Name: Messung der einzelligen mitochondrialen DNA-Kopienzahl und Heteroplasmie mittels digitaler Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Erfahren Sie die digitale Tröpfchen-PCR zur präzisen Messung der mitochondrialen DNA-Kopienzahl und Deletionsheteroplasmie in einzelnen Zellen. Diese Methode ermöglicht Forschern detaillierte Einblicke in mitochondriale Dynamiken.

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Vielen Dank an Dr. L Bozhilova für die Beratung zur statistischen Analyse von PCR-Daten zur Tröpfchenerzeugung. Vielen Dank an Dr. H Zhang für die Bereitstellung der Eizellen, die zur Generierung von Daten in Abbildung 3C und Abbildung 4B verwendet wurden. Diese Arbeit wurde von SPB an der Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9) der University of Cambridge durchgeführt und durch ein Wellcome Trust Principal Research Fellowship von PFC (212219 / Z / 18 / Z) finanziert.

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Keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Das hier beschriebene Protokoll ist zusätzlich zu den oben beschriebenen auf eine Vielzahl von Zelltypen und -spezies anwendbar, obwohl eine sorgfältige Optimierung neuer Assay-Designs von entscheidender Bedeutung sein wird, um sicherzustellen, dass Genauigkeit und Wiederholbarkeit der Methode erhalten bleiben, wenn man sich von zuvor validierten Primer/Sonden-Kombinationen entfernt. Bei der Arbeit mit Einzelzellen ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Probenentnahme so genau wie möglich durchgeführt wird (z. B. unte...

