Schnelle viskoelastische Charakterisierung von Atemwegsschleim mit einem Tischrheometer

Muko-obstruktive Erkrankungen sind durch eine abnormale Viskosität des Atemwegsschleims gekennzeichnet. Das Protokoll zeigt, wie man Rheologie verwendet, um die Schleimviskosität zu quantifizieren und Daten zu analysieren, um Schleim-Targeting-Behandlungen zu testen. Die Schleimrheologie liefert spezifische quantitative Biomarker.

Die Verwendung eines Tischgeräts vereinfacht die Logistik der Messung dieser Biomarker in klinischen Proben wie menschlichen Sputumproben erheblich. Die Verwendung der Schleimrheologie als Diagnoseinstrument für obstruktive Erkrankungen ist nach wie vor eine Herausforderung. Eine zunehmende Anzahl von Beweisen zeigt eine starke Korrelation zwischen rheologischen Eigenschaften, Entzündungen und bakteriellen Infektionen.

Schleim ist immer an der Körperschnittstelle vorhanden, wo er schmiert und eine schützende Rolle spielt. Die Schleimrheologie kann auf andere Systeme wie die Magen-Darm- und Genitalspuren angewendet werden. Um genaue Messungen zu erhalten, ist die korrekte Handhabung und Platzierung der Probe von entscheidender Bedeutung.

Eine visuelle Demonstration kann die Präzision dieses Assays verbessern. Dieses Verfahren wird Kendall Shaffer, ein Forschungstechniker aus dem Luftlabor, demonstrieren. Beginnen Sie mit der Sortierung des gesammelten Atemwegsauswurfs oder Schleims in sterilen Probenbechern.

Im Falle von Sputum entfernen Sie überschüssigen Speichel sofort nach der Entnahme aus der Probe. Legen Sie die Proben zum Transport auf Eis. Begrenzen Sie die Transportzeit auf weniger als vier Stunden.

Analysieren Sie die Proben zum Zeitpunkt der Entnahme. Homogenisieren Sie den Schleim, indem Sie mit einer Verdrängungspipette drei- bis fünfmal vorsichtig auf und ab pipettieren. Oder direkt in die Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren.

Lagern Sie die Proben bei 80 Grad Celsius, bis sie verarbeitet sind. Aliquot die Proben für die Lagerung in Volumina größer oder gleich 500 Mikroliter, um ein ausreichendes Volumen für Experimente zu gewährleisten. Vor dem Aliquotieren frischen und gefrorenen Sputum oder Schleim direkt pipettieren oder Proben homogenisieren.

Reparieren Sie die erforderlichen Aliquots für wiederholte Messungen und Behandlungen. Inkubieren Sie die zu testenden Aliquots vor der Messung mindestens fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie zum Testen pharmakologischer Wirkstoffe hohe Konzentrationen von Stammlösungen, um eine Verdünnung der Probe zu verhindern.

Geben Sie zwischen 1% und 10% Volumen des gewünschten Reagenzes direkt auf die Probe. Stellen Sie sicher, dass kein Tropfen der Verbindung auf der Seite des Röhrchens bleibt. Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für die erforderliche Zeitspanne, um eine chemische Reaktion zu ermöglichen.

Mischen Sie die Schleimprobe und das Reagenz, indem Sie alle zwei Minuten den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens streichen, um ein progressives Eindringen des Reagenzes in die Schleimprobe zu ermöglichen, ohne das Mucinnetzwerk zu beeinträchtigen. Stellen Sie beim Vergleich mehrerer Arzneimittelreagenzien sicher, dass die Inkubationszeit ähnlich ist. Schalten Sie das Gerät ein und initialisieren Sie die Software.

Wählen Sie eine neue Messung aus. Geben Sie unter Measure-ID die Probenidentifikationsnummer und unter Operator den Namen des Operators ein, um fortzufahren. Geben Sie unter Kommentare zusätzliche Informationen oder Kommentare ein.

Wählen Sie einen Geometriesatz aus und prüfen Sie große und kleine Platten sorgfältig, um sicherzustellen, dass die Platten sauber und in einwandfreiem Zustand sind. Setzen Sie die große Platte fest auf die untere Kanzel. Setzen Sie die kleine Platte vorsichtig auf die obere Kanzel ein und verriegeln Sie die Platte, indem Sie sie leicht drehen, bis Sie ein Klicken hören, das anzeigt, dass die Platte richtig eingespannt ist.

