Name: Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Lernen Sie die Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur der Maus. Diese Methode ermöglicht effizienten Gentransfer ohne Beeinträchtigung der Muskelkontraktilität und eignet sich für Studien zur Genexpression.

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Alle Tierversuche wurden am Penn State College of Medicine durchgeführt, vom Institutional Animal Care and Use Committee der Penn State University genehmigt und in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, die in der Deklaration von Helsinki von 1964 und ihren späteren Änderungen festgelegt wurden. Für dieses Verfahren wurden 12 Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse verwendet. Alle chirurgischen Werkzeuge wurden vor dem Experimentieren auf Sterilität autoklaviert.
1. TA- und EDL-Injektions-/Elektroporationsvorbereitung
HINWEIS: Diese Schritte sind für die TA- und EDL-Injektions- / Elektroporationsvorbereitung identisch.
<ol><li>Reinigen Sie Expressionsplasmidkonstrukte auf eine Konzentration von 1 μg / μL, die vor dem Experiment in sterilem PBS verdünnt werden. Für dieses Verfahren wurde ein handelsübliches endotoxinfreies Reinigungskit verwendet, um den leeren Vektor von pcDNA3-EGFP (GFP) oder pcDNA3 (Kontrolle) zu reinigen.</li>
	<li>Berechnen Sie die Plasmidkonzentration, um ein ausreichendes Injektionsvolumen (TA 50 μg DNA in 50 μL sterilem PBS; EDL 10 μg DNA in 10 μL sterilen PBS) und aliquot Proben.</li>
	<li>Programmieren Sie die Elektroporatoreinstellungen, indem Sie das Auswahlrad verwenden und das Rad drücken, um die Parameter wie folgt auszuwählen: Modus - LV, Spannung - 12,5 V/mm (zum Zeitpunkt der Einspritzung einzustellen), Pulslänge - 20 ms, Anzahl der Impulse - 5, Intervall - 200 ms, Polarität - unipolar.</li>
	<li>Anästhesieren Sie die Mäuse mit Isoflurangas. Legen Sie die Mäuse in eine Induktionsbox mit 5% Isofluran. Bestätigen Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie durch das Fehlen des Zehenquetschreflexes mit einer Pinzette und reduzieren Sie Isofluran auf 2% Erhaltungsdosis. Bringen Sie die Mäuse für den Rest des Verfahrens zu einem geeigneten Nasenkonus, der auf einer zirkulierenden Wasserplatte bei 37 ° C ruht.</li>
	<li>Entfernen Sie Haare von beiden Hinterbeinen mit kleinen Haarschneidemaschinen. Schrubben Sie die unteren Gliedmaßen mit abwechselnd 70% Ethanol / Betadin, um den Injektionsbereich zu desinfizieren.</li>
</ol>2. TA-Injektion/Elektroporation
<ol><li>Wenn sich die Maus in Rückenlage befindet, lokalisieren Sie die TA-Sehne, die durch die Haut auf der seitlichen Seite des Unterschenkels sichtbar ist. Mit einer 50 μL Mikrospritze mit einer abnehmbaren 30 G Nadel führen Sie die Nadel 1-2 mm höher als die myotendinöse Verbindung in einem flachen 5°-Winkel ein, bis die Nadel das obere Ende des Muskels erreicht. HINWEIS: Die Injektion in die Mitte des Muskels ist das Ziel.</li>
	<li>Drücken Sie langsam den Kolben, während Sie die Nadel langsam entlang des Injektionspfades zurückziehen, um 50 μL Plasmidlösung zu liefern. Der Muskel sollte anschwellen.</li>
	<li>Stellen Sie den Timer auf 1 min und messen Sie die Dicke des Beines am TA. Je nach Größe der Maus kann dies zwischen 5-10 mm liegen. Stellen Sie die Bremssattelelektroden auf die gemessene Dicke ein und stellen Sie die Elektroporatorspannung auf 12,5 V/mm ein.</li>