Die mitochondriale (mt)DNA von Säugetieren ist ein kleines (ca. 16,5 Kb), zirkuläres DNA-Genom, das sich in der mitochondrialen Matrix befindet und 37 Gene kodiert, bestehend aus zwei rRNAs, 22 tRNAs und 13 proteinkodierendenGenen 1. Im Gegensatz zum Kerngenom, das eine (haploide) oder zwei (diploide) Kopien jedes Gens pro Zelle enthält, ist mtDNA in mehreren Kopien in den Mitochondrien jeder Zelle vorhanden, die von Dutzenden von Kopien (z. B. reife Spermatozyten) bis zu Hunderttausenden von Kopien (z. B. Eizellen) reichen2,3. Eine Folge dieser Multi-Copy-Natur ist, dass Mutationen im mtDNA-Genom, die als Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), Deletionen oder Duplikationen existieren können, in einer bestimmten Zelle auf unterschiedlichen Ebenen vorhanden sein können und zwischen 0% und 100% der gesamten mtDNA-Population der Zelle ausmachen. Die Existenz von Wildtyp- und mutierten mtDNA-Genomen in derselben Zelle wird als Heteroplasmie bezeichnet, und pathogene heteroplasmatische mtDNA-Mutationen sind eine Hauptursache für mitochondriale Erkrankungen, wobei mehrere häufige neurologische Syndrome mit zugrunde liegenden heteroplasmatischen mtDNA-Mutationen verbunden sind4.
Zwei Schlüsselparameter, die zur Wahrscheinlichkeit beitragen, dass eine heteroplasmatische mtDNA-Mutation eine klinische Erkrankung verursacht, sind die Heteroplasmieebene und die mtDNA-Kopienzahl. Viele heteroplasmatische Mutationen zeigen einen Schwelleneffekt, wobei biochemische und klinische Phänotypen erst oberhalb eines bestimmten Heteroplasmaspiegels, typischerweise um 80%5, sichtbar werden und sich anschließend mit zunehmender Heteroplasmie verschlechtern4. Es ist jedoch auch wichtig, die Anzahl der in der Zelle vorhandenen Kopien von mtDNA zu berücksichtigen, da dies die Anzahl der Wildtyp-mtDNA-Genome beeinflusst, die auf einem bestimmten heteroplasmatischen Niveau vorhanden sind. Studien an Patienten mit mitochondrialen Erkrankungen haben die Bedeutung dieses Zusammenspiels zwischen Heteroplasmie und Kopienzahl5,6 hervorgehoben, und Filograna et al. berichteten kürzlich über einen Anstieg der mtDNA-Kopienzahl, der die Symptome trotz unveränderter Heteroplasmie in einem Mausmodell der mitochondrialen Erkrankung lindert7.
Während in den letzten Jahren viel getan wurde, um das Verständnis der Pathogenese und Übertragung von Krankheiten, die durch mtDNA-Heteroplasmie verursacht werden, zu verbessern, wurden die meisten dieser Arbeiten auf der Ebene von Geweben und nicht auf der Ebene von Zellen durchgeführt, wobei mittlere Gewebeheteroplasmiespiegel und Kopienzahlmessungen aus Massengewebebiopsien und Blutproben verglichen wurden. Einige etablierte Techniken, wie die Laser-Capture-Mikrodissektion, ermöglichen solche Messungen auf zellulärer Ebene 8,9; Die jüngste Explosion von Hochdurchsatz-Einzelzellanalysemethoden oder sogenannten "Single-cell Omics"10 hat jedoch einen Bedarf an Methoden geschaffen, die diese entscheidenden mtDNA-Parameter auf Einzelzellebene genau messen können.
Die Tröpfchenerzeugungs-PCR-Methode nutzt die jüngsten Fortschritte in der mikrofluidischen Technologie, um bestehende Methoden zur Quantifizierung unbekannter DNA-Konzentrationen durch PCR-Amplifikation spezifischer Zielamplicons in der Proben-DNAzu verbessern 11. Im Gegensatz zur qPCR, bei der die Proben-DNA in einer einzigen Reaktion amplifiziert wird, wobei die relative Akkumulationsrate des PCR-Produkts als Auslesung dient, teilt diese Methode die ursprüngliche Probe in Tausende von einzelnen Tröpfchen auf, wodurch die DNA-Moleküle der Probe in räumlich getrennte Reaktionen unterteiltwerden 12. Die anschließende PCR-Reaktion läuft in jedem einzelnen Tröpfchen ab, wobei sich das PCR-Produkt nur in Tröpfchen anreichert, die die Ziel-DNA enthalten. Das Ergebnis dieser Reaktion ist ein digitaler Ausgang in Form eines Pools von Tröpfchen, die entweder eine Kopie der Ziel-DNA und des amplifizierten PCR-Produkts enthalten oder keine Ziel-DNA enthalten. Mit fluoreszierenden DNA-Sonden oder einem doppelsträngigen (ds) DNA-bindenden Farbstoff können die Tröpfchen, die ein amplifiziertes Produkt enthalten, gezählt werden, und das Verhältnis von "positiven" zu "negativen" Tröpfchen kann verwendet werden, um die absolute Anzahl der DNA-Kopien zu berechnen, die in der ursprünglichen Probe vorhanden waren. Diese absolute Messung ist im Gegensatz zu der relativen Messung, die aus einer qPCR-Reaktion gewonnen wird, der Schlüsselfaktor, der es ermöglicht, diese Methodik für die genaue Messung der mtDNA-Kopienzahl und der Heteroplasmie in Einzelzellen zu verwenden11, und mehrere neuere Studien haben bereits die PCR-Technologie zur Tröpfchenerzeugung für diesen Zweck verwendet13,14 . Dieser Artikel stellt eine Methode zur Messung der mtDNA-Kopienzahl und Deletionsheteroplasmie in einzelnen Zellen aus menschlichem und Mausgewebe vor.

