellen eines Gewebelysepuffers mit 50 mM TrisHCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% nicht denaturierendem Reinigungsmittel, 2 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 10 mM NaF und 20 μl/ml Proteinase-Inhibitor-Mischung.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 1x Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit 1% Tween 20 (TBST) vor, indem Sie 1800 ml deionisiertes Wasser, 2 ml Tween 20 und 200 ml 10x Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) kombinieren.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Gewebe aus Schritt 3.4.3 in einem FACS-Röhrchen in 5 ml / g Gewebelysepuffer und homogenisieren Sie zweimal mit einem mechanischen Homogenisator bei 15.000 U / min für 15 s auf Eis. Inkubieren Sie Lysat für 30 min auf Eis.</li>
	<li>Lysat in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 20 min bei 4 °C. Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen.</li>
	<li>Lysate auf einem 4% bis 15% igen Gradientengel laufen lassen und dann auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, wie in14 beschrieben.</li>
	<li>Waschen Sie die Membran einmal in 1x TBS für 5 min und blockieren Sie dann die Membran in 5% Milch für 1 h. Auch hier die Membran einmal in 1x TBS für 10 min waschen.</li>
	<li>Inkubationsmembran im primären Antikörper, verdünnt 1:1000 in 5% BSA bei 4 °C über Nacht. Membran 3x in 1x TBST für jeweils 10 min waschen. Inkubationstuplikat mit sekundärem Antikörper verdünnt 1:2500 in 2,5% Milch für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Membran einmal in 1x TBS für 5 min waschen. Fügen Sie genügend HRP-Substrat hinzu, um die Membran abzudecken, typischerweise 200-500 μL, und verwenden Sie einen digitalen Imager, um die Chemilumineszenz zu erkennen und zu quantifizieren.</li>
</ol>5. Immunhistochemie von GIST-Gewebe
<ol><li>Gewebe aus Schritt 3.3.2 oder 3.4.3 in 4% Paraformaldehyd bei 4 °C über Nacht fixieren. Lagern Sie das Gewebe in 70% EtOH, bis es zur Verarbeitung bereit ist. Einbetten und Schneiden von Blöcken mit einer Dicke von 5 μm auf Glasobjektträgern, wie beschrieben15,16.</li>
	<li>Vollständiger immunhistochemischer Nachweis mit einem grundlegenden Immundetektionskit, wie zuvor beschrieben17.</li>
</ol>6. Einzelzellige Suspension des mesenterialen Lymphknotens
<ol><li>Gießen Sie RPMI-Medien mit Lymphknotenproben aus Schritt 3.3.2 über einen 100-μm-Filter. Bewegen Sie den Filter auf einen neuen konischen 50-ml-Lymphknoten und einen Maischelymphknoten mit dem weichen Ende einer 3-ml-Kunststoffspritze. Waschfilter mit 20 ml RPMI-Medien.</li>
	<li>Das Filtrat bei 450 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 20 ml von 1% FBS in PBS (Perlenpuffer) und gießen Sie es über einen 40-μm-Filter. Sammeln Sie das Zellfiltrat. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer.</li>
	<li>Das Filtrat bei 450 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie im Perlenpuffer bei 6 x 10 7 Zellen / ml für die Durchflusszytometrie.</li>
</ol>7. Einzelzellsuspension von GIST
<ol><li>Bereiten Sie den Kollagenasepuffer vor, indem Sie 250 mg Kollagenase IV, eine Tablette EDTA-freien Proteasehemmers und 100 μL DNase I zu 50 ml HBSS hinzufügen. Bei Raumtemperatur 10 min drehen, bis sie sich aufgelöst haben.</li>
	<li>Geben Sie GIST in eine sterile Schale und fügen Sie 2,5 ml Kollagenasepuffer hinzu. Zerkleinern Sie den Tumor mit einem sterilen Skalpell und einer Schere, bis der Tumor in feinen Fragmenten ist. Verwenden Sie eine Pipette mit großer Bohrung, um den Tumor und die Kollagenase in eine 50-ml-Röhre zu aspirieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie in einem Schüttelinkubator bei 100 U / min bei 37 ° C für 30 min. Quench-Reaktion mit 2 ml FBS.</li>
	<li>Gießen Sie Kollagenase mit GIST-Probe über einen 100-μm-Filter und zerdrücken Sie den Tumor mit dem weichen Ende einer 3-ml-Kunststoffspritze und sammeln Sie ihn in einem 50-ml-Röhrchen. Waschfilter mit 20 ml HBSS. Das Filtrat bei 450 x g, 4 °C für 5 min zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand.</li>
	<li>Schwebe das Pellet in 20 ml Perlenpuffer und gieße es über einen 40-μm-Filter. Sammeln Sie das Filtrat und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Das Filtrat bei 450 x g, 4 °C für 5 min zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie im Perlenpuffer bei 6 x 10 7 Zellen / ml für die Durchflusszytometrie.</li>
</ol>8. Einzelzellige Suspension des Blinddarms
<ol><li>Bereiten Sie den Kollagenasepuffer wie in Schritt 7.1 vor. Spalten Sie den Blinddarm mit einer Schere in Längsrichtung, um die innere Schleimhaut freizulegen. In 0,5 cm große Abschnitte schneiden und in ein 50 ml Rohr mit 5 ml HBSS mit 2% FBS legen. 30 s kräftig schütteln, 20 s mit 450 x g zentrifugieren, dann den Überstand abpumpen.</li>
	<li>Fügen Sie 5 ml HBSS mit 2 mM EDTA hinzu. Inkubator in einem Schüttelinkubator bei 37 °C bei 100 U/min für 15 min inkubieren. Zentrifuge bei 450 x g für 20 s. Aspirieren Sie den Überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 5 ml HBSS hinzu. 30 s kräftig schütteln, 20 s mit 450 x g zentrifugieren, dann den Überstand abpumpen. Wiederholen Sie den Vorgang.</li>
	<li>Fügen Sie 5 ml Kollagenasepuffer hinzu. Inkubieren Sie in einem Schüttelinkubator bei 37 °C für 30 min bei 100 U / min. Alle 10 Minuten kräftig schütteln. Quench-Reaktion mit 2 ml FBS.</li>
	<li>Kollagenase mit Blinddarmprobe über einen 100-μm-Filter gießen und mit dem weichen Ende einer 3-ml-Kunststoffspritze zerdrücken. Waschfilter mit 20 ml HBSS. Sammeln Sie Filtrat.</li>
	<li>Das Filtrat bei 450 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in 20 ml Perlenpuffer und gießen Sie es über einen 40-μm-Filter. Sammeln Sie Filtrat und zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer.</li>
	<li>Das Filtrat bei 450 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie im Perlenpuffer bei 6 x 10 7 Zellen / ml für die Durchflusszytometrie.</li>
</ol>