	<li>Legen Sie nach 1 min die Bremssattelelektroden um die untere Extremität. Die Elektroden sollten eng anliegen, aber nicht zu dicht sein. Liefern Sie 5 Rechteckwellenimpulse mit 20 ms Dauer und 200 ms Intervallen (der Muskel sollte bei jedem Puls zucken).</li>
	<li>Wiederholen Sie dies mit dem alternativen Glied unter Verwendung des Kontrollvektors.</li>
	<li>Entfernen Sie die Maus aus der Narkose und lassen Sie sie sich auf einem auf 37 ° C eingestellten Heizkissen erholen. Nach der Wiederherstellung bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück.</li>
</ol>3. EDL-Injektion / Elektroporation
<ol><li>Mit der Maus in Rückenlage lokalisieren Sie den vorderen Kamm des Tibiaknochens visuell und durch sanfte Palpation.<ol>
<li>Machen Sie mit einem Skalpell einen flachen Schnitt durch die Haut auf der lateralen Seite des Tibia-Vorderkamms, der dem Knie um 5 mm unterlegen ist, um 2 mm über der TA-myotendinösen Verbindung zu sein.</li>
		<li>Mit einer kleinen Schere die Faszie stumpf sezieren und den TA-Muskel freilegen.</li>
		<li>Trennen Sie den TA-Muskel vorsichtig von der Tibia, indem Sie den Muskel seitlich ziehen und die EDL freilegen. Kleine, gekrümmte Pinzetten können verwendet werden, um die TA während des Eingriffs von der EDL fernzuhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die Nadel mit einer 50-μL-Mikrospritze mit einer abnehmbaren 30-G-Nadel in Längsrichtung in die EDL ein, bis die Nadel das obere Ende des Muskels erreicht.</li>
	<li>Drücken Sie langsam den Kolben, während Sie die Nadel langsam entlang des Injektionspfades zurückziehen, um 10 μL der Plasmidlösung zu injizieren (der Muskel sollte anschwellen).</li>
	<li>Stellen Sie einen Timer für 1 min ein und messen Sie die Dicke des Beines am EDL. Je nach Größe der Maus kann dies zwischen 5-10 mm liegen. Stellen Sie die Bremssattelelektroden auf die gemessene Dicke ein und stellen Sie die Elektroporatorspannung auf 12,5 V/mm ein.</li>
	<li>Legen Sie nach 1 min die Bremssattelelektroden um die untere Extremität. Die Elektroden sollten eng anliegen, aber nicht zu dicht sein. Liefern Sie 5 Rechteckwellenimpulse mit 20 ms Dauer und 200 ms Intervallen (der Muskel sollte mit jedem Puls zucken).</li>
	<li>Schließen Sie den Einschnitt mit Einweg-4/0-nicht resorbierbaren Nylonnähten.</li>
	<li>Wiederholen Sie dies mit dem alternativen Glied oder lassen Sie das Glied als absolute Kontrolle unberührt.</li>
	<li>Entfernen Sie die Maus aus der Narkose und lassen Sie sie sich auf einem auf 37 ° C eingestellten Heizkissen erholen. Verabreichen Sie ein geeignetes subkutanes Analgetikum unmittelbar nach der Operation und 12-24 h nach der Operation. Nach der Wiederherstellung bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück. HINWEIS: Frühere Studien haben ein Muskelkontraktilitätsdefizit in der TA unmittelbar nach der Elektroporation gezeigt und dass die kontraktile Erholung im Laufe von 3 Tagenauftritt 13,15. Aus diesem Grund wird die Analyse der TA- und EDL-Muskeln auf Histologie, Proteinexpression oder Muskelkontraktilität 3-10 Tage nach der Elektroporation durchgeführt. Eine verlängerte Expression von EGFP wurde bis zu 3 Wochen nach dem Verfahrenbeobachtet 13.</li>
</ol>

