Name: Immunmarkierung und Zählbandsynapsen bei jungen Erwachsenen und älteren Rennmaus-Cochleae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Lernen Sie die Immunmarkierung und Quantifizierung von Bändersynapsen in Rennmaus-Cochleae zur Analyse altersbedingter synaptischer Degeneration. Diese Methode liefert quantitative Daten für die Hörforschung.

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Die Autoren danken Lichun Zhang für die Hilfe bei der Etablierung der Methode und der Serviceeinheit Fluoreszenzmikroskopie, Carl von Ossietzky Universität Oldenburg, für die Nutzung der bildgebenden Einrichtungen. Diese Forschung wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie EXC 2177/1 gefördert.

<ol><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+and+age-related+hearing+loss%3A+new+perspectives+and+potential+therapies+%5Bversion+1%3B+peer+review%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review.</a> F1000Research. 6 (927), (2017).</li>
<li>Heeringa, A. N., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+cochlea%3A+Towards+unraveling+the+functional+contributions+of+strial+dysfunction+and+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing%22%5BJournal%5D)">The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy.</a> Hearing. 376, 111-124 (2019).</li>
<li>Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+gradients+of+ribbon+size+and+AMPA+receptor+expression+underlie+sensitivity+differences+among+cochlear-nerve%2Fhair-cell+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).</li>
<li>Khimich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+synaptic+ribbons+are+essential+for+synchronous+auditory+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling.</a> Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).</li>
<li>Pangršič, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+requires+otoferlin-dependent+efficient+replenishment+of+synaptic+vesicles+in+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells.</a> Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).</li>
<li>Meyer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+synapse+number%2C+structure+and+function+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea.</a> Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).</li>
<li>Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+gradients+of+ribbon+volume+and+AMPA-receptor+patch+volume+in+cochlear+afferent+synapses+on+gerbil+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells.</a> Hearing Research. 364, 81-89 (2018).</li>
<li>Steenken, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decline+in+cochlear+ribbon+synapses+and+its+relation+to+different+metrics+of+auditory-nerve+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity.</a> Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).</li>
<li>Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+differences+among+afferent+synapses+on+cochlear+hair+cells%3A+Correlations+with+spontaneous+discharge+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate.</a> Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).</li>
<li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li>
<li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li>
<li>Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olivocochlear+innervation+maintains+the+normal+modiolar-pillar+and+habenular-cuticular+gradients+in+cochlear+synaptic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).</li>
<li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes%2C+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB%2FnJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6 (1), 25056(2016).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+gradients+in+inner+hair+cell-auditory+nerve+fiber+pre-+and+postsynaptic+proteins+differ+across+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains.</a> Hearing Research. 390, 107933(2020).</li>
<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li>
<li>Bourien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+auditory+nerve+fibers+to+compound+action+potential+of+the+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve.</a> Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).</li>
<li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+cochlear+synaptopathy%3A+An+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li>
<li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis%3A+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li>
<li>Batrel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+potentials+recorded+at+the+round+window+enable+the+detection+of+low+spontaneous+rate+fibers+in+gerbil+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0169890(2017).</li>
<li>Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss+in+gerbil%3A+Round+window+assays+of+synapse+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978(2021).</li>
<li>Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+auditory+thresholds+and+loss+of+ribbon+synapses+at+inner+hair+cells+in+aged+gerbils%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils.</a> Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).</li>
<li>Cheal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gerbil%3A+A+unique+model+for+research+on+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Aging+Research%22%5BJournal%5D)">The gerbil: A unique model for research on aging.</a> Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).</li>
<li>Gates, G. A., Mills, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presbycusis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Presbycusis.</a> The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).</li>
<li>Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+sensitivity+of+the+gerbil%2C+Meriones+unguiculatis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li>
<li>Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cochlear+place-frequency+map+of+the+adult+and+developing+gerbil%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+intact+rodent+organ+of+Corti+for+RNAscope+and+immunolabeling%2C+confocal+microscopy%2C+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100544(2021).</li>
<li>Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+migration+and+reorganization+after+noise+exposure+suggests+regeneration+in+a+mature+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19945(2020).</li>
<li>Gray, D. A., Woulfe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin+and+aging%3A+a+matter+of+toxic+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+Aging+Knowledge+Environment%3A+SAGE+KE%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste.</a> Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1(2005).</li>
<li>Li, H. -S., Hultcrantz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+degeneration+of+the+organ+of+Corti+in+two+genotypes+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ORL%3B+Journal+for+Oto-rhino-laryngology+and+Its+Related+Specialties%22%5BJournal%5D)">Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice.</a> ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).</li>
<li>Kobrina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+anatomical+and+physiological+markers+of+auditory+system+degeneration+with+behavioral+hearing+assessments+in+a+mouse+%28Mus+musculus%29+model+of+age-related+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss.</a> Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).</li>
<li>Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+role+of+lipofuscin+in+age-related+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 464(2018).</li>
<li>Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+myocardial+tissue+with+digital+autofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+Informatics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy.</a> Journal of Pathology Informatics. 7, 15(2016).</li>
<li>Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+gradients+in+the+size+of+inner+hair+cell+ribbons+emerge+before+the+onset+of+hearing+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).</li>
<li>Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neural+degeneration+in+the+human+cochlea%3A+Evidence+for+hidden+hearing+loss+in+the+aging+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear.</a> Neuroscience. 407, 8-20 (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Mit der in diesem Protokoll beschriebenen Methode ist es möglich, IHCs und synaptische Strukturen in Cochleae von jungen erwachsenen und gealterten Rennmäusen zu immunisieren, vermutete funktionelle Synapsen durch Kolokalisierung prä- und postsynaptischer Elemente zu identifizieren, sie einzelnen IHCs zuzuordnen und ihre Anzahl, ihr Volumen und ihre Position zu quantifizieren. Die bei diesem Ansatz verwendeten Antikörper markierten auch äußere Haarzellen (OHCs; myoVIIa) und ihre präsynaptischen Bänder. Darüber hinaus ist...