<ol><li>Mastrangelo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+soft+tissue+sarcoma+and+beyond%3A+a+population-based+prospective+study+in+3+European+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions.</a> Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).</li>
<li>Joensuu, H., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+management+of+gastrointestinal+stromal+tumors%3A+a+model+for+targeted+and+multidisciplinary+therapy+of+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy.</a> Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).</li>
<li>Blanke, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+results+from+a+randomized+phase+II+trial+of+standard-+versus+higher-dose+imatinib+mesylate+for+patients+with+unresectable+or+metastatic+gastrointestinal+stromal+tumors+expressing+KIT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).</li>
<li>Demetri, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+regorafenib+for+advanced+gastrointestinal+stromal+tumours+after+failure+of+imatinib+and+sunitinib+%28GRID%29%3A+an+international%2C+multicentre%2C+randomised%2C+placebo-controlled%2C+phase+3+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial.</a> Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).</li>
<li>Gold, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+metastatic+GIST+in+the+era+before+tyrosine+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).</li>
<li>Huynh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorafenib+induces+growth+suppression+in+mouse+models+of+gastrointestinal+stromal+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).</li>
<li>Na, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+patient-derived+xenografts+from+patients+with+gastrointestinal+stromal+tumors%3A+analysis+of+clinicopathological+characteristics+related+to+engraftment+success%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7996(2020).</li>
<li>Balachandran, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imatinib+potentiates+antitumor+T+cell+responses+in+gastrointestinal+stromal+tumor+through+the+inhibition+of+Ido%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido.</a> Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).</li>
<li>Vitiello, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+immune+profiles+distinguish+the+mutational+subtypes+of+gastrointestinal+stromal+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).</li>
<li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).</li>
<li>Cavnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIT+oncogene+inhibition+drives+intratumoral+macrophage+M2+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).</li>
<li>Medina, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+kinase+inhibition+limits+Batf3-dependent+dendritic+cell+development+and+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).</li>
<li>Zhang, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+CD8%28%2B%29+T+cells+mediate+the+antitumor+efficacy+of+combined+CD40+ligation+and+imatinib+therapy+in+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).</li>
<li>General Protocol for Western Blotting. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf</a> (2022).</li>
<li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSadeghipour%2C+A+%22Biobanking%3A+Methods+and+Protocols%22">Biobanking: Methods and Protocols</a>. , Springer. New York. 253-268 (2019).</li>
<li>Sy, J., Ang, L. -C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSy%2C+J+%22Biobanking%3A+Methods+and+Protocols%22">Biobanking: Methods and Protocols</a>. , Springer. New York. 269-278 (2019).</li>
<li>Seifert, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1%2FPD-L1+blockade+enhances+T-cell+activity+and+antitumor+efficacy+of+imatinib+in+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors.</a> Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+KIT+modulates+Type+I+IFN-mediated+antitumor+immunity+in+GIST%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST.</a> Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).</li>
<li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Kit+signaling+and+therapeutic+intervention+in+a+mouse+model+of+gastrointestinal+stromal+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Das Mausmodell KitV558Δ/+ ist ein leistungsfähiges Forschungswerkzeug in der molekularen und immunologischen Analyse von GIST. Obwohl die Züchtungsstrategie eine einzige Kreuzung erfordert, erfordert die Verwendung von KitV558Δ/+ Mauskohorten in Experimenten, die die Tumorreaktion analysieren, eine umfangreiche Zucht. Mäuse sollten alters- und geschlechtsgerecht sein, um ähnliche Tumorgewichte zu gewährleisten, und 10% der Mäuse sterben vor dem Alter von 8 Wochen, wenn Tumore festg...

