Kultivierung und genetische Manipulation entomopathogener Nematoden

Ein effizientes Protokoll zur Aufrechterhaltung und Amplifikation entomopathogener Nematoden ist unerlässlich, um die molekularen Grundlagen der Nematodenpathogenität und der Anti-Nematoden-Immunität des Wirts zu verstehen. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, eine hohe Anzahl von symbiotischen und axenischen Heterorhabditis-Bakteriophora und Steinernema carpocapsae IJs mit dem Insektenwirt Galleria mellonella herzustellen. Beginnen Sie, indem Sie die Petrischale mit einem Stück Filterpapier bedecken und etwa 10 bis 15 Galleria mellonella-Larven hinzufügen.

Geben Sie mit einer Pipette zwei Milliliter Wasser mit etwa 25 bis 50 infektiösen Jungtieren pro 10 Mikroliter Suspension auf die Wachswürmer ab. Und bewahren Sie die Petrischale in einem Cabinet bei Raumtemperatur auf. Je nach Feuchtigkeit des Filterpapiers alle zwei Tage ein bis zwei Milliliter Wasser dazugeben.

Wachswürmer, die mit infektiösen Jungtieren infiziert sind, sterben normalerweise innerhalb von 48 Stunden. Bereiten Sie Whites Wasserfallen etwa 10 Tage nach der Infektion der Wachswürmer mit den infektiösen Jungtieren vor. Legen Sie die toten Insekten vorsichtig auf den undurchnässten Teil des Filterpapiers.

Verwenden Sie Leitungswasser, um die untere Petrischale zu füllen, und legen Sie eine Kappe aus einem 15-Milliliter-Schlauch als Abstandshalter für die Belüftung. Verwenden Sie Leitungswasser anstelle von demineralisiertem oder entionisiertem Wasser, um eine Ansammlung von Nematoden zu vermeiden, und stellen Sie sicher, dass der Wasserstand in der Wasserfalle etwa die Hälfte der Höhe der Petrischale erreicht. Wenn das Wasser in der kleinen Petrischale durch Nematoden trüb wird, verwenden Sie eine Pipette, um die neue Generation infektiöser Jungtiere in einen T25- oder T75-Zellkulturkolben zu bringen.

Später fügen Sie Leitungswasser bis zu 40% Volumen hinzu oder bis die entsprechende Dichte erreicht ist. Und lagern Sie den Zellkulturkolben horizontal, um eine Verstopfung der Nematoden zu vermeiden. Wiederholen Sie den Transfer von infektiösen Jungtieren in Zellkulturflaschen und die Zugabe von Wasser, bis die infektiösen Jungtiere in etwa drei bis fünf Tagen nicht mehr aus den Insektenkadavern austreten.

Kratzen Sie mit einer Impfschleife mehrere Flocken einer gefrorenen Kultur von Photorhabdus temperata Ret16 auf eine MacConkey-Platte und streifen Sie sie für einzelne Kolonien. Brüten Sie die Platte für zwei bis drei Tage bei 28 Grad Celsius aus. Nach der Inkubation 10 Milliliter LB-Brühe mit einer Kolonie auf MacConkey-Agar in einer 50-Milliliter-Tube impfen und die Kultur über Nacht bei 28 Grad Celsius in einem Schüttelinkubator inkubieren.

Nach der Inkubation 100 Mikroliter Übernachtkultur aus einem 50-Milliliter-Röhrchen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen und dann 100 die Nachtkultur mit 900 Mikrolitern PBS in Einzelstärke PBS durch Zentrifusion in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen bei 17.900 mal g waschen. Dekantieren Sie den Überstand. Als nächstes verdünnen Sie die Kultur 10 Mal in PBS mit einfacher Stärke und lassen Sie die Röhre auf Eis.

Tauchen Sie nun die Wachswürmer in eine 70% ige Ethanollösung. Nachdem Sie die Insekten mit einem Papiertuch getrocknet haben, legen Sie sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie die Tube für 20 Minuten auf Eis, um die Wachswürmer zu immobilisieren.

Verwenden Sie Filterpapier, um die oberen und unteren Hälften einer Petrischale abzudecken. Verwenden Sie den mit Filterpapier überzogenen Petrischalendeckel als Basisstütze für die Injektion. Befeuchten Sie das Filterpapier der unteren Petrischale und geben Sie es auf Eis, um den injizierten Wachswürmern zu helfen, sich zu erholen.

Pipettieren Sie 50 Mikroliter eiskalte Bakterien auf ein Stück Parafilm, bereiten Sie dann eine 22-Gauge-Refiner-Nadelspritze vor und drücken Sie den Kolben vorsichtig, um die Luft an der Spitze der Nadel zu entfernen. Halten Sie einen Wachswurm nahe am hinteren Ende unter dem Stereoskop. Injizieren Sie Bakterienkultur in die dorsale Seite des Thorax.

Vorzugsweise an der Verbindung zwischen zwei Segmenten direkt unter der Kutikula parallel zum Wachswurm, um innere Schäden zu minimieren und darauf zu achten, wie sich der Larvenkörper auszubeulen beginnt. Als nächstes die injizierten Insekten in die Wiederherstellungs-Petrischale geben. Und sobald alle Insekten injiziert und in die Erholungsschale gelegt wurden, stellen Sie die Petrischale ins Dunkel.

Wachswürmer erliegen zwei Tage nach der Injektion und erscheinen nach etwa drei bis vier Tagen ziegelrot. Braun gefärbte Insekten weisen jedoch auf eine erfolglose bakterielle Infektion hin. Übertragen Sie die Insekten mit der charakteristischen ziegelroten Farbe sieben Tage nach der Infektion auf eine mit frischem Filterpapier ausgekleidete Petrischale und wiederholen Sie die Produktion symbiotischer Nematoden-infektiöser Jungtiere.

Um mit der Oberflächensterilisation zu beginnen, sammeln Sie ausreichend symbiotische, Heterorhabditis-Bakteriophora und Kandidaten axenischer infektiöser Jungtiere durch Zentrifugation. Um ein Pellet in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen herzustellen, fügen Sie dem Pellet in jedem Mikrozentrifugenröhrchen 500 Mikroliter 5% Bleichmittel hinzu und invertieren Sie das Röhrchen. Nach 10 Minuten Inkubation eine Minute lang mit 17.900 mal g zentrifugieren und den Überstand entfernen.

Dann waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter sterilem Wasser. Zentrifugieren Sie es, entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie diesen Vorgang vier weitere Male. Die Grafik zeigt die Ergebnisse der Beurteilung des Status von Heterorhabditis bakteriophora Nematoden, die eine Axenisierung durchlaufen haben.

Heterorhabditis bakteriophora aus der Stammkultur trug symbiotische Photorhabdus luminescens Zellen. Nematoden, die keine assoziierten Photorhabdus luminescens-Bakterien enthielten, waren jedoch axenisch. Um die Reproduzierbarkeit Ihres Experiments zu erhalten, streifen Sie immer frisch aus der bakteriellen Stammkultur einer frischen Kolonie und nehmen Sie die Nachtkultur heraus, bevor sie das stationäre Gesicht erreicht.

Verwenden Sie nur den ziegelroten Galleria-Wachswurm für Whites Wasserfalle und werfen Sie den Rest weg. Nach diesem Eingriff können die Nematoden verwendet werden, um die Interaktion mit dem Immunsystem von Insekten zu untersuchen. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, die molekularen Grundlagen des Nematodenparasitismus und der Anti-Nematoden-Immunität des Wirts zu erforschen.