<table><tbody><tr><td>50 % Tween-20-Lösung</td><td>Novex</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>Automatisiertes Tröpfchen-erzeugendes Öl&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864110</td><td>Kommerzielle Ölformulierung, die zur Erzeugung der Öl-/Tröpfchenemulsion verwendet wird (verwendet in Protokollschritt 4.1)</td></tr><tr><td>C1000 PCR-Maschine mit Deep-Well-Block</td><td>Bio Rad</td><td>1851197</td><td>PCR-Thermocycler, ausgestattet mit einem Deep-Well-Heizblock, verwendet für die Zelllyse (Protokollschritt 2.1.2.) und PCR-Zyklus (Protokollschritt 5)</td></tr><tr><td>Entnahmeplatten-Kühlblock</td><td>Bio Rad</td><td>12002819</td><td>Kühlblock, der die Proben während der Tröpfchenerzeugung kühl hält (verwendet in Protokollschritt 4.3)</td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well-Platten&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>12001925</td><td>96-Well-Platten-Pipettenspitzen, die für den Einsatz im QX200 AutoDG Tröpfchengenerator entwickelt wurden und für die Probenvorbereitung (Protokollschritt 3.4) und die Tröpfchensammlung (Protokollschritt 4.3) verwendet werden.</td></tr><tr><td></td><td>Bio Rad</td><td>1863004</td><td>Kommerzielle Ölformulierung, die vom Tröpfchenleser verwendet wird (verwendet in Protokollschritt 6.1)</td></tr><tr><td>ddPCR Supermix für Sonden (kein dUTP)</td><td>Bio Rad</td><td>1863023</td><td>Kommerzieller Supermix zur Verwendung in ddPCR-Experimenten mit Sonden (verwendet in Protokollschritt 3.3)</td></tr><tr><td>DG32 Kartuschen für automatisierte Tröpfchengenerator&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864108</td><td>Mikrofluidische Kartuschen, die im QX200 AutoDG Tröpfchengenerator zur Erzeugung der Öl-/Tröpfchenemulsion verwendet werden (verwendet in Protokollschritt 4.3)</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Qualifiziertes fötales Rinderserum</td></tr><tr><td>Folienplattenabdeckungen&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1814040</td><td>Folienplattenabdeckungen zum Verschließen von Tröpfchensammelplatten nach der Tröpfchenerzeugung (verwendet in Protokollschritt 4.6)</td></tr><tr><td>HEK 293T-Zellen</td><td>Takara</td><td>632180</td><td>Kommerzieller Subklon der transformierten humanen embryonalen Nierenzelllinie, HEK 293, die das SV40 Large-T-Antigen exprimiert</td></tr><tr><td>HeLa-Zellen</td><td>ECACC</td><td>93021013</td><td>Menschliche Gebärmutterhals-Epitheloidkarzinomzellen</td></tr><tr><td>DMEM mit hohem Glukosegehalt</td><td>Gibco</td><td>13345364</td><td>4,5 g/l D-Glucose, mit L-Glutamin und Natriumpyruvat</td></tr><tr><td>Menschliche Cybriden</td><td>University of Miami</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus embryonale Fibroblasten&nbsp;</td><td>Universität Newcastle</td><td>Immortalisiert aus C57Bl/6 Mäusen</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Plattendichtungen</td><td>Pierce</td><td>SP-0027</td><td>Durchsichtige Klebeplattendichtungen, nur Vortröpfchenerzeugung verwendet (Foliendichtung muss in Schritt 4.6 verwendet werden)</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen-Abfallbehälter</td><td>Bio Rad</td><td>1864125</td><td>Einweg-Auffangbehälter zum Sammeln von weggeworfenen Spitzen im QX200 AutoDG Tröpfchengenerator (verwendet in Protokollschritt 4.3)</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen für das AutoDG-System&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864120</td><td>Gefilterte Pipettenspitzen, die für die Verwendung im QX200 AutoDG-Tröpfchengenerator entwickelt wurden (verwendet in Protokollschritt 4.3)</td></tr><tr><td>Primäre humane dermale Fibroblastenzellen</td><td>Newcastle Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer/Sonden</td><td>IDT N</td><td>/A</td><td>Genaue Primer-/Sondensequenzen sind vom Assay abhängig. Primer und Sonden, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in Tabelle 1</td></tr><tr><td>Proteinase K 20 mg/ml-Lösung</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR-Plattenversiegelung</td><td>Bio Rad</td><td>1814000</td><td>Bringt nach der Tröpfchenerzeugung Folienversiegelungen auf ddPCR-Probenplatten auf (verwendet in Protokollschritt 4.6)</td></tr><tr><td>QX Manager-Software</td><td>Bio Rad</td><td>12012172</td><td>Droplet Reader Einrichtung und Analysesoftware (verwendet in den Protokollschritten 6 und 7)</td></tr><tr><td>QX200 AutoDG Tröpfchengenerator</td><td>Bio Rad</td><td>1864101</td><td>Automatisierter mikrofluidischer Tröpfchengenerator (verwendet in Protokollschritt 4)</td></tr><tr><td>QX200 Tröpfchenleser</td><td>Bio Rad</td><td>1864003</td><td>Tröpfchenleser (verwendet in Protokollschritt 6)</td></tr><tr><td>Trizma voreingestellte Kristalle pH 8,3</td><td>Sigma</td><td>T8943-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

messung der einzelligen mitochondrialen dna-kopienzahl und heteroplasmie mittels digitaler tröpfchenpolymerase-kettenreaktion