<ol><li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li>
<li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li>
<li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp27+inhibits+IKK%CE%B2-induced+NF-%CE%BAB+activity+and+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li>
<li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Regulatory%2C+Integregrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li>
<li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li>
<li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li>
<li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li>
<li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle%3A+studies+on+isolated+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li>
<li>Fewell, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+the+treatment+of+hemophilia+B+using+PINC-formulated+plasmid+delivered+to+muscle+with+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.</a> Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).</li>
<li>Wolff, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+gene+transfer+into+mouse+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.</a> Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).</li>
<li>Aihara, H., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+muscle+by+electroporation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).</li>
<li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li>
<li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li>
<li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle%22%5BJournal%5D)">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li>
<li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li>
<li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li>
<li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li>
<li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li>
<li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li>
<li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li>
<li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bonekey+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732(2015).</li>
<li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li>
<li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li>
<li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li>
<li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+efficacy%2C+longevity%2C+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li>
</ol>

B.A.H. und D.L.W machen keine Interessenkonflikte geltend.

Der In-vivo-Gentransfer in der Skelettmuskulatur, der durch Elektroporation verstärkt wird, ist ein nützliches und relativ einfaches Werkzeug zur Modulation der Proteinexpression im Muskel. Wir haben die Schritte gezeigt, die erforderlich sind, um einen effizienten Gentransfer in den EDL- und TA-Muskeln zu erreichen, und gezeigt, dass die Kontraktilitätsmessung der EDL nach dem Verfahren praktikabel ist. Diese Technik erfordert keine komplizierteren viralen Vektoren und ermöglicht den Vergleich von transfizierte...

Die Plasmid-DNA-Elektroporation in die Skelettmuskulatur in vivo ist ein wichtiges Instrument zur Beurteilung von Veränderungen in der Skelettmuskelphysiologie und molekularen Signalgebung durch Modulation der Genexpression unter einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Der experimentelle Gentransfer in die Skelettmuskulatur wurde bereits 1990 von Wolff et al. demonstriert, wobei sowohl RNA als auch DNA erfolgreich ohne Elektroporation übertragen wurden und die Luciferase-Expression für mindestens 2 Monateaufrechterhalten wurde 10. Die relativ geringe Transfektionseffizienz nur bei Injektion ist problematisch, und Aihara und Miyazaki zeigten1998 einen erhöhten Gentransfer mit Elektroporation, indem sie ein pCAGGS-IL-5-Konstrukt in den Tabialis anterior (TA) -Muskel elektropolierten und die IL-5-Expression 11 des Serums maßen. Seitdem haben viele Studien die Wirksamkeit verschiedener DNA-Konzentrationen, -Volumina und -Elektroporationsparameter untersucht, um eine maximale Gentransfereffizienz zu gewährleisten. Mir et al. testeten verschiedene Elektroporationsparameter, einschließlich Spannung, Pulszahl, Pulsdauer und -frequenz sowie DNA-Konzentration, und stellten fest, dass eine höhere Spannung, Pulszahl und DNA-Konzentration zu einer erhöhten Elektroporationseffizienz beitrugen12. Ein Hauptvorbehalt gegen eine hohe Elektroporationsspannung besteht darin, dass sie zwar eine erhöhte DNA-Aufnahme in Myofasern erleichtert, aber auch Muskelschäden verursacht, die die Ergebnisse beeinträchtigen können. Schertzer et al. zeigten, dass die Elektroporation bei 200 V in etwa 50% der Myofasern 3 Tage nach der Elektroporation Schäden verursachte, während nur 10% der Myofasern bei 50 V13 beschädigt wurden. Wir haben die Variablen berücksichtigt, die den effizienten DNA-Transfer im Vergleich zu Muskelschäden beeinflussen, und festgestellt, dass eine Spannung von 125 V pro Zentimeter Bremssattelbreite ausreicht, um einen effektiven Gentransfer zu erreichen.
Die Analyse der Muskelfaserquerschnittsfläche und der gesamten Muskelkontraktilität nach der Elektroporation sind wichtige Aspekte der Methode zur Messung von Veränderungen der Muskelgröße und -funktion aufgrund der Genmodulation. Wir und andere haben bereits gezeigt, dass die Elektroporation von Kontrollvektoren allein keine Abnahme der Myofaserfläche verursacht. Das Konstrukt des grün fluoreszierenden Proteins (EGFP) war in diesen Studien ein nützlicher fluoreszierender Indikator für die DNA-Transfektion13,14. Eine Reihe von Studien haben die In-situ-Kontraktilität der TA nach der Elektroporation untersucht und unterschiedliche Ergebnisse gefunden. Eine Studie zeigte, dass die 75 V / cm-Elektroporation 3 Tage nach der Elektroporation eine Verringerung der Tetankraft um etwa 30% verursachte, und 7 Tage nach der Elektroporation war die tetanische Kraft wieder auf dem Kontrollniveau, während die 50 V / cm-Elektroporation die Kraft13,15 nicht beeinträchtigte. Eine andere Studie zeigte, dass es einen 30% igen Verlust der Tetankraft 3 h nach 180 V / cm Elektroporation gab, die sich nach 7 Tagen16 auf die Scheinkraftniveaus erholte.
Im folgenden detaillierten Verfahren demonstrieren wir die Injektion und Elektroporation eines pcDNA3-EGFP-Plasmids in den TA- und Extensor digitorum longus (EDL) Muskeln von Mäusen. Wir zeigen auch, dass diese Methode die EDL-Kontraktilität des gesamten Muskels nicht beeinflusst. Ziel ist es, eine effiziente Plasmidaufnahme in Myofasern zu demonstrieren, ohne einen Funktionsverlust zu verursachen.