Altersbedingter Hörverlust ist eine der weltweit am weitesten verbreiteten Krankheiten, von der mehr als ein Drittel der Weltbevölkerung im Alter von 65 Jahren und älter betroffenist 1. Die zugrunde liegenden Ursachen werden noch diskutiert und aktiv untersucht, können aber den Verlust der spezialisierten Synapsen umfassen, die innere Haarzellen (IHCs) mit afferenten Hörnervenfasern verbinden2. Diese Bandsynapsen bestehen aus einer präsynaptischen Struktur, an die Vesikel mit dem daran gebundenen Neurotransmitter Glutamat gefüllt sind, sowie aus postsynaptischen α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionsäure (AMPA)-Glutamatrezeptoren 3,4,5. In der Rennmaus berühren ~ 20 afferente Hörnervenfasern eine IHC 6,7,8. Fasern auf dem IHC, die dem Modiolus zugewandt sind, stehen großen synaptischen Bändern gegenüber, während die Fasern, die sich auf der Säulenseite des IHC verbinden, kleinen synaptischen Bändern gegenüberstehen (dh bei Katzen9, Rennmäusen7, Meerschweinchen 10 und Mäusen 3,11,12,13,14). Darüber hinaus sind bei der Rennmaus die Größe der präsynaptischen Bänder und der postsynaptischen Glutamatflecken positiv korreliert 7,14. Fasern, die großen Bändern auf der modiolären Seite des IHC entgegengesetzt sind, sind kleinkalibrig und haben niedrige spontane Raten und hohe Schwellen15. Es gibt Hinweise darauf, dass Fasern mit niedriger spontaner Rateanfälliger für Lärmexposition 10 und ototoxische Medikamente 16 sind als hochspontane niedrigschwellige Fasern, die sich auf der Säulenseite von IHCs15 befinden.
Der Verlust von Bandsynapsen ist das früheste degenerative Ereignis bei altersbedingtem Hörverlust im Cochlea-Neuralbereich, während der Verlust von Spiralganglionzellen und ihren afferenten Hörnervenfasern hinter17,18 zurückbleibt. Elektrophysiologische Korrelate umfassen Aufzeichnungen von auditiven Hirnstammreaktionen17 und zusammengesetzten Aktionspotentialen8; Diese spiegeln jedoch nicht die Feinheiten des Synapsenverlustes wider, da Fasern mit niedriger spontaner Rate nicht zu diesen Maßnahmen beitragen16. Weitere vielversprechende elektrophysiologische Metriken sind der vom Massenpotential abgeleitete neuronale Index19 und die peristimulus time response20. Diese sind jedoch nur dann zuverlässig, wenn das Tier keine anderen Cochlea-Pathologien hat, abgesehen vom Verlust der Hörnervenfasern, die die Aktivität der verbleibenden Hörnervenfasern beeinflussen8. Darüber hinaus wurden verhaltensbezogene Schwellenwerte in der Rennmaus nicht mit Synapsenzahlen21 korreliert. Eine zuverlässige Quantifizierung der überlebenden Bandsynapsen und damit der Anzahl der funktionellen Hörnervenfasern ist daher nur durch direkte Untersuchung des Cochlea-Gewebes möglich.
Die Mongolische Rennmaus (Meriones unguiculatus) ist ein geeignetes Tiermodell zur Untersuchung von altersbedingtem Hörverlust. Es hat eine kurze Lebensdauer, hat ein niederfrequentes Gehör ähnlich dem Menschen, ist leicht zu pflegen und zeigt Ähnlichkeiten mit menschlichen Pathologien im Zusammenhang mit altersbedingtem Hörverlust 2,22,23,24. Rennmäuse gelten als gealtert, wenn sie 36 Monate alt sind, was dem Ende ihrer durchschnittlichen Lebensdauervon 22 entspricht. Wichtig ist, dass ein altersbedingter Verlust von Bandsynapsen bei Rennmäusen nachgewiesen wurde, die in ruhigen Umgebungen aufgezogen und gealtert sind 8,21.
Hier wird ein Protokoll zur Immunmarkierung, Sezierung und Analyse von Cochleae von Rennmäusen unterschiedlichen Alters, von jungen Erwachsenen bis zu älteren Menschen, vorgestellt. Antikörper, die gegen Komponenten der Präsynapse (CtBP2), postsynaptische Glutamatrezeptorpflaster (GluA2) und IHCs (myoVIIa) gerichtet sind, werden verwendet. Es wird ein Autofluoreszenz-Quencher angewendet, der den Hintergrund in gealterten Cochleae reduziert und das Fluoreszenzsignal intakt lässt. Weiterhin wird beschrieben, wie die Cochlea zu sezieren ist, um sowohl das sensorische Epithel als auch die Stria vascularis zu untersuchen. Die Cochlea-Länge wird gemessen, um die Auswahl verschiedener Cochlea-Positionen zu ermöglichen, die bestimmten besten Frequenzenentsprechen 25. Die Quantifizierung von Synapsenzahlen erfolgt mit der frei verfügbaren Software ImageJ26. Eine zusätzliche Quantifizierung von Synapsenvolumina und -positionen innerhalb des einzelnen HC erfolgt mit einer in Matlab benutzerdefinierten Software. Diese Software wird nicht öffentlich zugänglich gemacht, da den Autoren die Ressourcen fehlen, um professionelle Dokumentation und Unterstützung bereitzustellen.