Beachten Sie, dass die freie Schwingung der oberen Platte normal ist. Warten Sie, bis die Temperatur den Zielwert von 37 Grad Celsius erreicht. Initiieren Sie dann die automatische Kalibrierung, wie von der Software gefordert.

Mit einer Verdrängungspipette werden langsam zwischen 250 und 500 Mikroliter der Probe in der Mitte der großen Bodenplatte pipettiert. Sobald sie auf der Platte abgeschieden sind, nehmen viskose Proben eine Kuppelform an, während hochelastische Proben eine physische Trennung erfordern können. Senken Sie den Messkopf, der die kleine Platte trägt, über die Software ab und beobachten Sie die Probe.

Bei richtiger Belastung der Bodenplatte kommt die Probe in Kontakt und wird zwischen den beiden Platten zentriert. Um sicherzustellen, dass die Probe den Spalt füllt, verwenden Sie die Funktion "Reduzierter Spalt", bis die Probe nicht mehr in der bikonkaven Form oder am Rand der Platte ausgerichtet ist. Die reduzierte Spaltfunktion senkt die Messkante in 0,1-Millimeter-Schritten ab und ist auf 7 Schritte begrenzt.

Wenn nach den 7 Schritten eine Lücke verbleibt, klicken Sie auf Installation wiederholen, um zur Ausgangsposition zurückzukehren und die Position und das Volumen der Probe anzupassen. Wenn der Spalt stark reduziert wird, entfernen Sie die überschüssige Probe mit einem Spatel durch eine kreisförmige Bewegung entlang der Kante der oberen Platte. Schneiden Sie die überschüssige Probe vorsichtig ab, um Scherspannungen zu vermeiden.

Senken Sie die Schutzabdeckung ab, um eine versehentliche Projektion kontaminierter Flüssigkeiten während der Schwingung zu vermeiden. Um die Messung zu starten, klicken Sie auf Analyse starten. Ein ganzer Zyklus dauert vier bis sieben Minuten.

Vermeiden Sie es, während der gesamten Dauer des Zyklus laut zu sprechen und das Gerät oder die Bank zu berühren. Eine ruhige Umgebung ist für die ersten zwei Minuten entscheidend. Sobald der Zyklus abgeschlossen ist, klicken Sie auf Weiter, um den Messkopf zu erhöhen und den Probenanalysebericht zu erstellen.

Sobald der Messkopf vollständig eingezogen ist, heben Sie die Schutzhülle an. Entsorgen Sie die Probe und entfernen Sie die Platten vorsichtig. Reinigen und desinfizieren Sie die Teller mit warmem Wasser und Seife.

Die viskoelastischen Eigenschaften von acht Megadalton PEO wurden in fünf Konzentrationen gemessen und direkt zwischen dem ausgewerteten Tischrheometer und einem traditionellen Bulk-Rheometer verglichen. Im Gegensatz zu PEO-Lösungen stellt Status asthmaticus mucus ein festes, elastisch dominiertes Verhalten bei geringer Dehnung dar und weist bei hoher Belastung eine Frequenzweiche auf. Darüber hinaus bestätigten dreifache Messungen, die in 1,5%PEO-Lösung und klinischer Schleimprobe durchgeführt wurden, dass lineare viskoelastische Eigenschaften für die aus der biologischen Probe erhaltenen Werte sehr wiederholbar waren.

Veränderungen der viskoelastischen Eigenschaften von Schleim wurden nach der Behandlung mit einem mukolytischen Mittel gemessen. TCEP-Effekte auf die Viskoelastizität des Assay-Schleims wurden in einer klinischen Umgebung mit dem Tischrheometer getestet. Die mukolytische Behandlung führte zu einer flüssigeren Probe mit einer Abnahme des komplexen Moduls um das 4,6-fache, des Elastizitätsmoduls um das 5,1-fache, des viskosen Moduls um das 1,9-fache, der Crossover-Dehnung um das 3,3-fache und der Crossover-Fließspannung um das 5,7-fache und einer Erhöhung des Dämpfungsverhältnisses um das 2,8-fache.

Die Messung der Viskoelastizität des Atemwegsschleims in einem schnelllebigen klinischen Umfeld kann dazu beitragen, die Behandlung der Patienten von Fall zu Fall anzupassen und ein standardisiertes Protokoll für die Prüfung neuartiger pharmakologischer Verbindungen bereitzustellen. Diese Technik wird derzeit verwendet, um die Auswirkungen hochwirksamer CFTR-Modulatoren auf Mukoviszidose-Sputum zu untersuchen und die Wirksamkeit verschiedener Medikamente zur Veränderung der Schleimeigenschaften zu testen.