<table><tbody><tr><td>4-0 Nylon-Naht (nicht resorbierbar)</td><td>Ethicon</td><td>662G</td><td>Naht zum Schließen des Hautschnitts</td></tr><tr><td>50&micro; l Hamilton Spritze</td><td>Hamilton</td><td>80501</td><td>Mikrospritze</td></tr><tr><td>C57BLl/6NHsd Mäuse</td><td>Envigo</td><td>044</td><td>12 Wochen alte weibliche Mäuse für Experimente</td></tr><tr><td>Messschieberelektrode</td><td>BTX</td><td>45-0102</td><td>1,0 cm x 1,0 cm Edelstahl</td></tr><tr><td>Dynamische Muskelkontrolle Datenerfassung/-analyse</td><td>Aurora Scientific</td><td>605A</td><td>Software zur Messung und Analyse der Muskelkontraktilität</td></tr><tr><td>ECM 830 Elektroporationssystem</td><td>BTX</td><td>45-0662</td><td>Elektroporator</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Plasmid-Aufreinigungsset</td></tr><tr><td>Extra schmale Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>Schere für stumpfe Dissektion</td></tr><tr><td>Kraftaufnehmer</td><td>Aurora Scientific</td><td>407A</td><td>Zur Messung der Kraft von</td></tr><tr><td>EDL Micro-Masquito Hämastaten</td><td>Fine Science Tools</td><td>13010-12</td><td>Hämastate zum Surturing von</td></tr><tr><td>pcDNA3.1 Säugetier-Expressionsvektor</td><td>Fisher Scientific</td><td>V79020</td><td>Kontrollvektor</td></tr><tr><td>pcDNA3-EGFP-Expressionsplasmid</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td>Plasmid für die GFP-Expression</td></tr><tr><td>Semken gebogene Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11009-13</td><td>Pinzette für die</td></tr><tr><td>Chirurgie Chirurgische Klingen Edelstahl Nr. 10</td><td>Becton Dickinson</td><td>37 1210</td><td>Skalpellklingen</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Medien</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Gefriermedien für die Histologie</td></tr><tr><td>Weizenkeime Agglutinin - Texas Red</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>W21405</td><td>Membranfärbung für Muskelquerschnitt</td></tr></tbody></table>