<table><tbody><tr><td>Albuminfraktion V biotinfrei</td><td>Carl Roth</td><td>0163.2</td><td></td></tr><tr><td>anti-CtBP2 (IgG1 monoklonale Maus)</td><td>BD Biosciences, Eysins</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>anti-GluA2 (IgG2a monoklonale Maus)</td><td>Millipore</td><td>MAB39</td><td></td></tr><tr><td>anti-Maus (IgG1)-AF 488</td><td>Molecular Probes Inc.</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyosinVIIa (polyklonales IgG-Kaninchen)</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25e6790</td><td></td></tr><tr><td>Klingenhalter & Breaker - Flat Jaws</td><td>Fine Science Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Bonn Artery Scissors - Kugelspitze</td><td>Fine Science Tools</td><td>14086-09</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas Dicke 1,5H, 24 x 60 mm</td><td>Carl Roth</td><td>LH26.1</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-OP-Klinge</td><td>Henry Schein</td><td>0473</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen (IgG)-AF647</td><td>Life Technologies-Molekulare Sonden</td><td>A-31573</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, absolut 99,8%</td><td>Fisher Scientific</td><td>12468750</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Carl Roth</td><td>8040.2</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feder Doppelklinge</td><td>PLANO</td><td>112-9</td><td></td></tr><tr><td>G19 Kanüle</td><td>Henry Schein</td><td>9003633</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus (IgG2a)-AF568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21134</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.04</td><td></td></tr><tr><td>Huygens Essentials</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Fidschi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol, Immersionsöl 518F</td><td>Carl Zeiss</td><td>10539438</td><td></td></tr><tr><td>Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)</td><td>Braun</td><td>4062957E</td><td></td></tr><tr><td>ISM596D</td><td>Ismatec</td><td></td><td>Schlauchpumpe</td></tr><tr><td>KL 1600 LED</td><td>Schott</td><td>150.600</td><td>Lichtquelle für Stereomikroskop</td></tr><tr><td>Leica Application Suite X</td><td>Leica Microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 System</td><td>Leica Microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The Mathworks Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mayo Schere Wolframcarbide ToghCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14512-17</td><td></td></tr><tr><td>Mini-100 Orbital-Genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-M100</td><td>für den Einsatz in kalter Umgebung</td></tr><tr><td>Narcoren (Pentobarbital)</td><td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ni-Ei</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon Europe B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale ohne Entlüftung</td><td>Avantor VWR</td><td>390-1375</td><td></td></tr><tr><td><stark>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung:</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dinatriumphosphat</td><td>AppliChem</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Monokaliumphosphat</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434-M</td><td></td></tr><tr><td>Schraubverschlussbehälter</td><td>Sarstedt</td><td>75.562.300</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Carl Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>Student Adson-Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>Student Halsted-Mosquito Hämostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Adhäsionsmikroskop-Objektträger</td><td>Epredia</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X</td><td>Carl Roth</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>TrueBlack Lipofuszin Autofluoreszenz-Quencher</td><td>Biotium</td><td>23007</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Federschere, 3mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Eindeckmedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vibrax VXR basic</td><td>IKA</td><td>0002819000</td><td></td></tr><tr><td>VX 7 Schüsselaufsatz für Vibrax VXR basic</td><td>IKA</td><td>953300</td><td></td></tr><tr><td>Wild TYP 355110 (Stereomikroskop)</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td>nicht mehr lieferbar</td></tr></tbody></table>