GIST ist das häufigste Sarkom beim Menschen mit einer Inzidenz von etwa 6.000 Fällen in den Vereinigten Staaten von Amerika1. GIST scheint von den gastrointestinalen Schrittmacherzellen zu stammen, die als interstitielle Zellen von Cajal bezeichnet werden, und wird typischerweise durch eine einzige Mutation in der Tyrosinkinase KIT oder PDGFRA2 angetrieben. Chirurgie ist die Hauptstütze der Behandlung von GIST und kann kurativ sein, aber Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung können mit dem Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI), Imatinib, behandelt werden. Seit seiner Einführung vor über 20 Jahren hat Imatinib das Behandlungsparadigma in GIST verändert und das Überleben bei fortgeschrittenen Erkrankungen von 1 auf über 5 Jahreverbessert 3,4,5. Leider ist Imatinib aufgrund erworbener KIT-Mutationen selten kurativ, so dass neue Behandlungen für diesen Tumor erforderlich sind.
Mausmodelle sind ein wichtiges Forschungsinstrument bei der Erforschung neuartiger Therapien bei Krebserkrankungen. Mehrere subkutane Xenotransplantat- und patientenabgeleitete Xenograft-Modelle wurden in GIST 6,7 entwickelt und untersucht. Immundefiziente Mäuse repräsentieren jedoch nicht vollständig die menschliche GIST, da GISTs je nach onkogener Mutation unterschiedliche Immunprofile aufweisen und die Veränderung der gastrointestinalen Tumormikroumgebung die Wirkung der TKI-Therapie verbessert 8,9. Die Kit V558Δ/+ Maus hat eine heterozygote Keimbahndeletion in Kit Exon 11, die die Juxtamembrandomäne kodiert, die am häufigsten mutierte Stelle im menschlichen GIST10. KitV558Δ/+ Mäuse entwickeln ein einzelnes CECAL GIST mit 100% Penetranz, und Tumore haben eine ähnliche Histologie, molekulare Signalgebung, Immuninfiltration und Reaktion auf die Therapie wie menschliche GIST 8,11,12,13. Hier beschreiben wir die Züchtung, Behandlung und Probenisolierung und -verarbeitung in KitV558Δ/+-Mäusen für den Einsatz in der molekularen und immunologischen Forschung in GIST.