elektroporation von plasmid-dna in die skelettmuskulatur der maus

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Die transiente Genexpressionsmodulation in der murinen Skelettmuskulatur durch Plasmidelektroporation ist ein nützliches Werkzeug zur Beurteilung der normalen und pathologischen Physiologie. Die Überexpression oder der Knockdown von Zielgenen ermöglicht es den Forschern, einzelne molekulare Ereignisse zu manipulieren und so die Mechanismen, die sich auf die Muskelmasse, den Muskelstoffwechsel und die Kontraktilität auswirken, besser zu verstehen. Darüber hinaus ermöglicht die Elektroporation von DNA-Plasmiden, die für fluoreszierende Tags kodieren, den Forschern, Veränderungen in der subzellulären Lokalisation von Proteinen in der Skelettmuskulatur in vivo zu messen. Eine wichtige funktionelle Beurteilung der Skelettmuskulatur umfasst die Messung der Muskelkontraktilität. In diesem Protokoll zeigen wir, dass nach Plasmid-DNA-Injektion, Elektroporation und Genexpressionsmodulation noch Studien zur Kontraktilität des gesamten Muskels möglich sind. Das Ziel dieses Lehrverfahrens ist es, die Schritt-für-Schritt-Methode der DNA-Plasmid-Elektroporation in die Skelettmuskulatur der Maus zu demonstrieren, um die Aufnahme und Expression in den Myofasern der Musculus tibialis anterior und extensor digitorum longus zu erleichtern und zu zeigen, dass die Kontraktilität der Skelettmuskulatur nicht durch Injektion und Elektroporation beeinträchtigt wird.

Elektroporation zur Erleichterung des Gentransfers in der Skelettmuskulatur ist eine nützliche Technik, um Veränderungen in der Muskelphysiologie zu bewerten. Wir haben ein detailliertes, schrittweises Verfahren demonstriert, um einen effizienten Gentransfer sowohl in den TA- als auch in den EDL-Muskeln zu erreichen. Unterschiede in der Transfektionseffizienz treten aufgrund einer Reihe von Variablen auf. Zu diesen Variablen gehören Elektroporationsparameter (Impulse, Spannung, Pulsdauer usw.), die Größe des Genkonstrukt...

Die Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur ist eine praktikable Methode, um die Genexpression zu modulieren, ohne die Muskelkontraktilität bei Mäusen zu beeinträchtigen.

Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur der Maus

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Der elektroporationsvermittelte Gentransfer im Muskel ist eine einfache und effiziente Technik, um Veränderungen in der Muskelphysiologie zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass die Elektroporation die Muskelkontraktilität nicht beeinträchtigt. Die Elektroporation von Genkonstrukten in Muskeln in vivo ist ein einfaches und effizientes Verfahren, das keine umfangreichere Verpackung von Genkonstrukten in virale Vektoren erfordert.Es ist schwierig, die EDL aufgrund ihrer Lage und geringen Größe zu visualisieren, zu isolieren und zu injizieren. Das Üben auf einem Mauskadaver und das Einspritzen von biologischer Tinte wie Indentinte kann dazu beitragen, den Nachweis einer ausreichenden Injektion zu erbringen. Das Verfahren wird von Brian Hain, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, demonstriert.Bevor Sie die Maus injizieren, bestätigen Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie mit einer Pinzette ohne den Zehenquetschreflex und übertragen Sie die Maus dann für den Rest des Eingriffs auf einen Nasenkegel, der auf einer zirkulierenden Wasserplatte bei 37 Grad Celsius ruht. Sobald die Maus in Rückenlage ist, entfernen Sie die Haare von beiden Hinterbeinen mit kleinen Haarschneidemaschinen

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben detaillierte Verfahren für die effiziente Transfektion von Plasmid-DNA in die Fasern der Fußmuskulatur von lebenden Mäusen mittels Elektroporation und der nachfolgenden Darstellung der Proteinexpression mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie.

DNA Transfektion von Säuger Skelettmuskulatur mit In Vivo Elektroporation

Dieses Video zeigt die Abgabe von Plasmid-DNA in zerebelläre neuronale Zellen von Mausembryonen mittels in utero-Elektroporation. Diese Methode ist nützlich, um die in vivo Funktion von Genen bei der normalen Gehirnentwicklung und die Veränderungen in der Genexpression von Neuronenzellen während der Tumorprogression zu verstehen.