immunmarkierung und zählbandsynapsen bei jungen erwachsenen und älteren rennmaus-cochleae

Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

Es wird angenommen, dass der Verlust von Bandsynapsen, die innere Haarzellen und afferente Hörnervenfasern verbinden, eine Ursache für altersbedingten Hörverlust ist. Die gebräuchlichste Methode zum Nachweis des Verlustes von Bandsynapsen ist die Immunmarkierung, da sie eine quantitative Probenahme von mehreren tonotopischen Stellen in einer einzelnen Cochlea ermöglicht. Die interessierenden Strukturen sind jedoch tief im Inneren der knöchernen Cochlea vergraben. Rennmäuse werden als Tiermodell für altersbedingten Hörverlust verwendet. Hier werden Routineprotokolle für die Fixierung, die Immunmarkierung von Gerbil-Cochlea-Ganzkörpern, konfokale Bildgebung und die Quantifizierung von Bandsynapsenzahlen und -volumina beschrieben. Darüber hinaus werden die besonderen Herausforderungen hervorgehoben, die mit der Beschaffung von gutem Material von wertvollen alternden Menschen verbunden sind. 
Rennmäuse werden eingeschläfert und entweder kardiovaskulär durchblutet, oder ihre Paukenfelle werden vorsichtig aus dem Schädel seziert. Die Cochleae werden an der Spitze und Basis geöffnet und direkt auf das Fixiermittel übertragen. Unabhängig von der Ausgangsmethode werden die Cochleae postfixiert und anschließend entkalkt. Das Gewebe wird dann mit primären Antikörpern gegen prä- und postsynaptische Strukturen und Haarzellen markiert. Als nächstes werden die Cochleae mit sekundären fluoreszenzmarkierten Antikörpern inkubiert, die spezifisch gegen ihre jeweiligen primären Antikörper sind. Die Cochleae gealterter Rennmäuse werden dann mit einem Autofluoreszenz-Quencher behandelt, um die typischerweise erhebliche Hintergrundfluoreszenz älterer Tiergewebe zu reduzieren. 
Schließlich werden Cochleae in 6-11 Segmente zerlegt. Die gesamte Cochlea-Länge wird so rekonstruiert, dass bestimmte Cochlea-Stellen zuverlässig zwischen Individuen bestimmt werden können. Konfokale Bildstapel, die sequentiell aufgenommen werden, helfen, Haarzellen und Synapsen an den ausgewählten Stellen zu visualisieren. Die konfokalen Stapel werden dekonvolutiert, und die Synapsen werden entweder manuell mit ImageJ gezählt, oder eine umfangreichere Quantifizierung synaptischer Strukturen wird mit Bildanalyseverfahren durchgeführt, die speziell in Matlab geschrieben wurden.