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Die mitochondriale (mt)DNA von Säugetieren ist ein kleines, zirkuläres, doppelsträngiges, intramitochondriales DNA-Molekül, das 13 Untereinheiten der Elektronentransportkette kodiert. Im Gegensatz zum diploiden Kerngenom enthalten die meisten Zellen viel mehr Kopien der mtDNA, die je nach Zelltyp von weniger als 100 bis über 200.000 Kopien reichen. Die MtDNA-Kopienzahl wird zunehmend als Biomarker für eine Reihe von altersbedingten degenerativen Erkrankungen und Krankheiten verwendet, und daher wird die genaue Messung der mtDNA-Kopienzahl zu einem Schlüsselinstrument sowohl in der Forschung als auch in der Diagnose. Mutationen in der mtDNA, die oft als Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) oder Deletionen auftreten, können entweder in allen Kopien der mtDNA innerhalb der Zelle (Homoplasmie genannt) oder als Mischung aus mutierten und WT-mtDNA-Kopien (Heteroplasmie genannt) existieren. Heteroplasmatische mtDNA-Mutationen sind eine Hauptursache für klinische mitochondriale Pathologie, entweder bei seltenen Krankheiten oder bei einer wachsenden Anzahl von häufigen spät einsetzenden Krankheiten wie der Parkinson-Krankheit. Die Bestimmung des Grades der Heteroplasmie in Zellen ist ein kritischer Schritt bei der Diagnose seltener mitochondrialer Erkrankungen und in der Forschung, die darauf abzielt, häufige spät einsetzende Störungen zu verstehen, bei denen Mitochondrien eine Rolle spielen können. MtDNA-Kopienzahl und Heteroplasmie wurden traditionell durch quantitative (q)PCR-basierte Assays oder Tiefensequenzierung gemessen. Die jüngste Einführung der ddPCR-Technologie hat jedoch eine alternative Methode zur Messung beider Parameter bereitgestellt. Es bietet mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Methoden, einschließlich der Möglichkeit, die absolute mtDNA-Kopienzahl zu messen, und einer ausreichenden Empfindlichkeit, um auch bei niedrigen Kopienzahlen genaue Messungen von einzelnen Zellen durchzuführen. Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das die Messung der mtDNA-Kopienzahl in einzelnen Zellen mittels ddPCR beschreibt, im Folgenden als Tröpfchenerzeugungs-PCR bezeichnet, mit der Option zur gleichzeitigen Messung der Heteroplasmie in Zellen mit mtDNA-Deletionen. Die Möglichkeit, diese Methode zur Messung von Heteroplasmen in Zellen mit mtDNA-SNPs zu erweitern, wird ebenfalls diskutiert.

Nach der Tröpfchenerzeugung ist eine klare Schicht undurchsichtiger Tröpfchen sichtbar, die auf der Ölphase in jedem Bohrloch schwimmt (Abbildung 1B). Die Tröpfchenbildung kann durch das Vorhandensein von Detergenzien im Eingangslysat bei Experimenten an einzelnen Zellen beeinträchtigt werden. Unter Verwendung des in Abschnitt 2.1.2 beschriebenen Lyseprotokolls werden trotz des Vorhandenseins einer geringen Restmenge von TWEEN-20 in der Endprobe routinemäßig Tröpfchenausbeuten über dem empfo...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der absoluten mitochondrialen (mt)DNA-Kopienzahl und der mtDNA-Deletionsheteroplasmie in einzelnen Zellen vor.