<table><tbody><tr><td>100 Mikron Filter</td><td>EMSCO</td><td>1194-2360</td><td></td></tr><tr><td>1x RBC Lysepuffer</td><td>Life Technologies</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>3mL Spritze</td><td>Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences</td><td>14823435</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-Well, 30 & Mikro; l</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd Lösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>40 Mikron Filter</td><td>EMSCO</td><td>1194-2340</td><td></td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6546</td><td></td></tr><tr><td>70 Mikron Filter</td><td>EMSCO</td><td>1194-2350</td><td></td></tr><tr><td>AKT Antikörper (C67E7)</td><td>Zellsignalisierung</td><td>4691</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Kompletter Mini-EDTA-freier Proteasehemmer</td><td>Thomas</td><td>Scientific C852A34</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automatisierter Zellzähler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Skalpelle</td><td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td><td>14-840-00</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thomas</td><td>Scientific C756V81</td><td></td></tr><tr><td>Dog1 Antikörper</td><td>abcam</td><td>ab64085</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>ERK Antikörper (p44/42)</td><td>Cell Signaling</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thomas Scientific</td><td>C788U23</td><td></td></tr><tr><td>Fidschi Software</td><td>Fidschi</td><td></td><td>https://imagej.net/software/fiji</td></tr><tr><td>Fisherbrand 850 Homogenisator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-340-169</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>University of Pennsylvania Cell Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imatinib Mesilat</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1026</td><td></td></tr><tr><td>KIT Antikörper (D13A2)</td><td>Cell Signaling</td><td>3074</td><td></td></tr><tr><td>KitV558&Delta;/+ Genotypisierung</td><td>Transnetyx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Maus-auf-Maus-Immundetektionskit, Basic</td><td>Vector Laboratories</td><td>BMK-2202</td><td></td></tr><tr><td>Nitrozellulosemembran, vorgeschnitten, 0,45 &; Mikro; m</td><td>Rio-Rad</td><td>1620145</td><td></td></tr><tr><td>fettfreie Trockenmilch</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9121673</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 Ersatz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>p-AKT Antikörper (S473)</td><td>Cell Signaling</td><td>4060</td><td></td></tr><tr><td>p-ERK Antikörper (p44/42)</td><td>Cell Signaling</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>p-KIT Antikörper (Y719)</td><td>Cell Signaling</td><td>3391</td><td></td></tr><tr><td>PMSF Protease-Inhibitor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Proeinase K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP170050</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen für den Polystyrol-Test (FACS) mit rundem Boden</td><td>Falcon/Thermo Fisher Scientific</td><td>14-959-2A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>University of Pennsylvania Cell Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluorid (NaF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>201154</tr><tr><td>Natriumorthovanadat (Na3VO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34076</td><td></td></tr><tr><td>TBS Puffer (10x)</td><td>University of Pennsylvania Cell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Center Gewebekulturschale (100 mm2)</td><td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>TrisHCL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1757500</td><td></td></tr><tr><td>zwischen 20</td><td>Rio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; vivaCT 80 Plattform</td><td>Scanco medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

molekulare und immunologische techniken in einem gentechnisch veränderten mausmodell des gastrointestinalen stromatumors