Cochleae wurden entweder nach kardiovaskulärer Durchblutung mit Fixierung des gesamten Tieres geerntet oder nach dem Einschläfern des Tieres schnell seziert und in die Immersion fixiert. Bei der letzteren Methode blieben die IHCs während der Dissektion an Ort und Stelle, während bei erfolgloser Perfusion und damit unzureichend fixiertem Gewebe das sensorische Epithel häufig zerstört wurde. Beachten Sie, dass die Autoren auf Fälle stießen, in denen die Fixierung der Cochleae nach transkardialer Perfusion unzureichend war,...

Es wird ein Protokoll zur Verarbeitung von Cochleae für junge Erwachsene und ältere Rennmäuse durch Immunmarkierung der afferenten synaptischen Strukturen und Haarzellen, Abschreckung der Autofluoreszenz in gealtertem Gewebe, Sezieren und Abschätzen der Länge der Cochleae und Quantifizierung der Synapsen in Bildstapeln vorgestellt, die mit konfokaler Bildgebung erhalten wurden.

Immunmarkierung und Zählbandsynapsen bei jungen Erwachsenen und älteren Rennmaus-Cochleae

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Bewertung der synaptischen Integrität in der Cochlea der Rennmaus jeden Alters. Dies ist wichtig für die Grundlagenforschung zu Hörproblemen, insbesondere aufgrund des Alterns. Das Protokoll ist relativ schnell und liefert quantitative Daten von mehreren Stellen entlang der Cochlea.Darüber hinaus adressiert es ein spezifisches Problem der Gewebealterung durch die Verwendung eines Autofluoreszenz-Quenchers. Die Degeneration von Synapsen ist das früheste Anzeichen für einen Funktionsverlust in der Cochlea. Die Quantifizierung ist ein wichtiges Instrument in der Forschung zur Entwicklung nicht-invasiver Diagnosewerkzeuge für die Synaptopathie.Die Cochlea-Dissektion ist der wichtigste Teil, der geübt werden muss, daher ist es besser, mit nicht-experimentellen Cochli zu beginnen. Beginnen Sie mit dem Entfernen der Bullae. Schneiden Sie den Knochen mit einer Schere ab oder knacken Sie den Knochen mit einer Pinzette und entfernen Sie ihn mit einer Pinzette, um die Cochlea zu erreichen.Entfernen Sie die Kanäle Malleus, Incus und Halbkreis. Entfernen Sie vorsichtig den Knochen, der die Spitze der Cochlea bedeckt, und kratzen Sie den Cochlea-Knochen mit einer Pinzette, um kleine Löcher an der Spitze und in der basalen Drehung zu machen, oder stechen Sie vorsichtig Löcher an beiden Stellen. Übertragen Sie die Bullen sofort in mindestens 50 Milliliter kaltes Fixiermittel.Um das Cochli in zwei Hälften zu schneiden, positionieren Sie ein Stück Rasierklinge, das länger als die gewickelte Länge der Cochlea ist, in einen Klingenhalter. Dann legen Sie die Cochlea in eine Petrischale unter ein Stereomikroskop. Überschüssiges Gewebe mit einer Rasierklinge oder mit einer feinen Schere wegschneiden.Halten Sie die Cochlea mit einer feinen Pinzette an Ort und Stelle und schneiden Sie sie entlang des Modiolus in zwei Hälften. Bereiten Sie eine 5%ige Lösung des Autofluoreszenzquenchers vor, indem Sie sie mit 70%igem Ethanol mischen. Legen Sie das Cochli in diese Lösung und inkubieren Sie es für eine Minute bei Raumtemperatur auf einem Shaker, gefolgt von dreimal mit einem Milliliter PBS für fünf Minuten.Für die Sezierung der Cochlea