Messung der einzelligen mitochondrialen DNA-Kopienzahl und Heteroplasmie mittels digitaler Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Anzahl der Kopien der mitochondrialen DNA in einzelnen Zellen und das Niveau bestimmter Arten von mitochondrialen DNA-Mutationen genau zu messen. Bisherige Methoden können diese Messungen in Gewebeproben, die viele Zellen enthalten, genau durchführen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir die gleichen Messungen in einzelnen Zellen durchführen können.Diese Methode ist besonders nützlich für diejenigen, die Mitochondrien studieren und wird breite Anwendungen in diesem Bereich haben. Die effektive Isolierung und Lyse einzelner Zellen ist der Schlüssel zu dieser Technik. Vorherige Erfahrungen mit der Einzelzellsortierung wären sehr hilfreich.Um zu beginnen, bereiten Sie den Mastermix für die PCR ohne die Proben-DNA auf Eis vor, wie im Text beschrieben. Nach dem kurzen Durchtexen verteilen Sie das erforderliche Volumen der vorbereiteten Mastermischung auf jede Vertiefung einer PCR 96-Well-Platte zur Tröpfchenerzeugung und ordnen die Proben in vollen Spalten an. Fügen Sie als Nächstes die Mastermischung jedem leeren Feld in unvollständigen Spalten hinzu, um sie als Nicht-Vorlagensteuerelemente zu verwenden.Fügen Sie dann die Eingangs-DNA zu jeder Vertiefung hinzu, um das Gesamtvolumen jedes Bohrlochs auf 22 Mikroliter zu erhöhen. Verschließen Sie die Platte mit einer Klebeplattendichtung und legen Sie sie eine Minute lang bei 2000 U/min auf einen Shaker. Dann zentrifugieren Sie die Platte bei 1000 mal G für eine Minute bei vier Grad Celsius, bevor Sie sie auf Eis legen.Stellen Sie bei der Tröpfchenerzeugung zunächst sicher, dass der Tröpfchengenerator eingeschaltet ist, und prüfen Sie, ob eine Flasche tröpfchenerzeugendes Öl an Position E des Instrumentendecks geladen ist. Klicken Sie dann auf dem Touchscreen auf Configure Sample Plate. Nachdem Sie alle Spalten auf der Probenplatte mit den Proben oder Leerproben ausgewählt haben, klicken Sie auf OK, um die Plattenkonfiguration zu bestätigen.Als nächstes laden Sie die Tröpfchengeneratorpatronen auf Position B auf dem Instrumentendeck, so dass alle Lichter grün werden, und legen Sie einen leeren Kippmülltrog in Position C.Laden Sie dann Filterspitzenboxen mit entfernten Deckeln auf Position D auf dem Instrumententisch, so dass alle Lichter grün werden. Als nächstes entfernen Sie die Klebedichtung, bevor Sie die Probenplatte an Position F des Instrumentendecks laden, so dass das Licht grün wird. Laden Sie auch eine leere 96-Well-Platte, die in einen kühlen Block gelegt wird, der bei minus 20 Grad Celsius an Position G vorgekühlt ist, so dass das Licht grün wird.Klicken Sie auf dem Touchscreen des Instruments auf Tröpfchengenerierung starten, und der Deckel des Tröpfchengenerators schließt sich automatisch. Sobald die Tröpfchenerzeugung abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Probenentnahmeplatte visuell, um zu bestätigen, dass in jedem Bohrloch eine Tröpfchenemulsionsschicht über der Ölphase vorhanden ist. Als nächstes schalten Sie die Plattenversiegelung ein und stellen die Temperatur auf 180 Grad Celsius und die Versiegelungszeit auf fünf Sekunden ein.Lassen Sie die Maschine die Betriebstemperatur erreichen. Legen Sie dann die Probenentnahmeplatte auf den Plattenhalter des Plattenversiegelers und legen Sie eine frische Foliendichtung mit der roten Linie nach oben auf die Platte. Wenn die Plattenversiegelung ihre Betriebstemperatur erreicht hat, drücken Sie auf dem Touchscreen des Instruments auf Auswurf.Nachdem Sie den Plattenhalter in die Schublade der Plattenversiegelung gelegt haben, drücken Sie das Siegel, um die Schublade zu schließen. Sobald die Versiegelung abgeschlossen ist, öffnet sich die Schublade automatisch. Entfernen Sie die versiegelte Platte und legen Sie sie auf den kalten Block.Schalten Sie dann die Plattenversiegelung aus. Um die PCR auszuführen, legen Sie die versiegelte Tröpfchensammelplatte in ein PCR-Gerät mit einem 96-Tiefbrunnenblock. Schalten Sie nach Abschluss der PCR den Tröpfchenleser und den angeschlossenen Computer ein.Laden Sie die Platte mit den Post-PCR-Proben in den Plattenhalter