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Der gastrointestinale Stromatumor (GIST) ist das häufigste menschliche Sarkom und wird typischerweise durch eine einzige Mutation im KIT-Rezeptor verursacht. Über alle Tumorarten hinweg wurden zahlreiche Mausmodelle entwickelt, um die nächste Generation von Krebstherapien zu untersuchen. In GIST verwenden die meisten In-vivo-Studien jedoch Xenograft-Mausmodelle, die inhärente Einschränkungen aufweisen. Hier beschreiben wir ein immunkompetentes, gentechnisch verändertes Mausmodell eines gastrointestinalen Stromatumors, der eine KitV558Δ/+ Mutation beherbergt. In diesem Modell wird das mutierte KIT, das für die meisten GISTs verantwortliche Onkogen, von seinem endogenen Promotor angetrieben, was zu einem GIST führt, der das histologische Erscheinungsbild und das Immuninfiltrat in menschlichen GISTs nachahmt. Darüber hinaus wurde dieses Modell erfolgreich eingesetzt, um sowohl gezielte molekulare als auch Immuntherapien zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Zucht und Pflege einer KitV558Δ/+ Mauskolonie. Darüber hinaus beschreibt dieses Papier die Behandlung und Beschaffung von GIST, drainierendem mesenterialen Lymphknoten und angrenzendem Blinddarm in KitV558Δ / + -Mäusen sowie die Probenvorbereitung für molekulare und immunologische Analysen.

Das Mausmodell KitV558Δ/+ ermöglicht die Untersuchung von Therapeutika in einem immunkompetenten Mausmodell. KitV558Δ/+ Mäuse haben aufgrund einer fortschreitenden Darmobstruktion eine durchschnittliche Lebensdauer von 8 Monaten (Abbildung 4). Tumore von KitV558Δ/+-Mäusen exprimieren kanonische Marker von GIST, einschließlich der Tyrosinkinase KIT und des Transmembrankanals DOG1 (<strong class="xfig...

Das Ziel dieses Manuskripts ist es, das KitV558Δ/+ Mausmodell und Techniken für die erfolgreiche Dissektion und Verarbeitung von Mausproben zu beschreiben.

Molekulare und immunologische Techniken in einem gentechnisch veränderten Mausmodell des gastrointestinalen Stromatumors