sammeln Sie zwei feine Pinzetten, superfeine Pinzetten, Vannas, Federschere, einen Klingenhalter, eine Rasierklinge und füllen Sie die Polystyrol-Petrischale und ihren Deckel mit PBS. Brechen Sie Stücke von der Rasierklinge, um eine Schnittfläche von zwei bis vier Millimetern zu erhalten. Schneiden Sie die Cochlea in zwei Hälften, wie im Abschnitt zur Gewebepräparation gezeigt.Befestigen Sie die Cochlea-Hälfte vorsichtig mit der Pinzette, so dass die Schnittkante nach oben zeigt. Verwenden Sie eine feine Federschere, um den Knochen der Cochlea über dem Helicotrema, das die Spitze bedeckt, abzuschneiden. Verwenden Sie dann eine Schere, um die apikale Drehung zu isolieren, indem Sie den Modiolus und den Hörnerv sowie die Scala vestibuli durchschneiden.Machen Sie zwei Schnitte auf jeder Seite des Cochlea-Knochens oben, oder, wenn die Stria vascularis nicht für die weitere Beurteilung benötigt wird, direkt durch die Stria vascularis der mittleren Runde. Verwenden Sie die Rasierklinge, um die Cochlea-Stücke zu trennen. Alternativ zwischen dem Corti-Organ und dem Stria vascularis schneiden.Lassen Sie die Stria vascularis mit dem Spiralband verbunden und entfernen Sie den entkalkten Knochen mit einer Pinzette. Als nächstes geben Sie die Cochlea-Stücke in einen mit PBS gefüllten Petrischalendeckel. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe an den Säulen- und Modiolarseiten, so dass die gesamten Halterungen später so flach wie möglich auf dem Objektträger liegen.Große Cochleastücke, insbesondere solche, die aus der basalen Windung stammen, sollten in zwei Stücke geschnitten werden. Entfernen Sie vorsichtig die tektoriale Membran mit einer superfeinen Pinzette. Legen Sie die Cochlea-Stücke auf einen Objektträger in einen Tropfen Montagemedium, um sicherzustellen, dass das Corti-Organ nach oben zeigt.Verschieben Sie das Cochlea-Stück in die Sagittalebene und suchen Sie nach einer Invagination des spiralförmigen Limbus in unmittelbarer Nähe zu den inneren Haarzellen. Diese Invagination des spiralförmigen Limbus ist in den mittleren und basalen Cochlea-Stücken deutlicher zu sehen. Übertragen Sie die gesamte Cochlea und die gesamte Stria vascularis auf den Objektträger, indem Sie diese Schritte wiederholen.Deckel schieben Sie den Schlitten und fügen Sie schwarzen Nagellack an den Rändern zum Abdichten hinzu. Im Dunkeln trocknen und bei vier Grad Celsius lagern. Öffnen Sie eine Kopie der dekonvolvierten Stacks in der ImageJ-Software, die mit dem BioVoxxel-Plugin geladen ist.Teilen Sie die Kanäle auf, indem Sie auf Bild, dann auf Farbe und dann auf Kanäle aufteilen klicken. Führen Sie sie zusammen, indem Sie auf Bild, dann auf Farbe und dann auf Kanäle zusammenführen klicken, um verschiedene Farben zuzuweisen. Konvertieren Sie das Bild in einen RGB-Stapel, indem Sie auf Bild klicken, dann zu Farbe gehen und auf Stapeln in RGB klicken.Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an, indem Sie auf Bild, Anpassen und dann auf Helligkeit/Kontrast klicken. Verwenden Sie entweder Auto oder Slider, um sicherzustellen, dass sich die prä- und postsynaptischen Strukturen und die Markierungen der inneren Haarzellen vom Hintergrund unterscheiden. Beschriften Sie fünf innere Haarzellen mit dem Textwerkzeug, indem Sie auf die gewünschte Stelle innerhalb des Stapels klicken.Wechseln Sie als Nächstes zu Analysieren, dann zu Tools, und wählen Sie ROI Manager aus. Aktivieren Sie die Beschriftungen des Kontrollkästchens, um die Punkte mit einer Nummer zu kennzeichnen. Zoomen Sie auf die innere Haarzelle von Interesse.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktwerkzeug, um den Mehrpunktmodus zu wählen. Scrollen Sie durch die Z-Dimension und zählen Sie die funktionellen Bandsynapsen, die durch ein präsynaptisches Band in Gegenüberstellung zu einem postsynaptischen Glutamatpflaster identifiziert werden. Nachdem Sie alle gewünschten Strukturen ausgewählt haben, klicken Sie auf ROI-Manager hinzufügen, klicken Sie dann auf den beliebigen Namen und wählen Sie Umbenennen.Passen Sie mit dem Handwerkzeug das Bild so an, dass die nächste innere Haarzelle vollständig angezeigt wird. Wechseln Sie von Mehrpunktwerkzeug zu Punktwerkzeug, um zu vermeiden, dass den zuvor gespeicherten Daten mehr Puncta hinzugefügt wird. Klicken Sie auf eine interessante Struktur in der nächsten inneren Haarzelle und wechseln Sie zum Multi-Point-Tool.Fahren Sie mit dem Hinzufügen der funktionellen Bandsynapse im ROI-Manager fort, bis alle inneren Haarzellen ausgewertet sind. Klicken Sie im ROI Manager auf einen Datensatz und dann auf Measure. Warten Sie, bis ein neues Fenster erscheint, das die gemessenen Datenpunkte auflistet, und klicken Sie auf Datei und Speichern unter, um diese Liste als Tabellenkalkulation zu speichern.Speichern Sie das Bild, indem Sie im ROI-Manager Alle anzeigen aktivieren. Klicken Sie auf Reduzieren, um die Punktbeschriftungen dauerhaft zum Stapel hinzuzufügen, und klicken Sie auf Zustimmen, um die Änderungen zu speichern. Z-Stack-Projektionen aus der Cochlea einer jungen Rennmaus im Alter von 10 Monaten zeigen, dass die Myosin 7A-markierten inneren Haarzellen, die hier durch weiß gestrichelte Linien umrissen wurden, in scharfem Kontrast zum Hintergrund standen.Die präsynaptischen Bänder wurden mit Anti-CtBP2 markiert, zwei in Grün dargestellt, während die postsynaptischen Glutamat-Patches mit Anti-GluA2 in Rot markiert waren. Die Cochlea einer alten Rennmaus im Alter von 38 Monaten wurde mit dem Autofluoreszenz-Quencher behandelt und zeigte ausgeprägte innere Haarzellen mit deutlich sichtbaren prä- und postsynaptischen Strukturen. Um die Stabilität der Immunmarkierung zu testen, wurde das gleiche Stück Cochlea von der jungen Rennmaus nach drei Monaten und 29 1/2 Monaten abgebildet.Trotz des reduzierten Signal-Rausch-Verhältnisses waren die funktionellen Synapsen unterschiedlich und quantifizierbar. Selbst wenn ein Schnitt fehlschlägt, montieren Sie das restliche Stück Gewebe, um später die volle Cochlea-Länge am genauesten zu schätzen. Die Daten aus diesem Protokoll sind besonders wertvoll, wenn elektrophysiologische oder psychophysische Hörtests vorangestellt sind und dann individuell mit ihnen korreliert werden.

immunolabeling-counting-ribbon-synapses-young-adult-aged-gerbil

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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