des Tröpfchenlesers. Während Sie den Foliendeckel auf der Probenplatte halten, legen Sie die Abdeckung auf die Oberseite der Halterung und sichern Sie sie mit schwarzen Verriegelungsclips. Um den Deckel des Tröpfchenlesers zu öffnen, drücken Sie anschließend die Öffnungs-/Schließtaste.Laden Sie dann den Tröpfchen-Reader-Plattenhalter mit der Probenplatte in die Lesekammer und legen Sie ihn sicher auf den Magnetfuß. Drücken Sie erneut die Öffnungs-/Schließtaste, um den Deckel zu schließen. Öffnen Sie die Schnittstelle der Analysesoftware.Wählen Sie die Registerkarte Platte hinzufügen aus, klicken Sie auf Platte hinzufügen, und klicken Sie dann auf Platte konfigurieren. Geben Sie auf der Registerkarte Platteninformationen einen Plattennamen ein, wählen Sie Supermix für Sonden, Kein DUTP aus dem Dropdown-Menü Supermix aus, und geben Sie einen Dateinamen unter Datendatei speichern As.In der Registerkarte Bohrlochauswahl ein, markieren Sie die zu analysierenden Vertiefungen und klicken Sie auf Ausgewählte Vertiefungen einschließen. Wählen Sie dann auf der Registerkarte Bohrlochinformationen die Bohrlöcher aus, die mit Anmerkungen versehen werden sollen.Wählen Sie im Dropdown-Menü Experimenttyp die Option Direkte Quantifizierung aus. Füllen Sie dann die Felder Probenbeschreibung, Probentyp und Zielname aus, und fügen Sie bei Bedarf Bohrlochnotizen und/oder Plattennotizen hinzu. Klicken Sie dann auf Übernehmen.Sobald die Plattenkonfiguration abgeschlossen ist, klicken Sie auf Start Run. Wählen Sie für die Ergebnisanalyse die Registerkarte Datenanalyse und öffnen Sie die zu analysierende Datei im Menü Meine Datendateien. Klicken Sie dann auf die Registerkarte 1D-Amplitude für einfarbige Experimente oder die Registerkarte 2D-Amplitude für zweifarbige Experimente.Wählen Sie als Nächstes die Vertiefungen aus, für die ein Schwellenwert erforderlich ist. Verwenden Sie das Werkzeug Schwellenwertlinienmodus, um den Schwellenwert manuell in den freien Raum zwischen den positiven und negativen Grundgesamtheiten im Amplitudendiagramm anzuwenden, und stellen Sie sicher, dass das Fadenkreuz so platziert wird, dass die vier Tröpfchenpopulationen deutlich voneinander getrennt sind. Sobald der Schwellenwert für alle Proben angewendet wurde, exportieren Sie die Ergebnisse zur weiteren Analyse als CSV-Datei, indem Sie auf die Registerkarte Datentabelle, Importieren/Exportieren, klicken und Sichtbare Daten in CSV exportieren auswählen.Geben Sie einen geeigneten Dateinamen ein und klicken Sie auf Speichern. Die in diesem Protokoll verwendeten PCR- und Tröpfchenleseverfahren zeigten das Vorhandensein klar getrennter Populationen positiver und negativer Tröpfchen, sowohl im Fam- als auch im Hex-Kanal. Mitochondriale DNA-Populationen, die für beide Sonden positiv waren, konnten auch von Einzelzelllysaten unterschieden werden.Diese Methode zeigte auch, dass für Proben mit Deletionen in der mitochondrialen DNA eine gemischte Population von doppelt positiven Tröpfchen und Tröpfchen vorhanden ist, die nur für den nicht gelöschten Teil der DNA positiv sind. Diese Methode wurde erfolgreich verwendet, um die mitochondriale DNA-Kopienzahl pro Zelle in einer Vielzahl von Säugetierzellen, einschließlich Mauseizellen und primären embryonalen Zellen der Maus, zu zählen. Darüber hinaus wurde in Zellen mit hoher Deletionsheteroplasmie festgestellt, dass die Population, die für eine einzelne Sonde positiv war, signifikant größer war als die doppelt positive Population.In Zellen mit Heteroplasmatik mit niedriger Deletion waren beide Populationen jedoch von ähnlicher Größe. Daher stellen genaue Ergebnisse immer sicher, dass die Tröpfchenerzeugung erfolgreich war und dass der Schwellenwert mithilfe der 1D- oder 2D-Amplitudenansicht entsprechend angewendet wurde. Unverwendetes Lysat kann für andere Einzelzellassays wie Pyrosequenzierung verwendet werden, die Einzelnukleotid-Polymorphismus-Heteroplasmen messen können.Die Entwicklung dieser Technik hat es uns ermöglicht, genaue Messungen der mitochondrialen DNA-Kopienzahl und Deletionsheteroplasmie in einzelnen Zellen durchzuführen, was bisher nicht möglich war.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