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Unser Protokoll beschreibt die Zucht, Wartung, Dissektion und Probenverarbeitung des einzigen immunkompetenten Mausmodells, GIST, das derzeit verwendet wird. Wir hoffen, dass zukünftige Forscher in der Lage sein werden, dieses Mausmodell zu nutzen, um die translationale Forschung in GIST voranzutreiben. Traditionelle Therapien in GIST beinhalten eine gezielte molekulare Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren.Dieses Modell ermöglicht es Forschern, Immuntherapien in GIST zu testen. Sterilisieren Sie zunächst alle Instrumente, tragen Sie während des gesamten Eingriffs Handschuhe und pflegen Sie ein steriles Feld. Bereiten Sie den Bereich des Einschnitts mit 70% Ethanol vor.Machen Sie mit einer Schere einen vertikalen Schnitt in der Mitte von zwei Zentimetern und betreten Sie die Bauchhöhle. Lyse alle intraabdominalen Adhäsionen scharf. Um den drainierenden mesenterialen Lymphknoten zu entfernen, identifizieren Sie den Blinddarm und heben Sie sein Mesenterium überlegen an.Ungefähr in der Mitte der Basis des Dickdarmmesenteriums identifizieren Sie den mesenterialen Lymphknoten und sezieren Sie ihn scharf. Teilen Sie das Lymphknotengewebe bei Bedarf in Drittel für Proteinisolierung, Histologie und Einzelzellsuspension auf. Legen Sie Lymphknotengewebe in 20 Milliliter RPMI-Medium für Einzelzellsuspensionen und halten Sie es auf Eis.Der Blinddarm wird bei den Kit558-Mäusen meist durch einen GIST ersetzt. Zur Isolierung von GIST und Blinddarm trennen Sie vorsichtig die ileokolische Verbindung von der Basis des Tumors. Dann teilen Sie den Blinddarm wieder, zwei Zentimeter distal zur Basis des Tumors.Bei 50 bis 60% der Kit558-Mäuse enthält der Kopf des Tumors eine Kappe aus cecal tissue, die typischerweise seröse Flüssigkeit enthält, aber selten Eiter enthalten kann. Sezieren Sie das Kappengewebe scharf vom Tumorgewebe weg. Teilen Sie das Tumorgewebe und den Blinddarm in Drittel für Proteinisolierung, Histologie und Einzelzellsuspension.Für Einzelzellsuspensionen legen Sie Tumorgewebe oder Blinddarm in HBSS mit 2% FCS, genug, um die Probe zu bedecken, und halten Sie es auf Eis. Gießen Sie RPMI-Medien mit der Lymphknotenprobe über einen 100-Mikrometer-Filter. Bewegen Sie den Filter auf ein neues 50-Milliliter-Konikum und zerdrücken Sie den Lymphknoten mit dem weichen Ende einer Drei-Milliliter-Kunststoffspritze.Waschfilter mit 20 Millilitern RPMI-Medien. Zentrifugieren Sie die Proben und aspirieren Sie den Überstand. Schwebe das Pellet in 20 Milliliter Perlenpuffer und gieße es über einen 40-Mikrometer-Filter.Sammeln Sie das Zellfiltrat. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer. Zentrifugieren Sie die Proben und entsorgen Sie den Überstand.Dann resuspendieren Sie in Perlenpuffer für die Durchflusszytometrie. Bereiten Sie den Kollagenasepuffer wie im Textmanuskript beschrieben vor. Geben Sie GIST in eine sterile Schale und fügen Sie 2,5 Milliliter Kollagenasepuffer hinzu.Zerkleinern Sie den Tumor mit einem sterilen Skalpell und einer Schere, bis er sich in feinen Fragmenten befindet. Verwenden Sie eine großkalibrige Pipette, um den Tumor und die Kollagenase in ein 50-Milliliter-Rohr zu aspirieren. Inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten mit 100 Umdrehungen pro Minute und löschen Sie dann die Reaktion mit zwei Millilitern FBS.Gießen Sie Kollagenase mit GIST-Probe über einen 100-Mikrometer-Filter und zerdrücken Sie den Tumor mit dem weichen Ende einer Drei-Milliliter-Kunststoffspritze und sammeln Sie ihn in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Waschfilter mit 20 Millilitern HBSS. Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 450 RCF fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie dann den Überstand.Schwebe das Pellet in 20 Milliliter Perlenpuffer und gieße es über einen 40-Mikrometer-Filter Sammeln Sie das Filtrat und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Zentrifugieren und aspirieren Sie den Überstand, dann resuspendieren Sie ihn im Perlenpuffer für die Durchflusszytometrie. Spalten Sie den Blinddarm mit einer Schere in Längsrichtung, um die innere Schleimhaut freizulegen.Schneiden Sie es in 0,5-Zentimeter-Abschnitte und legen Sie es in ein 50-Milliliter-Rohr mit fünf Millilitern HBSS und 2% FBS. 30 Sekunden lang kräftig schütteln und 20 Sekunden bei 450 RCF zentrifugieren. Verwerfen Sie dann den Überstand.Fügen Sie fünf bis 20 Milliliter HBSS mit zwei-millimolärem EDTA hinzu. Inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius bei 100 Umdrehungen pro Minute für 15 Minuten. Zentrifugieren und entsorgen Sie den Überstand, dann suspendieren Sie das Pellet in fünf bis 20 Millilitern HBSS.Schütteln Sie die Mischung 30 Sekunden lang kräftig, zentrifugieren Sie dann bei 450 RCF für 20 Sekunden und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal. Schwebe das Pellet in fünf Milliliter Kollagenasepuffer und inkubiere es dann bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten mit 100 Umdrehungen pro Minute.Schütteln Sie alle 10 Minuten kräftig und löschen Sie die Reaktion mit zwei Millilitern FBS. Gießen Sie Kollagenase mit Blinddarmprobe über einen 100-Mikrometer-Filter und zerdrücken Sie sie mit dem weichen Ende einer Drei-Milliliter-Kunststoffspritze. Waschen Sie den Filter mit 20 Millilitern HBSS und sammeln Sie das Filtrat.Zentrieren und verwerfen Sie den Überstand. Schwebe das Pellet in 20 Milliliter Perlenpuffer und gieße es über einen 40-Mikrometer-Filter. Sammeln Sie Filtrat und zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer.Wiederholen Sie den Zentrifugationsprozess noch einmal und suspendieren Sie das Pellet in einem Perlenpuffer für die Durchflusszytometrie. Die Kit558-Mäuse hatten aufgrund eines fortschreitenden Darmverschlusses eine durchschnittliche Lebensdauer von acht Monaten. Tumore der Kit558-Mäuse exprimierten kanonische Marker von GIST, einschließlich der Tyrosinkinase KIT, des Transmembrankanals Dog1 und des Transkriptionsfaktors ETV1.Tumore wurden auf Veränderungen im KIT-Signalweg untersucht, wie die nachgeschalteten Marker ERK und AKT oder die Immunmikroumgebung, die das menschliche GIST genau nachahmt. MRT oder CT wurde verwendet, um das Tumorvolumen als genaue Messung der Tumorreaktion zu verfolgen. Die Sezierung des Tumors weg von der ileokolischen Verbindung und weg von der Cecal-Kappe ist wichtig, um das wahre Tumorgewicht und die Immun- und Molekularanalyse zu erfassen.Innerhalb von GIST hat dieses Modell die Untersuchung der Tumormikroumgebung sowie Immuntherapien ermöglicht.