In utero Elektroporation basierte Genabgabe: Eine Technik zur Injektion von Plasmid-DNA in embryonale Kleinhirnzellen von Mausembryonen

Induzierte pluripotente Stammzell (iPSC)-abgeleitete myogene Vorläufer sind vielversprechende Kandidaten für Zelltherapiestrategien zur Behandlung von Muskeldystrophien. Dieses Protokoll beschreibt Transplantations- und Funktionsmessungen, die erforderlich sind, um die Engraftmentierung und Differenzierung von iPSC-abgeleiteten Mesoangioblasten (eine Art von Muskelvorläufern) in Mausmodellen der akuten und chronischen Muskelregeneration zu bewerten.

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Die Pia-Oberfläche ist eine einzigartige Vorläuferzone im ZNS, die Aufnahme wird immer mehr Aufmerksamkeit. Hier erläutern wir ein Verfahren für schnelle genetische Manipulation dieser Vorläuferzone unter Verwendung einer modifizierten Methode der Elektroporation. Dieses Verfahren kann für zelluläre und molekulare Untersuchungen der Zelllinien und Signalwegen in der Zelldifferenzierung beteiligt sind, verwendet werden, um das Schicksal und die Eigenschaften von Tochterzellen zu erklären.

Neonatal Pial Oberflächen Elektroporation

Dieser Artikel beschreibt die Mikroinjektion und Elektroporation von Maus Hoden in vivo als Transfektionstechnik für Hodenzellen der Maus, um einzigartige Prozesse der Spermatogenese zu untersuchen. Das vorgestellte Protokoll beinhaltet Schritte Glaskapillare Vorbereitung, die Mikroinjektion über den Ausführungsgang und Transfektion durch Elektroporation.

In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation von Maus-Hoden

Dieses Protokoll verwendet Elektroporation, um fluoreszenzmarkierte Proteine in Muskelfasern von Mäusen einzuführen und zu exprimieren. Nach der Wiederherstellung nach der Elektroporation werden die Fasern isoliert. Einzelne Fasern werden dann mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie abgebildet, um die Muskelstruktur sichtbar zu machen.

DNA Elektroporation, Isolierung und Imaging von Muskelfasern

Wir beschreiben eine neue Methode für die Lieferung von Plasmid DNA in die important-Zellen der Maus Blase in Vivo durch Katheterisierung der Harnröhre und Elektroporation. Freuen Sie sich auf eine schnelle und bequeme Möglichkeit zur Erzeugung von autochthonen Mausmodelle der Blase Krankheiten.

Neuartige Methode der Transport der Plasmid-DNA zu Maus Blase Urothel durch Elektroporation

Die funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie ist eine Methode zur Untersuchung von Proteindomänenbewegungen in Echtzeit. Die Modifikation dieser Technik für ihre Anwendung in nativen Zellen ermöglicht nun die Detektion und Verfolgung einzelner Spannungssensorbewegungen von spannungsabhängigen Ca2+ -Kanälen in murinen isolierten Skelettmuskelfasern.

Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das in vivo Elektroporation und Denervierung des kranialen Musculus levator auris longus (LAL) kombiniert. Dieses Verfahren ermöglicht es, die mögliche Rolle von Muskelproteinen bei der Regeneration der neuromuskulären Synapse zu untersuchen.

Kombinierte In vivo Elektroporation und kurzfristige Reinnervation des kranialen Levator Auris Longus Skelettmuskel

Hier stellen wir einen gentherapeutischen Ansatz vor, bei dem ABE-beschichtetes Chitosan durch intraossäre Injektion direkt ins Knochenmark abgegeben wird.

Verbesserte Genverabreichung und -expression durch intraossäre Injektion von Chitosan-Nanopartikeln, verkapselten Adenin-Base-Editor-Plasmiden

Lernen Sie die Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur der Maus. Diese Methode ermöglicht effizienten Gentransfer ohne Beeinträchtigung der Muskelkontraktilität und eignet sich für Studien zur Genexpression.

Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur der Maus

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