In diesem Video präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Erzeugung von emulgierten Nanotröpfchen zum Nachweis von Zielnukleinsäuren durch digitale Polymerase-Kettenreaktion oder dPCR.

Tröpfchen-Digitalpolymerase-Kettenreaktion: Eine Methode zur Erzeugung von Nanotröpfchen-PCR-Reaktionen zum Nachweis seltener Tumormutationen

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Dieses Video demonstriert die Multiplex-Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktionstechnik zur gleichzeitigen Quantifizierung von methylierten DNA-Regionen in verschiedenen Populationen weißer Blutkörperchen als frühen Biomarker für die klinische Diagnose und Prognose.

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Hier präsentieren wir ein Protokoll, um mehrere genetische Veränderungen der Zielregion in einer einzelnen Reaktion mit Drop-off-DdPCR und ein einzigartiges paar Hydrolyse Sonden genau zu quantifizieren.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Epigenetische Marker werden für die Untertypisierung von weißen Blutkörperchen (WBC) durch die Quantifizierung von DNA-Methylierungsmustern verwendet. Dieses Protokoll stellt ein Multiplex-Droplet-Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (mdPCR) unter Verwendung eines thermoplastischen Elastomer(TPE)-basierten mikrofluidischen Geräts zur Tröpfchenerzeugung dar, das eine präzise und Multiplexmethylierungsspezifische Zielquantifizierung von WBC-Differentialzählungen ermöglicht.

Methylierung spezifische Multiplex Droplet PCR mit Polymer Droplet Generator Gerät für die hämatologische Diagnostik

Pyrosequenzierungsassays ermöglichen die robuste und schnelle Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen der mitochondrialen DNA in heteroplasmatischen Zellen oder Geweben.

Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen im mitochondrialen Genom durch Pyrosequenzierung

Es wird ein Verfahren zur Untersuchung der Dynamik des mitochondrialen DNA-Stoffwechsels (mtDNA) in Zellen unter Verwendung eines Multi-Well-Plattenformats und automatisierter Immunfluoreszenzbildgebung zum Nachweis und zur Quantifizierung der mtDNA-Synthese und -Verteilung beschrieben. Dies kann weiter genutzt werden, um die Auswirkungen verschiedener Inhibitoren, zellulärer Belastungen und Genstilllegung auf den mtDNA-Stoffwechsel zu untersuchen.

Bildbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung

Diese Studie präsentiert eine schnelle ddPCR-Methode zur Quantifizierung des Bodenmikroorganismus-Biomasse- und Pilz-zu-Bakterien-Verhältnisses. Obwohl ddPCR-abgeleiteter mikrobieller Biomassekohlenstoff nur eine schwache Korrelation mit Chloroform-Fumigationsschätzungen aufweist, bietet die Methode einen sensiblen, skalierbaren molekularen Ansatz zur Beurteilung der mikrobiellen Häufigkeit ohne zusätzliche Bodenprobennahmen oder den Einsatz von Härte.

Bestimmung der mikrobiellen Biomasse im Boden mittels Digital Droplet PCR (ddPCR)

Erfahren Sie die digitale Tröpfchen-PCR zur präzisen Messung der mitochondrialen DNA-Kopienzahl und Deletionsheteroplasmie in einzelnen Zellen. Diese Methode ermöglicht Forschern detaillierte Einblicke in mitochondriale Dynamiken.

Messung der einzelligen mitochondrialen DNA-Kopienzahl und Heteroplasmie mittels digitaler Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

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