molecular-immunologic-techniques-genetically-engineered-mouse-model

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Die Generierung und Charakterisierung von Tumor-spezifischen T-Zellen mit humanisierten Mäusen wird hier beschrieben. Menschliche Thymus-Gewebe und gentechnisch veränderten humanen hämatopoetischen Stammzellen in immungeschwächten Mäusen transplantiert. Hierdurch ergibt sich der Rekonstitution eines konstruierten menschliche Immunsystem so zur in vivo-Untersuchung von Anti-Tumor-Immunantwort.

Mit der BLT humanisierte Maus als Stem Cell based Gene Therapy Tumormodell

Hier beschreiben wir ein effizientes und vielseitiges Protokoll zur Induktion, Überwachung und Analyse neuartiger Glioblastome (GBM) unter Verwendung von Transposon-DNA, die in die Ventrikel von neugeborenen Mäusen injiziert wird. Zellen der subventrikulären Zone, die das Plasmid aufnehmen, transformieren, vermehren und Tumore mit histopathologischen Merkmalen des menschlichen GBM erzeugen.

Transposon-vermittelte Integration von Plasmid-DNA in die Subventrikularzone von neugeborenen Mäusen zu Novel Modelle von Glioblastoma generieren

Hier beschreiben wir das Modell und den Ansatz zur Untersuchung der Funktionen von Lungenalveolarmakrophagen bei der Metastasierung von Krebs. Um die Rolle dieser Zellen bei der Metastasierung zu demonstrieren, wurde das syngene (4T1) Modell des Brustkrebses in Verbindung mit der Depletion von Alveolarmakrophagen mit Clodronat-Liposomen verwendet.

Untersuchung der Rolle von Alveolarmakrophagen in Metastasierung von Brustkrebs

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von murinen orthotope Blasentumoren in weiblichen C57BL / 6J-Mäusen und für die Überwachung des Tumorwachstums.

Ein Murine Orthotopische Blasentumormodell und Tumor Detection System

Ein Protokoll für die Etablierung eines gentechnisch veränderten Mausmodells von Darmkrebs durch segmentale Adeno-Cre-Infektion und deren Überwachung durch hochauflösende Koloskopie wird vorgestellt.

Ein genetisch manipuliertes Mausmodell des sporadischen Darmkrebses

Lasermikrodissektion (LMD) ist eine empfindliche und hochreproduzierbare Technik, die verwendet werden kann, um Wege aufzudecken, die Gliomheterogenität und Invasion vermitteln. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Isolierung diskreter Bereiche aus Gliomgewebe mittels Laser LMD, gefolgt von transkriptomischer Analyse.

Lasercapture Mikrodissektion von Glioma Subregionen für räumliche und molekulare Charakterisierung der intratumoralen Heterogenität, Oncostreams und Invasion

Dieser Artikel beschreibt einen Workflow von Techniken, die zum Testen neuartiger Kandidatenmediatoren von Melanommetastasen und deren Wirkmechanismus eingesetzt werden.

Eine robuste Entdeckungsplattform zur Identifizierung neuartiger Mediatoren der Melanommetastasierung

Die Verwendung eines immunkompetenten, autochthonen Tumormodells, das von häufigen Patientenmutationen angetrieben wird, für präklinische Tests ist für immuntherapeutische Tests von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Generierung von Hirntumor-Mausmodellen unter Verwendung der elektroporationsbasierten Verabreichung von Plasmid-DNA, die häufige Patientenmutationen repräsentieren, und liefert so ein genaues, reproduzierbares und konsistentes Mausmodell.

Modellierung von Hirntumoren in vivo unter Verwendung der elektroporationsbasierten Verabreichung von Plasmid-DNA, die die Mutationssignaturen von Patienten repräsentiert

Wir haben eine Methodik entwickelt, um zu beurteilen, ob Neubildungen des Nervensystems in gentechnisch veränderten Mäusen die Pathologie ihrer menschlichen Gegenstücke genau rekapitulieren. Hier wenden wir diese histologischen Techniken, definierten pathologischen Kriterien und Kulturmethoden auf Neurofibrome und maligne periphere Nervenscheidentumoren an, die im P 0-GGFβ3-Mausmodell auftreten.

Identifizierung, Diagnose und Einstufung bösartiger peripherer Nervenscheidentumoren in gentechnisch veränderten Mausmodellen

Dieses Protokoll zeigt , wie fluoreszierend markiert, genetisch definierten klonalen Tumoren im Auge von Drosophila melanogaster / antennal Imaginalscheiben (EAD) zu erzeugen. Es beschreibt, wie der EAD und Gehirn aus dem dritten Larvenstadium zu sezieren und wie sie zu verarbeiten, zu visualisieren und zu Veränderungen der Genexpression und Tumorinvasivität quantifizieren.

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Erfahren Sie die Zucht, Präparation und Prozessierung des immunokompetenten Kit V558Δ/+ Mausmodells für GIST-Forschung. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung von Immuntherapien bei gastrointestinalen Stromatumoren.

Molekulare und immunologische Techniken in einem gentechnisch veränderten Mausmodell des gastrointestinalen Stromatumors

Weitere Videos entdecken